Циклопентанонът упражнява антимеланогенезни и антибръчкови дейности при B16F10 меланома

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1,2, Yeo Jin Park 1,2, Sanggwon Lee 1,2, Dongwan Kang 1,2, Young Suk Jung 1,2, Hae Young Chung 1,2 и Hyung Ryong Moon 1, 2,*

Резюме:Излагането на ултравиолетова (UV) радиация е основната причина за външното стареене на кожата, което води до хиперпигментация на кожата и бръчки. В това проучване изследвахме избелващия ефект на (2E,5E)-2,5-бис(3-хидрокси-4-метоксибензилиден)циклопентанон (BHCP) върху B16F10 меланома и неговите анти- активност на бръчки върху Hs27 фибробластни клетки. Установено е, че BHCP мощно инхибира тирозиназата със стойности на концентрация на 50% инхибиране (IC50) от 1,10 μM и 8,18 μM формикофенолат (L-тирозин) и дифенолаза (L-DOPA), а изследването на ензимната кинетика разкрива, че BHCP е инхибитор на тирозиназа от конкурентен тип . Освен това, BHCP значително инхибира съдържанието на меланин и активността на клетъчната тирозиназа и понижава нивата на свързания с микрофталмия транскрипционен фактор (MITF), фосфорилираните нива на cAMP отговор елемент-свързващ протеин (CREB) и тирозиназата в -меланоцит-стимулиращия хормон (-MSH)-индуциран B16F10 меланомни клетки. Освен това, BHCP инхибира фосфорилирането на p65 и експресията на матрични металопротеинази (MMP-1, MMP-9, MMP-12 и MMP-13) във фибробласти Hs27 стимулирани с UV лъчение. Следователно нашите резултати показват, че BHCP може да бъде добър кандидат за разработването на терапевтични средства за заболявания, свързани с хиперпигментация и бръчки.

Ключови думи: (2E,5E)-2,5-Бис(3-хидрокси-4-метоксибензилиден)циклопентанон (BHCP); инхибитор на тирозиназа; анти-меланогенеза; против бръчки

Цистанче епротив бръчки.

1. Въведение

Стареенето на кожата е сложен и прогресивен процес, който води до функционални и естетични промени в кожата, като отговорни са както вътрешните, така и външните фактори [1]. Външното стареене на кожата се причинява от агресори на околната среда, като ултравиолетова (UV) радиация, стрес или тютюнопушене. Въпреки това, това се причинява главно от многократно излагане на UV от слънцето, което се нарича фотостареене. Фотостареенето на кожата се характеризира с груби и дълбоки бръчки, дебелина, грапавост, диспигментация и хистологични промени [2–4].

Тирозиназата (EC 1.14.18.1), която е известна също като полифенол оксидаза, е един от многофункционалните съдържащи мед ензими, участващи в синтеза на меланин и се среща широко в природата [5]. Тирозиназата обикновено присъства в повечето микроорганизми, растения, и животни. В растенията тирозиназата действа чрез окисляване на монофенолите в дифеноли (микофенолатна активност) и участва в окисляването на о-дифенолите в о-хинони (дифенолазна активност), последвано от окисляването на хиноните в тъмнокафяви пигменти [6].

Меланогенезата е трансформацията на L-тирозин в 3,4-дихидроксифенилаланин (L-DOPA), при което L-DOPA се превръща в DOPA хинин [7]. Следователно, тирозиназата играе важна роля в производството на меланин в меланоцитите и инхибирането на тирозиназата е привлекателна цел за подобряване на нарушенията, свързани с пигментацията, и за разработването на избелващи агенти [8,9]. Синтезът на меланин се индуцира от няколко стимула, като UV и химикали, включително изобутилметилксантин (IBMX) и алфа-меланоцит-стимулиращ хормон (-MSH). -MSH се свързва със своя рецептор меланокортин 1 рецептор (MC1R), като впоследствие повишава нивото на цитоплазмения цикличен AMP(cAMP). Повишеното ниво на cAMP активира протеин киназа А (PKA), която индуцира експресията на транскрипционен фактор, свързан с микрофталмия (MITF) чрез фосфорилиране на cAMP отговорен елемент-свързващ протеин (CREB). MITF индуцира експресията на тирозиназа, протеин, свързан с тирозиназа (TRP)-1 и TRP-2, което накрая води до повишен синтез на меланин [10]. MITF се счита за ключов транскрипционен фактор на меланогенезата; следователно са проведени много проучвания за контролиране на експресията на MITF за инхибиране на меланогенезата [11].

Известно е, че образуването на бръчки е тясно свързано с разграждането на извънклетъчния матрикс на кожата и UV радиацията активира ядрен фактор-κB (NF-κB), като по този начин увеличава производството на фрагментация на колаген и матрични металопротеинази (MMP) [2]. ММР са цинк-зависими ендопептидази, които са важни за ремоделирането на извънклетъчната матрична структура в кожата. Следователно, прекомерното разграждане на колагена и матрицата от UV-индуцирани MMPs е характерна черта на фотоувредената кожа и MMPs се използват като основен маркер за UV-индуцирано фотостареене, както и кожно възпаление [12].

Куркуминоподобните диарилхептаноидни скелетни производни включват антиоксиданти, докладвани противоракови дейности.скелета, включително (2E,5E)-2,5-бис(3-хидрокси-4-метоксибензилиден)циклопентанон (BHCP) (Фигура 1),да проявява широк спектър от противовъзпалителни, анти-меланогенеза, особено, Leow et al. [19], докладвани в биоактивности, и анти-тирозиназа [13–18]дибензилиден-циклопентанон 2014, които могат да допринесат за защитните ефекти върху човешкия остеосарком чрез регулиране на Wnt/-катенин сигналния път. Въпреки това, антимеланогенезата и ефектите против бръчки на BHCP остават да бъдат открити, а молекулярните механизми, лежащи в основата на неговата активност, все още не са ясно установени.

Фигура 1. Структура на (2E,5E)-бис(3-хидрокси-4-метоксибензилиден)циклопентанон (BHCP).

В настоящото проучване изследвахме антимеланогенезата и потенциала против бръчки на BHCP и се опитахме да идентифицираме участващия механизъм, особено по отношение на съдържанието на меланин и активността на клетъчната тирозиназа, които бяха изследвани с помощта на тест за инхибиране на тирозиназа и анализ на кинетиката на ензима. Освен това, ние демонстрирахме, че BHCP упражнява инхибиторен ефект върху меланогенезата и бръчките, което е свързано с понижаване на CREB/MITF/тирозиназа в -MSH-индуцирани B16F10 миши меланомни клетки и инхибиране на фосфорилирането на р65 и експресията на ММР в UV-индуцирани Hs27 човешки фибробласти.

драконови билки цистанче

2. Резултати и дискусия

2.1. Синтез на (2E,5E)-2,5-бис(3-хидрокси-4-метоксибензилиден)циклопентанон (BHCP)

Разтвор на {{0}}хидрокси-4-метоксибензалдехид (100 mg, 0.66 mmol, изованолин) и циклопентанон (0,03 mL, 0,33 mmol) в 1 N разтвор на НС1-оцетна киселина (0.02 mL) се разбърква при 25 °C в продължение на 2 часа. След престояване в продължение на 1 ден, реакционната смес се третира със студена вода в присъствието на малко количество метанол, филтрува се и се промива със студена вода, за да се получи BHCP (65,9 mg) с 56,9 процента добив. BHCP се идентифицира чрез спектроскопски методи, включително 1H и 13C-NMR, както и чрез сравнение с публикувани спектрални данни и анализ на тънкослойна хроматография (TLC) [19]. Структурата е показана на фигура 1.

BHCP: жълт аморфен прах (CHCl3); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5: 9,25 (s, 2Н, 2 × ОН), 7,28 (s, 2Н, 2 × винилов Н), 7,14 (d, 2Н , J=2.0 Hz, 2 × 2-H), 7.11 (dd, 2H, J=8.5, 2.0 Hz, 2×6- H), 7,01 (d, 2H, J=8.5 Hz, 2 × 5-H), 3,81 (s, 6H, 2 × OMe), 3,01 (s, 4H, 2 × CH2) ; 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 5: 195.5, 149.9, 147.2, 136.0, 133.1, 129.1, 124.3, 117.5, 112.8, 56.3, 26.6; ESI-MS: m/z 351 (М-Н)-.

2.2. Инхибиторен ефект на BHCP върху активността на гъбичната тирозиназа

Както е показано в таблица 1, BHCP инхибира тирозиназата със стойности на IC50 от 1,10 ± 0,12 μM и 8,18 ± 0,44 μM, докато коджиковата киселина (положителна контрола) има IC50 стойности от 18,68 ± 1,40 μM и 33,89 ± 1,16 μM съответно за монофенолаза и дифенолаза. В нашето предишно изследване на синтетични потенциални инхибитори на тирозиназа, ние открихме механизма чрез изследвания на молекулярно моделиране, чрез които 3-хидрокси и 4-метокси групите на бензилиден имат големи тенденции на свързване към активния сайт на тирозиназата [20]. От резултатите от това проучване беше показано, че неговите функционални групи (3-хидрокси и 4-метокси групи) са свързани със значително повишаване на инхибиторната активност на тирозиназата.

Таблица 1. Тирозиназна инхибиторна активност и ензимен кинетичен анализ на BHCP.

Освен това, механизмът, отговорен за инхибирането на тирозиназата от BHCP, беше изследван чрез ензимен кинетичен анализ в настоящото изследване (Таблица 1 и Фигура 2). Графиките на Lineweaver–Burk бяха начертани с помощта на данните, получени от кинетичните изследвания, а константата на инхибиране (Ki) беше получена от графиките на Dixon. Двойните реципрочни графики на Lineweaver–Burk показват инхибиране от конкурентен тип. Както е показано на Фигура 2a–c, BHCP действа като конкурентен инхибитор както на L-тирозин, така и на L-DOPA. Нещо повече, прекъсванията по оста x на графиките на Dixon са често използвани за определяне на видовете константи на ензимно инхибиране (Ki) за комплекс ензим-инхибитор [21,22], където стойността на оста x показва стойността на −Ki. Както е показано на фигура 2b-d, Ki стойностите на BHCP са 1,7 μM и 10,5 μM като субстрати за L-тирозин и L-DOPA, съответно. Тъй като стойността на Ki представлява концентрацията, необходима за образуване на комплекс ензим-инхибитор, по-ниска стойност на Ki предполага по-ефективно инхибиране срещу тирозиназа.

Фигура 2. Графики на Lineweaver-Burk (a,c) и Dixon (b,d) за инхибиране на ензима тирозиназа от BHCP.

2.3. Ефекти на BHCP върху клетъчната жизнеспособност на B16F10 меланома и Hs27 фибробластни клетки

Преди да определим дали BHCP упражнява някакви анти-меланогенезни и анти-бръчкови дейности, ние изследвахме цитотоксичността на BHCP към B16F10 клетки и Hs27 клетки чрез третиране с различни концентрации на BHCP за различни интервали от време и клетъчната жизнеспособност беше измерена с EZ-Cytox анализ. Както е показано на Фигура 3a, b, до 10 μM BHCP за 48 часа не намалява оцеляването нито на B16F10 клетките, нито на Hs27 клетките. Впоследствие бяха проведени по-нататъшни in vitro проучвания за анти-меланогенезата и против бръчките на BHCP с 1, 5 и 10 μM.

2.4. Инхибиране на BHCP срещу съдържанието на меланин и активността на клетъчната тирозиназа в B16F10 меланомни клетки

За да се определи дали BHCP проявява инхибиторен потенциал върху съдържанието на меланин в -MSH-индуцирани B16F10 клетки, клетките се третират предварително с посочените различни концентрации (1, 5 и 10 μM) на BHCP или коджикова киселина (5 mM) в продължение на 24 часа и след това се стимулират с -MSH за 48 часа. Както е показано на Фигура 4а, съдържанието на меланин в клетките, третирани с BHCP в присъствието на -MSH, намалява по зависим от концентрацията начин, показвайки 113 процента при 1 μM, 106 процента при 5 μM и 102 процента при 10 μM, в сравнение с контролна група, лекувана само с -MSH (186 процента). Интересното е, че BHCP (1 μM) инхибира съдържанието на меланин по-силно от коджиковата киселина (5 mM). Освен това беше извършен анализ на активността на клетъчната тирозиназа за измерване на инхибиторния ефект на BHCP върху B16F10 клетки. Както е показано на Фигура 4b, BHCP намалява в зависимост от концентрацията с активността на тирозиназата със 120 процента при 1 μM, 116 процента при 5 μM и 105 процента при 10 μM, в сравнение с контролната група, лекувана само с -MSH (181 процент). Инхибиторният ефект на BHCP е много по-мощен от този на коджиковата киселина; инхибирането на BHCP при 1 μM е по-добро от това на коджикова киселина при 5 mM (131 процента). Тези резултати предполагат, че BHCP има избелващ ефект чрез инхибиране на биосинтезата на меланин и вътреклетъчния синтез на тирозиназа в B16F10 меланоцити.

Фигура 4. Инхибиране на съдържанието на меланин (a) и активността на клетъчната тирозиназа (b) на BHCP върху B16F10меланомни клетки.

2.5. Ефекти на BHCP върху експресията на MITF/тирозиназа и фосфорилиран CREB в B16F10 клетки

MITF, специфичен транскрипционен фактор, играе основна роля в ефективното активиране на меланогенните гени, включително тирозиназата, катализирайки ограничаващата скоростта стъпка в биосинтезата на меланин: TRP-1 и TRP-2. Експресията на MITF може да се увеличи от фосфорилирането на CREB [23]. CREB е важен промотор на MITF [24, 25] и фосфорилирането на CREB в меланоцитите повишава експресията на MITF чрез свързване към CREB (c-AMP отговор елемент-свързващ протеин) в меланоцитите [26]. За да изясним молекулярните пътища, отговорни за антимеланогенния ефект на BHCP върху B16F10 клетки, ние изследвахме протеиновите нива на ключови молекули, включително CREB и MITF, които играят важна роля в меланогенезата чрез Western blot анализ. Клетките се третират с BHCP или коджикова киселина и след това се стимулират от -MSH в продължение на 48 часа. Времевият интервал за измерванията следва методологията, описана в предишни проучвания [27]. Както е показано на фигура 5, нивата на тирозиназа и MITF се повишават с -MSH, но BHCP намалява тези протеинови нива. Освен това, фосфорилирането на CREB е значително потиснато от BHCP. Известно е, че регулирането на -MSH-индуцираното CREB фосфорилиране е потенциално важно за регулиране на пигментацията [28]. Тези резултати показват, че антимеланогенните ефекти на BHCP са резултат от понижаване на MITF и тирозиназа чрез понижаване на фосфорилиран CREB. Настоящото проучване предполага, че изясняването на механизма на инхибиране на BHCP върху тирозиназата и меланогенезата е от решаващо значение и трябва да бъде допълнително проучено в бъдеще. Въпреки че клетъчната линия B16F10 на меланома като цяло е по-подходяща за изследване на сигнални механизми in vitro, клетъчната линия B16F10 е на меланом на гризач. Следователно ще са необходими допълнителни изследвания върху човешки меланоцити, за да се потвърдят констатациите.

2.6. Ефект на BHCP върху UV-индуцирано NF-κB p-p65 активиране в Hs27 клетки

След това изследвахме ефекта на BHCP върху UV-индуцираната експресия на възпалителни медиатори, използвайки Hs27 фибробласти. По-рано беше съобщено, че фосфорилирането на p65 (Ser536) е от съществено значение за способността му да трансактивира гени [29]. Следователно, протеиновите нива на p-p65 (Ser536) и p65 бяха изследвани в ядрената фракция чрез Western blotting. Както е показано на Фигура 6a, b, в клетките Hs27, UV повишава протеиновите нива на p-p65 (Ser536) в ядрото, докато лечението с BHCP понижава нивата на протеина на p-p65 (Ser536) в ядрото. Съответно, общото количество на p65 беше намалено в цитоплазмата чрез UV и възстановено от BHCP (Фигура 6c, d). Въпреки че нивата на експресия на протеин на p65 бяха намалени в цитоплазмата и повишени в ядрото след UV индукция, предварителната обработка с BHCP обърна тези тенденции по дозозависим начин. По този начин тези резултати предполагат, че инхибирането на p-p65 от BHCP може да допринесе за защитните ефекти върху пигментацията на кожата и разрушаването на колаген срещу UV.

Фигура 6. Ефекти на BHCP върху нивата на експресия на p-p65 (Ser536) в UV-индуцирани Hs27 човешки фибробластни клетки.

2.7. Ефект на BHCP върху експресията на MMPs в Hs27 клетки

MMPs играят жизненоважна роля в стареенето на кожата. UV облъчването променя съединителната тъкан на кожата чрез регулиране на експресията на MMPs [30,31]. MMP-1 е ензим, разграждащ колагена, който ускорява разграждането на колаген, синтезиран от проколаген тип I. MMP-9 е ензим, разграждащ желатина, който разгражда колагеновите влакна, нарязани от MMP-1, увеличавайки образуването на бръчки и загубата на еластичност. За да изследваме ефекта на BHCP против бръчки срещу UV индукция, ние определихме нивата на MMP-1 и MMP-9 протеин чрез Western blotting. Освен това, UV-индуцираните клетки показват значително повишено ниво на MMP-13, което инициира разграждането на колаген тип I и III вместо MMP-1 [32]. Изследвахме повишаването на MMP (MMP1, MMP9, MMP12 и MMP13) след третиране на UV-индуцирани Hs27 клетки с BHCP при 1 и 10 μM. Както е показано на Фигура 7, нивата на експресия на MMP-1, MMP-9, MMP-12 и MMP-13 се увеличават след UV индукция; обаче лечението с BHCP намалява експресията в доза -зависим начин. Нашите резултати предполагат, че BHCP може да допринесе за предотвратяване на образуването на бръчки чрез намаляване на анормалното производство на MMPs, предизвикано от излагане на UV лъчи. Тези резултати предполагат, че BHCP инхибира експресията на MMP в Hs27 фибробластите, за да предотврати разграждането на колаген и по този начин производството на бръчки. Следователно, BHCP проявява потенциал за използване като превантивно и лечебно лекарство на кожни заболявания.

ползи от стъблото на цистанче

3. Материали и методи

3.1. Химикали и уреди

Гъбена тирозиназа (EC 1.14.18.1), -MSH, L-тирозин, 3,4-дихидроксифенилаланин (L-DOPA), диметилсулфоксид (DMSO) и коджикова киселина бяха закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, MO, USA). Модифицираната среда на Eagle на Dulbecco (DMEM), фетален волски серум, стрептомицин и амфотерицин бяха закупени от Gibco Life Technologies Inc. (Карлсбад, Калифорния, САЩ). Антитела срещу MITF,CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, тирозиназа, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB и -actin са закупени от Santa Cruz Biotechnology (Санта Круз, Калифорния, САЩ). Мембраните от поливинилиден дифлуорид (PVDF) са получени от Millipore Corporation (Bedford, MA, USA). Стерилни пластмасови изделия за тъканни култури бяха закупени от SPL Labware (Сеул, Корея). Източникът на ултравиолетова светлина беше осигурен от серия Crosslinker 800 (UVP, Калифорния, САЩ) с 6 лампи (8 вата/лампа). Тънкослойна хроматография и силикагел 60 (меш 230–400) бяха извършени върху силикагелF{{27} }плочи с предварително покритие от Merck Millipore (Дармщат, Германия). NMR спектрите се записват с помощта на инструменти Varian Unity INOVA 400 (400 MHz за 1H, 100 MHz за 13C) и Varian Unity AS 500 (500 MHz за 1H). Стойностите на химическото отместване (δ) са докладвани по отношение на съответния остатъчен разтворител или деутерирани пикове (δH 2.50 и δC 39.51 за DMSO). Масспектрометрични данни с ниска разделителна способност бяха получени с Expression CMS масспектрометър (Advion, Ithaca, NY, USA).

3.2. Тест за инхибиране на гъбена тирозиназа

Инхибиторната активност на гъбичната тирозиназа се определя, като се използват както L-тирозин, така и L-DOPA като субстрати, въз основа на процедурата, описана от Jung et al. [23]. Накратко, 190 μL ензим тирозиназа (1000 U, разредени с гъбен тирозиназен буфер, включително 1 mM L-тирозин и разтвор на L-DOPA) бяха добавени в присъствието или отсъствието на съединения (крайна концентрация, варираща от 1 до 20 μM, разтворени в 100 процента DMSO), към всяка ямка на 96-плака с ямки, за да се осигури краен обем от 200 μL. Плаката се инкубира при 37 ◦C за 30 минути. Тирозиназната активност се определя количествено чрез измерване на абсорбцията при 492 nm с помощта на четец на микроплаки (TECAN, Залцбург, Австрия) и процентът на инхибиране (%) се получава от следното уравнение:

процентно инхибиране=(Ac − As)/Ac × 100 (1)

където Ac е абсорбцията на контролата и As е абсорбцията на пробата. Стойностите IC50 бяха изчислени от логаритмичните линейни криви и техните уравнения. Показани са средни резултати за три определяния. Kojic киселина се използва като положителна контрола.

3.3. Кинетичен анализ на инхибирането на тирозиназата

За определяне на кинетичните механизми са използвани взаимно допълващи се два кинетични метода (графики на Lineweaver–Burk и Dixon) [21,22,33]. За двойните реципрочни графики на Lineweaver–Burk (графика на 1/скорост на ензима (1/V) спрямо 1/концентрация на субстрата (1/[S])), типът на инхибиране се определя с помощта на различни концентрации на L-тирозин (1, 2, и 4 mM) и L-DOPA (0.5, 1 и 2 mM) като субстрати в присъствието на различни концентрации на BHCP. Концентрациите на BHCP са както следва: 0, 0.5, 1.{{20}} и 2.0 μM за L-тирозин; и 0, 2,5, 5 и 10 μM за L-DOPA. Диаграмата на Dixon е графичен метод (графика на 1/скорост на ензима (1/V) срещу концентрация на инхибитор (I)) за определяне на типа на ензимното инхибиране и се използва за определяне на константата на дисоциация или Ki за комплекса ензим-инхибитор. Графиките на Dixon (единични реципрочни графики) на инхибирането бяха получени в присъствието на L-тирозинов субстрат при 1, 2 и 4 mM и {{40}}, 0.5, 1.{ {47}} и 2.0 μM за BHCP; и L-DOPA субстрат при {{50}}.5, 1.0 и 2.0 mM и 0, 2.5, 5.0 и 10.0 μM за BHCP.

растение цистанчее инхибитор на тирозиназата.

3.4. Клетъчни линии и клетъчна култура

Миши B16F10 меланомни клетки бяха получени от Корейската банка за клетъчни линии. Фибробластната клетъчна линия на човешка кожа Hs27 е закупена от American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Тези клетки се поддържат в DMEM, допълнен с 10% фетален говежди серум, 100 U/mL пеницилин и 100 mg/mL стрептомицин в овлажнен 5% CO2 инкубатор при 37 ◦C. Дермалните фибробласти върху 100 mm блюдо бяха третирани с BHCP и изложени на 50 mJ/cm2UV в DMEM без серум (източник на UV светлина, UVP). Клетките Hs27 се култивират до 70-80 процента сливане в плоча с диаметър 100 mm и се използват между пасажи номера 5 и 15.

3.5. Анализ на клетъчната жизнеспособност

Жизнеспособността на клетките се оценява с помощта на EZ-Cytox kit анализ. Накратко, B16F10 клетки и Hs27 фибробласти се посяват в 96-плака с ямки при плътност от 1 × 104 клетки/ямка и се инкубират при 37 ◦C за 24 часа. Клетките бяха хранени със свеж, свободен от серум DMEM, който съдържаше различни концентрации (0, 1, 2, 5 и 10 μM) на BHCP и се инкубираха за 24 и 48 часа. Впоследствие 10 μL разтвор на EZ-Cytox се зареждат във всяка ямка и клетките се инкубират в продължение на 2-4 часа. Измерването на абсорбцията на клетките при липса на каквото и да е третиране се счита за 100 процента клетъчно оцеляване. Всяко третиране се извършва трикратно и всеки експеримент се повтаря три пъти.

3.6. Определяне на съдържанието на меланин

Ефектът на BHCP върху -MSH-индуцираната меланогенеза в B16F10 клетки се основава на използван преди това метод с леки модификации [34]. Накратко, клетките B16F10 (5 × 104 клетки/ямка) в 6-плаки с ямки бяха оставени да растат до 70–80 процента сливане. След това клетките се третират с различни концентрации на BHCP (1, 5 и 10 μM) или коджикова киселина (5 mM) в продължение на 24 часа и след това се стимулират с -MSH (5 μM) в продължение на 48 часа. След третиране, клетките се промиват два пъти с ледено студен PBS, разтворени в 90 μL 1 М разтвор на NaOH, включително DMSO (5 процента) при 60 °C за 1 час, и абсорбцията се измерва при 405 nm със спектрофотометър за микроплака (TECAN, Залцбург , Австрия). За да се измери количеството меланин в експеримента, скоростта на инхибиране в групите за лечение се изчислява от абсорбцията на известните концентрации на синтетичен меланин, които се коригират към общото количество протеин, който присъства в супернатантата на клетъчните лизати. Абсорбцията на нетретирани клетки се измерва трикратно.

3.7. Анализ на активността на клетъчната тирозиназа

Анализът на активността на клетъчната тирозиназа се извършва чрез измерване на скоростта на окисление на L-DOPA [35]. B16F10 клетки при плътност от 5 × 104/клетки се поставят в 6-панички с ямки и се инкубират за една нощ. След това клетките се третират с различни концентрации на BHCP (1, 5 и 10 μM) или коджикова киселина (5 mM) в продължение на 24 часа и след това се стимулират с -MSH (5 μM) в продължение на 48 часа. Клетките се промиват с PBS и се лизират в разтвор, съдържащ 100 μL от 50 mM фосфатен буфер (рН 6,5), 0,1 mM фенилметилсулфонилфлуорид (PMSF) и 1% Triton X-100. След това клетките се поставят в машина за дълбоко замразяване (-80 ◦C) за 30 минути. След размразяване на клетките, клетъчните екстракти се пречистват чрез центрофугиране при 12,000 rpm за 30 минути при 4 ◦C. Общо 80 μL супернатантата и 20 μL L-DOPA (2 mg/mL) бяха добавени към 96-плака с ямки и абсорбцията при дължина на вълната 492 nm беше измерена на всеки 10 минути в продължение на 1 час при 37 ◦ C с четец на плаки ELISA (TECAN, Залцбург, Австрия).

3.8. Приготвяне на цитозолни и ядрени екстракти от Hs27 клетки

Hs27 клетките се промиват с ледено студен PBS и се събират. За екстракцията на цитозолни фракции от центрофугиране при 12,000 rpm при 4 ◦C за 15 минути и ядрените фракции се екстрахират от пелетите с помощта на буфер, съдържащ 10 mM Tris, 50 mM KCl, 100 mM NaCl и протеазни инхибитори, инкубирани върху лед за 30 минути, и след това се центрофугира при 13,000× g за 30 минути при 4 ◦C за получаване на ядрени фракции.

3.9. Western blotting

Пробите от лизат се варят в продължение на 10 min в буфер за зареждане с гел (125 mM Tris-HCl, 4 процента натриев додецил сулфат (SDS), 10 процента 2-меркаптоетанол и 0,2 процента бромофенол синьо; рН 6,8) при обемно съотношение 1:1. Общите протеинови еквиваленти за всяка проба се разделят чрез SDS-полиакриламидна гелелектрофореза (PAGE), използвайки акриламидни гелове, както се основава на процедурата, описана от Laemmli [36], и се прехвърлят към PVDF мембрани при 80 V за 2 часа, като се използва системата за мокър трансфер. Мембраните бяха незабавно поставени в блокиращ буфер (5 процента обезмаслено мляко) в 10 mM Tris, pH 7,5, 100 mMNaCl и 0,1 процента Tween-20. Петната бяха блокирани, за да се предотврати неспецифичното свързване при 25 °C в продължение на 2 часа. След това мембраните бяха инкубирани със специфично първично антитяло при 4 °C за една нощ, последвано от инкубиране с вторично антитяло, конюгирано с пероксидаза от хрян, при 25 °C в продължение на 1 час . Маркирането на антитела се открива чрез усилена хемилуминесценция в съответствие с инструкциите на производителя. Количественото определяне на протеина се извършва с помощта на Davinch-Chemi TM.Chemiluminescence Imaging System CAS-400SM (Core Bio, Сеул, Корея). Предварително оцветени протеинови маркери бяха използвани за определяне на молекулното тегло.

3.10. Статистически анализ

Всички данни са представени като средна стойност ± SEM. Данните са анализирани чрез еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) за разликите между леченията, последвани от пост-хок теста на Bonferroni. Стойност p < 0.05="" се="" счита="" за="" статистически="">

4. Изводи

В обобщение, резултатите от настоящото проучване показват, че BHCP има ефект на избелване на кожата чрез инхибиране на тирозиназата, която е ключов ензим за биосинтеза на меланин в -MSH-индуцирани B16F10меланоцити. Освен това BHCP намалява експресията на нивата на MMP протеин в UV-индуцирани фибробласти, което се очаква да има ефект против бръчки. Необходими са допълнителни изследвания, за да се потвърди избелващият ефект и ефектът против бръчки на BHCP чрез проучвания върху животни и клинични проучвания. И накрая, беше установено, че BHCP има както избелващ ефект, така и ефект против бръчки, което показва потенциала му за разработване на терапевтични средства за заболявания, свързани с хиперпигментация и бръчки.

какво е цистанче

За повече информация, моля, щракнете тук.