Откриване и характеризиране на минерало-органични наночастици в човешки бъбреци

Цуй-Ин Уонг^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* и др

Ектопичната калцификация е свързана с различни човешки заболявания, включително атеросклероза, рак,хрониченбъбрекзаболяване, идиабетмелитус. Въпреки че са открити минерални наночастици в калцирани кръвоносни съдове, природата и ролята на тези частици в човешкото тяло остават неясни. Тук показваме за първи път този човекбъбректъкани, получени от краен стадийхрониченбъбрекзаболяванеили пациенти с рак на бъбреците съдържат кръгли, многопластови минерални частици от 50 до 1500 nm, докато при здрави контроли не се наблюдават частици. Минералните частици се намират главно в извънклетъчния матрикс, заобикалящ извитите тубули, събирателните канали и бримките на Henle, както и в цитоплазмата на очертаващите тубули клетки, и се състоят от поликристален калциев фосфат, подобен на минерала, открит в костите и ектопичните калцификации. Theбъбрекминералните наночастици съдържат няколко серумни протеини, които инхибират ектопичната калцификация в телесните течности, включително албумин, фетуин-А и аполипопротеин А1. Тъй като минерално-органичните наночастици се намират не само в калцифицирани отлагания, но и в области, лишени от микроскопични калцификации, нашите наблюдения показват, че наночастиците могат да представляват прекурсори на калцификация и бъбречни камъни при хората.

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ектопичната калцификация е свързана с атеросклероза, рак,хрониченбъбрекзаболяванеи захарен диабет 1–3. Последните проучвания показват, че атеросклерозата ихрониченбъбрекзаболяванепациентите с признаци на съдова калцификация показват повишен риск от заболеваемост и смъртност, което предполага, че извънматочната калцификация е вредна за човешкото здраве1,3. Нежелана калцификация се наблюдава и при възрастни хора и повечето хора на възраст над 60 години показват признаци на съдова калцификация4. Поради тези причини, дешифрирането на факторите, които предизвикват ектопична калцификация и разработването на ефективно лечение представляват важни цели.

Ектопичната калцификация може да се определи като дисбаланс между инхибитори и индуктори на калцификация в тялото. Инхибиторите на калцификация включват серумни протеини като албумин, фетуин-А, остеопонтин и матричен GLA протеин, както и малки съединения като пирофосфат, докато хиперфосфатемията и възпалението представляват основни индуктори на калцификация 5-7. Последните проучвания показват, че индукторите на калцификация активират клетъчен процес, подобен на образуването на кост по време на съдова калцификация7,8. Матриксни везикули, подобни на тези, които предизвикват минерализация в развиващите се кости, също са открити в калцирани меки тъкани7–9. Тези матрични везикули вероятно се освобождават от клетки на гладката мускулатура на съдовете, които се диференцират в подобни на остеобласти клетки, които индуцират калцификация7.

Минерални наночастици (NP) са открити в меки тъкани, показващи признаци на ектопична калцификация. Цена и др. установиха, че серумът на плъхове, третирани или с бифосфонат етидронат, или с витамин D, съдържа минерално-протеинови комплекси, съдържащи инхибиторите на калцификация фетуин-А и матричен GLA протеин 10,11. По подобен начин, Jahnen-Dechent et al. наблюдава, че минерални комплекси, съдържащи фетуин-А, които се наричат ​​калципротеинови частици (CPPs), могат да бъдат открити в асцитната течност на пациенти с калциращ перитонит12. Скорошно проучване на Bertazzo et al. демонстрира наличието на минерални NPs в аортните клапи и коронарните артерии както на пациенти с атеросклеротична, така и на ревматична треска13. Докато проучванията върху образуването на минерални частици обикновено се фокусират върху човешката сърдечно-съдова система, остава неясно дали частиците могат да бъдат открити в други тъкани и дали тези образувания играят роля за здравето или заболяването.

По-рано наблюдавахме, че минерално-органичните NPS се образуват спонтанно в човешки и животински телесни течности 14–28. Тези минерални NP първоначално бяха описани като нанобактерии (NB) и се смяташе, че са не само най-малките клетки на земята29, но и възможна трансмисивна причина за множество заболявания, включително болестта на Алцхаймер, атеросклероза, рак,бъбреккамъкформация, поликистозабъбрекзаболяванеи простатит 30–32. Въпреки това, нашите резултати показват, че NB всъщност е неживи минерални NPs, които имитират обикновени бактерии по отношение на тяхната морфология, растеж, пролиферация и субкултура15,18,22. Възможността минерални частици, подобни на така наречения NB, да бъдат открити в човешките тъкани и дали тези частици играят роля в заболяването, остава да се проучи.

В настоящото изследване ние разработихме наноматериален подход за откриване и анализиране на минерално-органични NPs в болен човекбъбрекносни кърпи. Ние показваме, че бъбречните тъкани от краен стадий на хронично бъбречно заболяване и пациенти с рак на бъбреците съдържат мултиламеларни минерални NP, подобни на биомиметичните минерални частици, които спонтанно се утаяват в телесни течности in vitro. Нашите резултати разкриват критични прозрения относно биохимичния състав, механизма на образуване и биологичната функция на тези минерали-органични частици и те хвърлят светлина върху механизмите на извънматочна калцификация и започване на заболяване в човешкото тяло.

Резултати

Изследвахме бъбречни тъкани, отстранени хирургично от пациенти с краен стадий на хронично бъбречно заболяване (n=2) или бъбречен рак (n=18; вижте таблица 1; за проби от рак на бъбреците се фокусирахме върху не -ракова част от тъканта). Като здрави контроли, ние изследвахме бъбречни биопсии, получени от пациенти с травма или хематом, но които не са имали предишна анормална бъбречна функция (n=2; Таблица 1).

Бъбречните тъкани от здрави индивиди показват нормални хистологични характеристики и не се наблюдава ектопична калцификация след оцветяване по von Kossa (фиг. 1A, B). От друга страна, бъбречни тъкани, получени от болни индивиди и оцветени с хематоксилин и еозин (H&E), показват данни за увреждане на тъканите (фиг. 2A–C, обозначени със стрелки), а 80 процента от изследваните болни тъкани показват минерализирани отлагания, както е разкрито чрез оцветяване на von Kossa (фиг. 1C–T, фиг. 2E, F, калцификацията се вижда като черен материал, обозначен с черни стрелки; вижте също таблица 1). Калцифицирани отлагания бяха забелязани в кората и медулата, включително извънклетъчното пространство, заобикалящо дисталните извити тубули, проксималните извити тубули, събирателните канали и бримките на Henle, както и цитоплазмата на клетките, очертаващи тубулите и каналите (фиг. 1C–T и фиг. 2E, F). Не се открива калцификация в бъбречното телце (фиг. 2D).

За да изследваме естеството на минералните утайки, подготвихме ултратънки бъбречни срезове за наблюдение чрез трансмисионна електронна микроскопия (TEM). В проби, съдържащи микроскопични минерални отлагания, минерални частици или гранули са открити в цитоплазмата на бъбречните епителни клетки, в екстрацелуларния матрикс под базалната мембрана и в лумена на проксималните и дисталните извити тубули (фиг. 3A, B, частиците са уголемени в панели A1–A4 и B1–B4). Минерални NP също се наблюдават в клетките, облицоващи бримките на Henle и събирателните канали (фиг. 3C, D, увеличени в панели C1, C2 и D1). Някои частици бяха открити в рамките на вътреклетъчни везикули в бъбречни клетки (фиг. 3A, панели A1 и A2). Подходът на електронна микроскопия, използван тук, също ни позволи да визуализираме вътрешността на минералните частици; някои частици съдържат електронно-плътни пръстени, редуващи се със светли, електронно-прозрачни слоеве (фиг. 3A, панели A3 и A4, фиг. 3C, панел C1). Няколко кръвоносни съда, като vasa recta rents (правите артерии на бъбрека), ние сме заобиколени от голям брой минерални NPs (фиг. 3D, панел D1). По този начин бяха открити минерални NP на различни места във всички човешки бъбречни тъкани, показващи признаци на ектопична калцификация, докато не бяха открити частици в изследваните здрави контроли.

Минералните частици, открити в бъбречните тъкани, изглеждат много подобни на минерало-органичните NPs, описани спонтанно образуващи се в телесни течности в нашите предишни проучвания 15, 17 (и които сме нарекли биони 24). За да проверим тази възможност, подготвихме минерални органични NPs (или биони), използвайки метод на утаяване, както описахме по-рано15. Този метод се състои в добавяне на утаяващи йони като калций и фосфат в среда за клетъчна култура (модифицирана среда на Eagle на Dulbecco или DMEM), съдържаща телесна течност като човешки серум (HS), последвано от инкубиране в условия на клетъчна култура (вижте Методи). Частиците, произведени по този начин (HS-NPS), са или сферични, или елипсовидни и показват гладка или кристална минерална повърхност (фиг. 4A-E), подобно на частиците, описани по-рано в телесните течности 22, 23, както и в човешкия асцит 12 и калцирани артерии13. Минералните частици бяха много подобни на минералните NPs или гранули, наблюдавани в бъбречните тъкани по отношение на тяхната цялостна морфология, многослойна структура и повърхностни характеристики (Фиг. 4F-J). Размерът на частиците, получени от HS, и бъбречните гранули също са сравними, вариращи от 50 до 1500 nm в диаметър (фиг. 4A-E, F-J). Както е отбелязано по-горе, някои бъбречни гранули са заобиколени от липидна мембрана, вероятно представляваща вътреклетъчни товарни везикули или извънклетъчни мембранни везикули (фиг. 4Н, I, мембраните са обозначени със стрелки); такива мембранни структури липсват в HS-NP проби, приготвени in vitro (фиг. 4A-E). Тези наблюдения предполагат, че бъбречните гранули са подобни на минерало-органичните NPs, събрани в серума.

Използвайки електронен дифракционен анализ на избрана област, ние наблюдавахме, че минералната фаза на HS-NPs, приготвена in vitro, се състои от поликристален наноматериал (Фиг. 4E, вмъкване; забележете слабите концентрични пръстени). Подобни резултати са получени за бъбречни гранули (фиг. 4J, вмъкване) и за кости и ектопични калцификации, както е описано в предишни проучвания 33, 35.

Изследвахме химичния състав на HS-NPs и бъбречни гранули, използвайки енергийно-дисперсионна рентгенова спектроскопия (EDX). HS-NP показват големи пикове на въглерод (C), калций (Ca), кислород (O) и фосфор (P) (фиг. 4K), в съответствие с наличието на минерал калциев фосфат. Нисък пик на силиций (Si) също беше отбелязан в HS-NPs (фиг. 4K), вероятно представляващ второстепенна съставна частица. Бъбречните гранули също показват пикове на въглерод, калций, кислород и фосфор, показателни за калциев фосфатен минерал, заедно с допълнителни пикове на силиций и желязо (Fe) (Фигура 4L). Пиковете на уран (U) се приписват на уранил ацетата, използван като контрастиращ реагент по време на подготовката на пробата (наличието на уран в някои проби от минерални частици като бъбречни гранули и отсъствието му в контролната тъкан на фиг. 4M може да се отдаде на високата афинитет на уран към фосфат, както беше съобщено по-рано35). Контролните EDX спектри на бъбречна тъкан, заобикаляща частиците, показват пикове на въглерод и кислород (фиг. 4M), което предполага, че калцият и фосфорът са открити главно в минералните частици.

Съотношенията калций: фосфор (Ca:P) на HS-NP и бъбречните гранули варират от 0.65 до 1.18. Тези съотношения се различават от теоретичната стойност от 1,67, наблюдавана за стехиометричен хидроксиапатит, но все още са в диапазона, наблюдаван по-рано за калциев фосфат и апатитни кристали, наблюдавани при различни степени на кристализация15. Заедно тези открития потвърждават, че бъбречните гранули се състоят от калциев фосфат NPs.

Установено е, че различни протеини инхибират ектопичната калцификация по системен начин в тялото36,37. Освен това се смята, че протеиновата корона, открита на повърхността на синтетични NP, определя биоразпределението и ефектите на частиците върху клетките in vivo 38, 39. От друга страна, протеиновият състав на минерало-органичните NPs, открити в човешките бъбречни тъкани, остава ненапълно разбран. По-рано открихме, че албумин, фетуин-А и аполипопротеин-А1 (апо-А1) представляват основните протеини, които взаимодействат с минерало-органични NP, образувани в телесни течности 17, 20. Тук използвахме маркиране с имуно злато, за да изследваме присъствието и ултраструктурното местоположение на тези протеини в бъбречните гранули.

Използвахме поликлонални антитела срещу човешки серумен албумин (HSA), човешки серумен фетуин-A (HSF), човешки apo-1A и цял HS, за да изследваме наличието на серумни протеини в HS-NPs и бъбречни гранули. Специфичността на поликлоналните антитела (приготвени, както е описано по-рано25) се проверява с помощта на Western blotting (фиг. 5). Всяко едно от поликлоналните антитела реагира положително с HS-NPs, приготвени in vitro, както и с минералните гранули, открити в човешки бъбречни тъкани (фиг. 6A, B, панели A1–A3 и B1–B3; черни точки). Антителата реагират главно с електронно-плътните слоеве или тъмната сърцевина на HS-NPs и бъбречни гранули (фиг. 6A, B), което показва, че тези тъмни зони може да съдържат по-високи нива на протеини в сравнение с електронно-прозрачните области. Отрицателните контроли, извършени без първично антитяло, не дават реакция (Фиг. 6А, В, панели А4 и В4, контрола). Ние стигнахме до заключението, че бъбречните гранули представляват минерало-органични NP, подобни на HS-NP, въз основа не само на тяхната морфология и минерален състав, но и на тяхното свързване с основните инхибитори на калцификация, присъстващи в серума.

След това беше използвана имунофлуоресцентна микроскопия, за да се потвърди наличието на минерални гранули, съдържащи HSA и HSF в болни човешки бъбреци. Използвайки тази техника, човешки бъбречни тъкани показаха

положително оцветяване за двата протеина в различни области, включително интерстициума, заобикалящ бъбречните тубули, както и цитоплазмата на очертаващи тубули клетки (фиг. 7А, панели А1 и А2). Протеинови агрегати, съдържащи както албумин, така и фетуин-А, също бяха забелязани в тези области, макар и в по-ниски количества в сравнение с оцветяването на единичните протеини (фиг. 7A и панел A3, обединено оцветяване в жълто). Трябва да се отбележи, че забелязахме, че протеиновото оцветяване, открито чрез имунофлуоресценция, тясно се припокрива с модела на ектопична калцификация, наблюдавана с помощта на оцветяване на von Kossa (фиг. 7A, B, калцификацията се вижда като черен материал, обозначен със стрелки в B). Тези резултати осигуряват допълнителна подкрепа за наличието на минерало-органични частици в изследваните човешки бъбречни тъкани.

Дискусия

Въпреки че е постигнат напредък в разбирането ни за взаимодействията между синтетичните НЧ и човешките клетки, ние знаем значително по-малко за ефектите на минерало-органичните НЧ, които се образуват спонтанно в телесните течности. Нашите предишни проучвания показват, че тези частици се образуват в биологични течности, когато концентрациите на калций и фосфат надвишават насищането15,16. Ние също така наблюдавахме, че тези частици се интернализират от имунните клетки, но че само големи частици предизвикват провъзпалителни имунни реакции23. Разпределението на тези частици в човешките тъкани и дали те играят някаква физиологична или патологична роля в тялото обаче не е изследвано досега.

В настоящото проучване открихме за първи път минерало-органични NPs в бъбреците на пациенти, страдащи от краен стадий на бъбречно заболяване или рак на бъбреците. Откритите минерало-органични НЧ съдържат слабо кристализиран калциев фосфат, подобен на костния минерал, както и албумин, фетуин-А и апо-А1, които действат като системни инхибитори на калцификацията в телесните течности. Нашите резултати са в съгласие с предишни доклади, които описват наличието на минерално-протеинови комплекси в съдови тъкани и телесни течности 12, 13, 34, 40. Тъй като частиците, които наблюдавахме, бяха открити в области без микроскопични калцификации, нашите наблюдения предполагат, че частиците могат да представляват прекурсори на ектопична калцификация в човешките тъкани. Като се има предвид възможността, че минерало-органичните NP могат постепенно да нарастват по размер и да претърпят превръщане на частици във филм при благоприятни условия, както е описано в нашите предишни проучвания 15, 18, представените тук наблюдения предполагат, че минералните прекурсори могат да доведат до образуването на по-големи минерални отлагания in vivo, като плака на Randall и камъни в бъбреците.

Нашите наблюдения, че минерални ектопични калцификации и минерало-органични NPs се намират в различни анатомични структури на бъбреците, са в съответствие с предишни открития на ектопични калцификации в този орган41. Наблюденията на Evan et al. показват, че минерализацията в бъбреците на пациенти с нефролитиаза може да започне и да се случи предимно в интерстициалната тъкан на бримките на Henle40,42. Тези автори отбелязват, че минералните отлагания, образуващи се в тази област, могат да изпъкнат от базалната страна на уротелиума и да доведат до образуването на камъни в бъбреците. Нашите наблюдения показват, че в допълнение към бримките на Henle, други бъбречни области могат да съдържат минерални NP, които в крайна сметка могат да се развият, за да образуват големи минерални отлагания в човешките бъбреци. Ние също така изследваме възможността минералните NP, които се образуват в кръвообращението, да се преместят в бъбречните тъкани и да предизвикат ектопична калцификация и образуване на камъни в бъбреците.

Няколко бъбречни гранули, открити в настоящото изследване, се намират в рамките на вътреклетъчни или извънклетъчни везикули (фиг. 4H, I) и те са подобни на матричните везикули, за които е показано, че предизвикват калцификация в костите и зъбите 7,8. Наскоро наблюдавахме, че везикулите, изолирани от човешки и животински серум, индуцират образуването на минерални NPs и микроскопични преципитати in vitro25. Schlieper et al.34 също наблюдават, че минералните частици, намерени в артериите, са свързани с мембранни структури и предполагат, че матричните везикули или апоптотичните тела могат да представляват нуклеатори на минерални частици в тези тъкани. По подобен начин Khan et al. съобщават, че отлаганията на калциев фосфат, открити в бъбреците на пациенти с идиопатични камъни в бъбреците, са свързани с колагенови влакна и матрични везикули9. Тези резултати предполагат, че минерало-органичните NPs, открити в бъбречните тъкани, могат да се образуват чрез механизъм, включващ мембранни везикули, ситуация, аналогична на това, което се наблюдава при атеросклеротичните артерии7,8. От друга страна, едно скорошно проучване показа, че ектопичната калцификация, открита при женски гръдни артерии, не е свързана с остеогенни или апоптотични клетъчни маркери43, което предполага, че механизмът на калцификация може да е специфичен за участващия орган или биологичен контекст. В допълнение, минерало-органични NP като тези, описани тук, човешки бъбречни тъкани могат също да се образуват поради неуспех да се поддържат физиологични концентрации на йони (напр. калций и фосфат) и инхибитори на калцификация (напр. албумин, фетуин-А и апо -A1) в телесните течности на човека.

Нашите резултати предполагат, че електронно-плътният слой и сърцевината на минерално-органичните NP могат да съдържат по-високи нива на протеини и органични молекули в сравнение с електронно-прозрачните области на частиците (фиг. 6A, B). Тези електронно-плътни слоеве изглеждат минерализирани, както се вижда от кристалната природа на този материал под ТЕМ (виж Фиг. 4A–J). Други автори, включително Ryall41 и Evan et al.44, предполагат, че електронно-прозрачният слой може да представлява минерали, докато електронно-плътните слоеве могат да съответстват на органични молекули. Тези интерпретации може да се дължат поне отчасти на начина, по който пробите са били обработени и изследвани във всяко изследване, както и на естеството на използваните изходни тъкани.

Освен че играят роля в ектопичната калцификация, минералите-органични частици могат да предизвикат възпаление в бъбречните тъкани. Наскоро показахме, че докато минерало-органичните NPs не успяват да индуцират секрецията на провъзпалителен интерлевкин -1 от човешки макрофаги, минералните агрегати, по-големи от 1 μm, са в състояние да направят това23. Доказано е, че освобождаването на интерлевкин-1 в отговор на кристални материали зависи от активирането на вътреклетъчни молекулни комплекси, наречени инфламазоми45-47. В допълнение, минералните частици са открити в бъбреците, съдържащи тумори, и връзката между рака и възпалението вече е добре позната48. Възможността агрегираните минерални частици да активират инфламазома и да допринесат за развитието на възпаление и рак в бъбреците или други тъкани остава да бъде проучена.

В допълнение към ектопичната калцификация, минералните гранули, описани тук, могат да участват в други болестни процеси. Например, ние предложихме по-рано, че минералните NP могат да се свързват с различни протеини в телесните течности и да изчерпват тези органични молекули от телесните течности 20, 26. От друга страна, човешкото тяло може да предотврати образуването и натрупването на минерални NP при нормални обстоятелства, като разчита на наличието на инхибитори на калцификацията и ретикулоендотелната система (т.е. макрофагите). По този начин минералните NP могат да се натрупват само след като системната или локална калциева хомеостаза е нарушена и когато защитните механизми в човешкото тяло са се провалили.

Предлагаме разработеният тук наноматериален подход да може да се използва за изследване на образуването на минерало-органични NP в животински и човешки тъкани. Например, антитела, повдигнати срещу протеини инхибитори на калцификация, като албумин, фетуин-А и апо-А1, могат да се използват в комбинация с минерален анализ за откриване и характеризиране на образуването на минерало-органични NPs в тъканите на животински модели. Резултатите, получени с помощта на този подход, могат да бъдат приложени към клинични измервания, направени върху човешки телесни течности, за да се идентифицират биологични параметри, които отразяват състоянието на образуване на минерални частици и извънматочна калцификация в тялото. Очакваме, че това знание може да доведе до разработването на нови терапевтични стратегии за предотвратяване и лечение на човешки заболявания и състояния, свързани с извънматочна калцификация.

Методи

Бъбречни тъкани.Използването на човешки тъкани и експериментите, извършени в това проучване, бяха одобрени от институционалния съвет за преглед на болница Chang Gung Memorial; методите и експериментите са проведени в съответствие с одобрените насоки. От пациентите е получено писмено информирано съгласие. Контролни здрави бъбречни тъкани са получени от биопсии на пациенти с травми и хематоми без анамнеза за бъбречно заболяване (n=2); Бъбречни тъкани също са получени от пациенти с рак на бъбрека (n=20) и от пациенти с краен стадий на бъбречно заболяване (n=2), чиито бъбреци са били отстранени или биопсирани по време на операция за трансплантация (Таблица 1). За тъканите на рак на бъбреците нераковата част на тъканта беше дисектирана и анализирана в настоящото изследване.

Хистологичен анализ.Бъбречните тъкани бяха монтирани върху парафинови блокове. Блоковете се разделят и тъканните срезове се нагряват на котлон при 70 градуса за 30 минути, за да се отстрани парафинът. Срезовете се потапят в пресен разтвор на ксилен три пъти за 15 минути, за да се отстрани напълно останалият парафин. Срезовете се рехидратират с 95 процента, 80 процента и 70 процента етанол за 5 минути всеки път. Рехидратираните проби се промиват с двойно дестилирана вода (ddH2O) в продължение на 5 минути. Клетъчните ядра се оцветяват с хематоксилин в продължение на 8 минути. Багрилото се отстранява от пробите с топла вода за 10 минути. Бъбречните проби се изплакват в ddH2O и се потапят 10 пъти в 95 процента етанол. Обработените с етанол проби бяха насрещно оцветени с еозин Y за 1 минута. Образците се дехидратират с 95 процента и 100 процента етанол за 10 минути всеки път, последвано от етап на дехидратиране в ксилен за 10 минути. Последните проби от дехидратиран бъбрек бяха монтирани върху предметни стъкла с 50 процента глицерол и наблюдавани под светлинен микроскоп, оборудван с цифрова камера.

Депарафинизираните и рехидратирани проби се приготвят, както е описано за H&E оцветяване. Рехидратираните срезове се оцветяват със сребърен нитрат (5 процента), последвано от излагане на UV светлина за 20 минути. Разтворът се промива с ddH2O в продължение на 15 минути. Срезовете се оцветяват с натриев тиосулфат (5 процента) в продължение на 5 минути, последвано от промиване с ddH2O в продължение на 15 минути. Срезовете се оцветяват с ядрено бързо червено (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) за 5 минути. Оцветените проби се дехидратират последователно с 95 процента и 100 процента етанол за 10 минути всеки, преди дехидратиране в ксилен за 10 минути. Пробите от бъбрек се монтират върху предметни стъкла и се изследват, както е описано по-горе.

Електронна микроскопия и EDX анализ.Пробите от бъбреците се нарязват на малки парчета с дебелина под 1 mm с помощта на микроскоп за дисекция на LGPS (Olympus, Токио, Япония). Тъканите бяха фиксирани с 2,5 процента глутаралдехид и 1 процент параформалдехид в 0.1 М какодилатен буфер при 4 градуса за една нощ. Фиксираните проби се промиват три пъти с 0.1 М какодилатен буфер в 8 процента захароза (рН 7,2) върху лед за 10 минути. Измитите тъкани се инкубират във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4), съдържащ 1 процента осмиев тетроксид и 1,5 процента калиев фероцианид, за 2 часа върху лед. Тъканите се промиват с ddH2O върху лед 10 минути три пъти. Измитите тъкани се оцветяват върху лед с 1% уранил ацетат в ddH2O за 1 час, преди да се промият три пъти с ddH2O върху лед. Бъбречните тъкани се дехидратират с 30, 50, 70, 80 и 90 процента етанол за 10 минути всеки път, освен когато етанолът достигне 70 процента, в който случай пробите се съхраняват при 4 градуса за една нощ. Тъканите се оцветяват с 1% фосфорволфрамова киселина в 95% етанол за 15 минути, преди дехидратиране с 95% етанол за 5 минути. Пробите бяха потопени в пропилей оксид при 40, 57, 67 и 100 процента в етанол за 10 минути всеки път, последвано от друго потапяне в 100 процента пропилен оксид за 5 минути. Бъбречните тъкани се инфилтрират с 50, 70 и 100 процента Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) за 1 час всеки път. Бъбречни проби с вграден 812-Eponate бяха приготвени чрез инкубиране два пъти в 100 процента Eponate. Вградените проби се инкубират в пещ при 60 градуса за една нощ, за да се позволи полимеризация на смолата.

Измити HS-NP пелети, получени както по-горе, се фиксират с глутаралдехид (2,5 процента) и параформалдехид (1 процент) в ddH2O за 4 часа при 4 градуса. Фиксираните пелети се промиват с ddH2O три пъти за 10 минути всеки път. Пелетите се дехидратират с последователни инкубации в 30, 50, 70, 80, 90, 95 и 100 процента етанол за 10 минути всеки път, освен когато етанолът достигне 70 процента, в който пелетите се съхраняват при 4 градуса за една нощ. Други етанолови разтвори бяха поставени в контакт с пелетите само за 10 минути. Дехидратираните пелети се инфилтрират с LR бяла среда за вграждане (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), като се използват различни съотношения на етанол и LR среда (3:1, 1:1 и 1:3) за 30 минути всяка. Пелетите се инфилтрират със свежа LR среда (100 процента) за една нощ преди полимеризация. Пелети, инфилтрирани с LR среда, се инкубират в пещ при 60 градуса за 2 дни, за да се позволи полимеризация на смолата. Блокове от бъбрек и HS-NPs се разделят, за да се получат резени с дебелина 70–100 nm, като се използва микротом Reichert Ultracut S (Leica, Wetzlar, Германия). Тъканните срезове се оцветяват с 4 процента уранил ацетат преди визуализация под трансмисионен електронен микроскоп JEM 1230 (JEOL, Токио, Япония), работещ при 100 kV. С помощта на същата система бяха получени електронни дифракционни модели. Като опора са използвани никелови решетки.

За EDX анализ, тънки срезове от бъбречни тъкани се оцветяват с уранил ацетат и се промиват с ddH2O, както по-горе, последвано от сушене в електронен ексикатор. Образците бяха наблюдавани под трансмисионен електронен микроскоп JEM 2100 с висока разделителна способност (JEOL), работещ при 120 kV. EDX спектрите са получени в три екземпляра с помощта на INCA Energy EDS система (Oxford Instruments, Abingdon, UK). Наблюдават се тънки участъци от HS-NPs без оцветяване.

Получаване на минерало-органични НЧ.Всички изходни разтвори бяха коригирани до рН 7,4 и стерилизирани чрез филтруване през 0.2μm мембрани преди употреба. HS е получен от здрави доброволци с помощта на конвенционална техника за венепункция. Използването на човешки биологични течности в това проучване е одобрено от институционалния съвет за преглед на болница Linko Chang Gung Memorial и е получено писмено информирано съгласие от доброволците. HS-NPs се приготвят чрез добавяне на 3 mM CaCl2 и Na2HPO4 всеки в DMEM (Gibco, Carlsbad, CA), съдържащ 10 процента HS, последвано от инкубиране за една седмица в условия на клетъчна култура (37 градуса, 5 процента CO2, овлажнен въздух). Частиците се пелетират чрез центрофугиране при 16, 000 × g за 15 минути при 4 градуса и се промиват два пъти с HEPES буфер (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl), като се използва същата процедура на центрофугиране.

SDS-PAGE и Western blotting.SDS-PAGE и Western blot анализът се извършва по същество както преди15. Накратко, 0.2 ug (Фиг. 5A,D) или 1,2 ug (Фиг. 5B,C) HS протеини, 47 ug (Фиг. 5A,B,D) или 590ug от HS-NP протеини (фиг. 5C), 0.1ug от HSA (фиг. 5A–D) и 0.6ug (фиг. 5A, C, D) или {{23} }.15ug от HSF (фиг. 5B) се разтварят в 5× "зареждащ буфер" (0.313 M Tris-HCl рН 6.8, 10 процента SDS, 0.05 процента бромофенол синьо, 50 процента глицерол, 12.5 процента - меркаптоетанол) до крайна концентрация от 1 ×, преди нагряване при 95 градуса за 5 минути и разделяне при денатуриращи и редуциращи условия на 10 процента SDS-PAGE с помощта на мини-гел система (Hoefer, Holliston, MA). Контролата на NP (използвана в пътека 1 на Фиг. 5A–D) се състои от минерални NPs, приготвени чрез добавяне на 3 mM CaCl2 и Na2HPO4 всеки в DMEM (краен обем от 1 ml), последвано от инкубиране за един ден в условия на клетъчна култура; частиците се пелетират чрез центрофугиране при 16, 000 × g за 15 минути, промиват се два пъти с HEPES буфер и се суспендират повторно в 50 ul HEPES буфер. Аликвотна част от 20 ul ресуспендирани частици се обработва за SDS-PAGE, както по-горе. PVDF мембраните се блокират за 1 час в 5 процента (w/v) обезмаслено мляко при стайна температура. Първичните антитела, генерирани вътрешно, както е описано по-горе25, бяха използвани в разреждане 1:1,000 (-apo-A1 и -HS-NP), 1:3,000 (-HSF) , или 1:6,000 (-HSA). Козето анти-заешко пероксидаза-конюгирано вторично антитяло от хрян се използва въз основа на инструкциите, предоставени от производителя (Millipore, Billerica, MA). Петната бяха разкрити с помощта на подобрена хемилуминесценция (Amersham Biosciences, Amersham, UK) и авторадиографски филми.

Етикетиране на имуно злато.Подготвени са проби за ТЕМ наблюдение. HS-NP блоковете бяха разделени на резени с дебелина под 7 0 nm. Секциите на пробите върху решетките бяха блокирани с 1 процент рибен желатин (Sigma) в 0.1 М HEPES буфер (рН 8,0) за 25 минути. Решетките се инкубират със следните първични антитела: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Отрицателната контрола не съдържа първично антитяло (1 процент рибен желатин в HEPES буфер). Инкубираните срезове се промиват с HEPES буфер за 15 минути. Изплакнатите срезове се блокират с 1% рибен желатин в HEPES буфер за 20 минути. Пробите бяха третирани с вторичен 5-nm-златен конюгат кози анти-заешки IgG в продължение на 1 час. Пробите се промиват с HEPES буфер за 10 минути, преди да се промият с ddH2O за 10 минути. TEM наблюденията бяха извършени както по-горе.

Флуоресцентна микроскопия.Хистологични предметни стъкла от бъбречна тъкан, приготвени както по-горе, се блокират с 1% говежди серумен албумин в продължение на 1 час при стайна температура. Слайдовете се инкубират с първични поликлонални антитела при разреждане 1:4,000. След етапите на промиване, пробите се инкубират с вторичните антитела кози анти-заешки-FITC (492/520 nm) и кози анти-заешки-TRITC (550/570 nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) при 1:100 за 1ч. Комплексите се промиват с PBST в продължение на 15 минути. Флуоресцентното оцветяване 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) се използва при 10 ug/ml за 15 минути. Оцветените с DAPI проби се дехидратират с 95 и 100 процента етанол за 10 минути всяка, последвано от дехидратация в ксилен за още 10 минути. Дехидратираните бъбречни проби бяха монтирани с Vectashield флуоресцентна H-1000 монтажна среда (Vector Laboratories, Burlingame, CA) и бяха наблюдавани под конфокален микроскоп (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Германия), оборудван с Spot Flex камера.

Cistanche tubulosa предотвратява бъбречни заболявания, щракнете тук, за да получите пробата

Препратки

1. Giachelli, CM Ектопична калцификация: събиране на твърди факти за минерализацията на меките тъкани. Am J Pathol 154, 671–675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Съдова калцификация: механизми и клинични разклонения. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1161–1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Калцификация при атеросклероза. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Модели и рискови фактори за системна калцирана атеросклероза. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 331–336 (2004).

5. Ketteler, M. et al. Недостиг на калциево-регулаторни протеини при пациенти на диализа: нова концепция за сърдечно-съдова калцификация при уремия. Kidney Int Suppl 84, S84–87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Насочване към съдова калцификация: омекотяване на твърда цел. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Калциева регулация на матриксни везикули, произхождащи от васкуларни гладкомускулни клетки. Тенденции Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM et al. Калцификация при атеросклероза: костна биология и хронично възпаление на артериалния кръстопът. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Асоциация на плаките на Randall с колагенови влакна и мембранни везикули. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Биохимична характеристика на серумния фетуин-минерален комплекс. J Biol Chem 278, 22153–22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Серумните нива на фетуин-минералния комплекс корелират с калцирането на артериите при плъхове. J Biol Chem 279, 1594–1600 (2004).

12. Heiss, A. et al. Йерархична роля на фетуин-А и киселинни серумни протеини при образуването и стабилизирането на частиците на калциевия фосфат. J Biol Chem 283, 14815–14825 (2008).

13. Bertazzo, S. et al. Наноаналитичната електронна микроскопия разкрива фундаментални прозрения за калцификацията на човешката сърдечно-съдова тъкан. Nat Mater 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Предполагаеми нанобактерии в човешката кръв като наночастици от калциев карбонат. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).

15. Young, JD и др. Предполагаемите нанобактерии представляват физиологични остатъци и културни странични продукти от нормалната калциева хомеостаза. Plos One 4, e4417 (2009).

16. Young, JD et al. Характеризиране на гранулациите на калций и апатит в серума като плеоморфни минерало-протеинови комплекси и като прекурсори на предполагаеми нанобактерии. Plos One 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuin-A/албумин-минерални комплекси, наподобяващи серумни калциеви гранули и предполагаеми нанобактерии: демонстрация на концепция за двойно инхибиране-засяване. Plos One 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Възходът и падението на нанобактериите. Sci Am 302, 52–59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Критична оценка на облъчен с гама серум, използван като хранилка в културата и демонстрация на предполагаеми нанобактерии и калциращи наночастици. Plos One 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. et al. Цялостен протеомен анализ на минерални наночастици, получени от човешки телесни течности и анализирани чрез течна хроматография-тандемна масспектрометрия. Anal Biochem 418, 111–125 (2011).