Защитният ефект на ехинакозида върху диабетна нефропатия

За контакт: Одри Хуaudrey.hu@wecistanche.com

Защитни ефекти на ехинакозида върху бъбречната функция, бъбречната тъкан и увреждането на мезангиалните клетки при плъхове с диабетна нефропатия

HE Qin, LIU Fan, WANG Hongli, LI Jianping, DUAN Jun

Резюме:

Цел Да се ​​изследва защитният ефект наехинакозид(ECH) върху бъбречна дисфункция, хистопатология и увреждане на мезангиалните клетки вдиабетикнефропатия(DN) плъхове и неговия механизъм. Методи Шестдесет SD плъха бяха разделени на случаен принцип в контролна група, моделна група, ECH (ехинакозид) група (високи, средни и ниски дози ECH (ехинакозид),100, 50, 20 mg·kg'·d') и група с лосартан калий (лосартан калий, 16 mg·kg'·d'), 10 плъха във всяка група. Моделната група, ECH (ехинакозид) и групата с лосартан калий бяха хранени с диета с високо съдържание на мазнини и захар и интраперитонеално инжектиран стрептозотоцин (40 mg·kg"'), за да се установят DN модели на плъхове. След 2 седмици лечение телесното тегло, 24-часовият прием на вода и обемът на урината на плъховете бяха записани Съдържанието на кръвна глюкоза на гладно, серумен креатинин, уреен азот, микропротеин в урината, хиалуронова киселина (НА), тъканен металопротеиназен инхибитор-1(TIMP-1) и ламинин (LN) бяха определени. HE оцветяване и TUNEL оцветяване беше извършено за наблюдение на патологични промени в бъбречната тъкан. RT-PCR беше извършено за откриване на експресия на В-клетъчен лимфом (Bcl-2), Bcl2-свързан X протеин (Bax), Caspase-3 mRNA. Wester Blot беше извършен за определяне на нивата на експресия на васкуларна клетъчна адхезионна молекула-1(VCAM-1), Трансформиращ растежен фактор (TGF-), - Актин на гладката мускулатура (-SMA). Резултати В сравнение с контролната група, телесното тегло на моделната група е значително намалено (P< 0.05),="" water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly="" increased=""><0.05). bax,="" caspase-3="" mrna,="" and="" expression="" of="" vcam-1,="" tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05),="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="">< 0.05).="" compared="" with="" the="" model="" group,="" bodyweight="" of="" rats="" was="" significantly="" increased="" in="" the="" medium-dose="" ech="">ехинакозид) група, висока доза ECH (ехинакозид) група и групата на лосартан калий (P<0.05), water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly=""><0.05).bax,caspase-3 mrna,="" expression="" of="" vcam-1,tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05);="" and="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly=""><0.05).he and="" tunel="" staining="" showed="" that="" pathological="" changes="" in="" renal="" tissue="" were="" significantly="" decreased.="" conclusion="" medium="" and="" high="" doses="" of="" ech="">ехинакозид) може да защити увреждането на бъбречната тъкан и да подобри бъбречната функция при DN плъхове чрез инхибиране на протеиновата експресия на TGF- и VCAM-1 и инхибиране на бъбречната интерстициална фиброза и апоптозата на бъбречните клетки.

Ключови думи:Cistanches herba;Ехинакозид; диабетикнефропатия; бъбречна интерстициална фиброза; апоптоза; плъхове

Cistanche Echinacoside лекува диабетна нефропатия

Въведение

диабетик нефропатия(Диабетна нефропатия, DN) е често срещано явлениедиабетикмикроваскуларно усложнение, което може не само да причини увреждане на бъбреците, но и да засегне други органи. Клиничната патологична характеристика на бъбречната тубулоинтерстициална фиброза е сложната патогенеза надиабетикнефропатия. Предишни проучвания [P2-5 смятат, че заболяването се дължи главно на хипергликемия вдиабетикпациенти, което причинява бъбречни хемодинамични промени и абнормен метаболизъм. Клиничните прояви са предимно протеинурия и намалена скорост на гломерулна филтрация. В момента,диабетикнефропатияПациентите все още нямат ефективни клинични методи за лечение и намирането на нови ефективни лекарства е ключът към лечението надиабетикнефропатия.

ехинакозид(ECH) е един от екстрактите на Cistanche Tubulosa. Той има ефект на ободряване на бъбреците и укрепване на ян." Съвременните фармакологични изследвания показват, че ехинакозидът има антиоксидантно, антиапоптотично, противовъзпалително и подобрява кръвния поток. Микроциркулацията и други фармакологични ефекти могат също да регулират метаболизма на глюкозата в организма и да подобрят глюкозата През последните години проучванията показват, че ехинакозидът може да инхибира трансформационния растежен фактор (трансформиращ растежен фактор, TGF-) сигналния път и да инхибирадиабетикнефропатия. Интерстициалната фиброза на бъбреците на плъх предпазва бъбречната тъкан на плъх. В литературата обаче има малко съобщения за лечението надиабетикнефропатиясехинакозиди неговия специфичен механизъм за защитадиабетикнефропатияпри плъхове не е ясно. Следователно, това проучване допълнително изследва ефекта наехинакозидвърху бъбречната фиброза и апоптозата на бъбречните клеткидиабетикнефропатияплъхове и възможният му механизъм има за цел да осигури теоретична основа за клиничното приложение наехинакозид.

Полза от цистанче: лекува бъбречно заболяване и подобрява бъбречната функция

1 Материал и методи

1.1 Животни:

60 SD плъха, мъжки, клас SPF, на възраст 8 седмици, телесно тегло 240~280 g, предоставени от Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd., номер на лиценз за животни: SCXK (Пекин) 2015-0001, животинско качество е квалифициран номер на сертификата: 11400700106210, отгледан в лабораторията на центъра за животни на болницата, поддържайки стайната температура постоянна на 25 градуса, симулирайки деня и нощта, променяйки условията на осветление веднъж на всеки 12 часа и животните са свободни да ядат и пият .

1.2 Лекарства и реактиви:

Ехинакозид, Китайски институт за контрол на храните и лекарствата, партиден номер: 111670-201706; Лосартан калий, Hangzhou Merck Pharmaceutical Co., Ltd., Национален медицински стандарт: H20030654; Streptozotocin, American Sigma Company, партиден номер: 040103; Комплект за откриване на съдържание на протеин в урината, Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd., партиден номер: 20170612; Комплект за откриване TUNEL, Amicage Technology Co., Ltd., партиден номер: 20180406; Комплект за екстракция на РНК, комплект за обратна транскрипция, Shanghai Hengfei Bio-Technology Co., Ltd., партиден номер: 20180705, 20180904; Комплекти за откриване на серумна хиалуронова киселина (HA), тъканен металопротеиназен инхибитор -1 (TIMP-1) и ламинин (laminin, LN), Shanghai Yuanmu Biotechnology Co., Ltd., партидните номера са 20180612, 20180624, 20180706.

1.3 Апаратура

Автоматичен биохимичен анализатор тип 7600, Япония HITACHI; преносим глюкомер, Beijing Yicheng Bioelectronics Technology Co., Ltd.; Оптичен микроскоп B X60, Япония OLYMPUS; Анализатор за радиоимуноанализ SN-695B, компания Shanghai Rihuan Instrument Shenbei Co., Ltd.

1.4 Групиране, репликация на модел и метод на администриране

След една седмица на предварително хранене, 60 плъха бяха разделени на случаен принцип в контролната група, моделната група,ехинакозидгрупи с висока, средна и ниска доза и групата с лосартан калий, с 10 плъха във всяка група. Моделната група,ехинакозидгрупата и групата с лозартан калий бяха лекувани с диета с високо съдържание на мазнини и захар, комбинирана с ниска доза стрептозотоцин, за да предизвикатдиабетикнефропатияпри плъхове. Преди моделът да бъде репликиран, плъховете гладуват с вода в продължение на 12 часа. Плъховете в контролната група са хранени с обикновена храна, а останалите групи са хранени с храна с високо съдържание на мазнини и захар. След 4 седмици непрекъснато хранене, на плъховете в контролната група беше дадена единична интраперитонеална инжекция с равен обем цитратен буфер, а на останалите групи беше дадена единична интраперитонеална инжекция на стрептозотоцин бактериоцин (40 mg·kg'), за да се повтори плъх модел надиабетикнефропатия. 72 часа след като на плъховете е инжектиран стрептозотоцин, кръвната глюкоза е по-голяма или равна на 16,7 mmol·L, а скоростта на отделяне на протеин в урината за 24 часа след 3 седмици е по-висока от тази на контролната група. Количественият протеин в урината за 24 часа е бил по-голям от 50 процента преди репликацията на модела, което показва, че моделът е бил успешно репликиран. Четири седмици след инжектирането на стрептозотоцин, групите с ниска, средна и висока доза наехинакозидса дадени 20 mg·kg', 50 mg·kg и 100 mg·kg'ехинакозид(съгласно 5mL·kg при плъхове). kg"' телесно тегло се разтваря в 37-градусови нормални физиологични разтвори), плъхове в групата на Losartan potassium са интрагастрално прилагани с Losartan potassium 16 mg·kg', а моделната група и контролната група са интрагастрално прилагани с равни обеми нормален физиологичен разтвор, веднъж на ден Влагането със сонда продължи 2 седмици.

1.5 Събиране на проби

След последното приложение плъховете гладуват без храна и вода. 24-те часа пиене на вода на плъховете бяха записани и 24-те часа урина бяха събрани. Рано сутринта на втория ден плъховете бяха претеглени. След събиране на урина, интраперитонеално инжектиране на 2% разтвор на пентобарбитал натрий 2mL·kg~ за анестезия, отделяне на кръв от коремната аорта на плъхове, центрофугиране (3 500 r·min²', 15 минути), вземете серума и го поставете в хладилник- Временно съхраняване на 20 градуса; отделете тъкан от бъбрек на плъх и разделете на две части, едната част се фиксира в 4 процента параформалдехид, другата част се приготвя като 10 процента хомогенат и се поставя в -80 градуса хладилник за по-късна употреба.

1.6 Определяне на метаболизма на глюкоза и липиди при плъхове

Беше взет серум от всяка група плъхове, кръвната захар на гладно беше измерена с глюкомер и нивата на триглицеридите, холестерола и липопротеините с ниска плътност бяха открити от автоматичен биохимичен анализатор.

1.7 24 ч протеин в урината, бъбречна функция и индикатори, свързани с бъбречна фиброза

Беше събрана 24-часова урина на плъхове във всяка група и 24-часовото съдържание на микропротеини в урината беше определено чрез радиоимуноанализ. Операцията е извършена в строго съответствие с инструкциите. Серумът от всяка група плъхове беше събран и автоматичният биохимичен анализатор беше използван за откриване на нивата на кръвния креатинин и урейния азот, които са свързани с бъбречната функция, нивото на серумния TIMP-1 беше открито чрез ELISA, и нивата на НА и LN бяха открити чрез радиоимуноанализ. Операцията е извършена в строго съответствие с инструкциите.

1.8 HE оцветяване за наблюдение на патологичните промени на бъбречната тъкан и TNUEL оцветяване за наблюдение на апоптозата на клетките на бъбречната тъкан

Фиксираните бъбречни тъкани от всяка група бяха взети, рутинно поставени в парафин и разделени. Един участък се използва за HE оцветяване за наблюдение на морфологичните промени на бъбречните тубули, гломерули и бъбречен интерстициум под светлинен микроскоп; другият участък се използва за оцветяване с TUNEL, работейки съгласно инструкциите на комплекта и наблюдавайки броя и положителността на клетките на бъбречната тъкан под микроскоп. Броят на клетките се изчислява като съотношението на броя на положителните клетки към броя на бъбречната тъкан клетки, което е скоростта на апоптоза.

1.9 RT-PCR метод за откриване на експресията на свързани с апоптозата гени в бъбречните тъкани

Вземете хомогенат от бъбречна тъкан на плъх, извлечете общата РНК чрез метода Trizol, определете концентрацията чрез ултравиолетов спектрофотометър и синтезирайте cDNA с комплект за обратна транскрипция.

1.10 Western Blot метод за определяне на експресията на бъбречна тъкан VCAM-1, TGF- и -SMA протеин.

Вземете около 50 mg хомогенат от бъбречна тъкан на плъх, разтворете го с клетъчен лизат, съдържащ протеазни инхибитори, и извлечете общия протеин с клетъчен лизат, като използвате метода BCA за количествено определяне на протеина. Общата протеинова проба, екстрахирана с 50 μmol·L", се прехвърля върху нитроцелулозна мембрана чрез електрофореза с полиакриламиден гел и се запечатва с 5 процента обезмаслено мляко и се добавят съответно първичното антитяло (1∶1000) и -актин протеин. Антитяло (1: 300), инкубирайте една нощ при 4 градуса. Накрая добавете вторичното антитяло и инкубирайте 2 часа при 37 градуса, наблюдавано чрез електрохемилуминесценция. Използвайте софтуера за анализ на изображения на Photoshop, за да анализирате сивата стойност на протеиновите ленти.

1.11 Методи за статистическа обработка

Софтуерът SPSS 17.0 беше използван за анализ на получените данни и данните от измерванията, които отговарят на нормалното разпределение, се изразяват като средно ± стандартно отклонение ((x±s) и се използва еднофакторен анализ на дисперсията сравнете разликите между групите. Сравнението по двойки между групите използва SNK- С q тест, P<0.05 indicates="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

2 резултата

2.1 Ефектите на ехинакозид върху телесната маса, питейната вода и отделената урина на плъхове с диабетна нефропатия са показани в таблица 1.

Таблица 1 Ефекти на ECH върху телесното тегло, приема на вода и обема на урината при DN плъхове（x ± s,n=10）

В сравнение с контролната група, телесното тегло на плъховете от моделната група е значително намалено, а 24-часовото пиене на вода и отделената урина са значително увеличени. Разликата беше статистически значима (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" doses="" of="">ехинакозидТелесното тегло на плъховете в групата на лосартан калий се е увеличило значително, а 24-часовото пиене и отделянето на урина са намалели значително, като разликата е била статистически значима (P<>

2.2 Ефектите на ехинакозида върху глюкозния и липидния метаболизъм при плъхове с диабетна нефропатия са показани в таблица 2.

Таблица 2 Ефекти на ECH върху метаболизма на глюкозата и липидите при DN плъхове

Забележка:В сравнение с контролната група, P<0.05; compared="" with="" the="" model="" group,=""><>

В сравнение с контролната група, кръвната захар на гладно на плъховете от моделната група е значително повишена и разликата е статистически значима (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" increased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05) ). В сравнение с моделната група, кръвната захар на гладно на плъхове в групите със средна и висока дозаехинакозиди групата на лосартан калий е значително намалена и разликата е статистически значима (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" decreased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05).

2.3 Ефектите на ехинакозида върху 24-часовия протеин в урината и бъбречната функция на плъхове с диабетна нефропатия са показани в таблица 3.

В сравнение с контролната група, нивата на микроалбумин в урината, уреен азот и креатинин в моделната група бяха значително повишени и разликите бяха статистически значими (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" dose="">ехинакозидгрупи Нивата на микроалбумин в урината, уреен азот и креатинин на плъхове в групата с лозартан калий са значително намалени и разликите са статистически значими (P<>

Таблица 3 Ефекти на ехинакозид върху 24-часовия протеин в урината и бъбречната функция на плъхове с диабетна нефропатия (x±s, n=10)

2.4 Ефектите на ехинакозида върху бъбречната фиброза при плъхове с диабетна нефропатия са показани в таблица 4.

В сравнение с контролната група, серумните нива на HA, TIMP-1 и LN в моделната група бяха значително повишени и разликите бяха статистически значими (P<0.05); the="" levels="" of="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" of="" rats="" in="" the="" sartan="" potassium="" group="" were="" significantly="" reduced,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant=""><>

Таблица 4 Ефекти на ECH върху бъбречна фиброза при DN плъхове

2.5 Оцветяване с HE за наблюдение на патологичните промени на бъбречната тъкан при плъхове с диабетна нефропатия (виж Фигура 1).

HE оцветяването на плъхове в контролната група показва, че структурата на клетките на бъбречната тъкан е непокътната и не се наблюдават очевидни патологични промени. HE оцветяване на плъхове в моделната група и ниска дозаехинакозидгрупата показва: гломерулът е набъбнал и увеличен по размер, бъбречните тубулни епителни клетки са набъбнали или отпаднали, бъбречният интерстициум е придружен от възпалителна клетъчна инфилтрация и някои мезангиална хиперплазия и интерстициална пролиферация също са били видими. Качествена фиброза.Ехинакозидгрупи със средна и висока доза и групи с лосартан калий. Оцветяването показва, че патологичните промени на бъбречната тъкан са значително намалени, придружени от малко количество възпалителна клетъчна инфилтрация, а степента на мезангиална хиперплазия и интерстициална фиброза също е по-лека от тази на моделната група.

Фигура 1 Патологични промени в бъбречните тъкани на плъхове във всяка група

2.6 Ефектът на ехинакозида върху апоптозата на бъбречната тъкан при плъхове с диабетна нефропатия е показан на фигура 2.

Оцветяването с TUNEL показа, че в сравнение с контролната група, степента на апоптоза на плъхове в моделната група е значително увеличена и разликата е статистически значима (P＜0.05); в сравнение с моделната група, средните и високи дози наехинакозиди Corsa Скоростта на апоптоза при плъхове в групата с калий беше значително намалена и разликата беше статистически значима (P<>

Фигура 2 Апоптоза на клетки от бъбречна тъкан при DN плъхове

2.7 Ефектът на ехинакозида върху експресията на свързани с апоптозата гени в бъбречните тъкани на плъхове с диабетна нефропатия е показан в Таблица 6.

Резултатите от RT-PCR показват, че в сравнение с контролната група, експресията на Bax и Caspase-3 mRNA в моделната група е значително повишена, а експресията на Bcl-2 mRNA е значително намалена и разликата беше статистически значима (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group="" in="" comparison,="" the="" expression="" of="" bax="" and="" caspase-3="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="" in="" the="" middle="" and="" high-dose="">ехинакозидгрупите и групата на лосартан калий и експресията на Bcl-2 иРНК беше значително повишена, а разликите бяха статистически значими (P<>

Таблица 6 Ефекти на ECH върху експресията на свързания с апоптозата ген в бъбречната тъкан на DN плъхове

2.8 Ефектите отехинакозидвърху експресията на VCAM-1, TGF- и -SMA протеини вдиабетикнефропатияплъхове са показани на Фигура 3 и Таблица 7. В сравнение с контролната група, експресията на VCAM-1, TGF- и -SMA протеин в моделната група беше значително повишена и разликата беше статистически значима (P ＜0.05); Експресиите на VCAM-1, TGF- и -SMA протеини при плъхове в групата на дозата и групата на лосартан калий са значително понижени и разликите са статистически значими (P<>

НАТИСНЕТЕ ТУК ЗА ЧАСТ Ⅱ