Разработка на обогатено масло с полифеноли, извлечени от отпадъчни води от маслинова мелница Част 1

Резюме:Извличането на зехтин произвежда значителни остатъчни отпадъчни води от мелницата за маслини (OMW). Съставът на OMW варира в зависимост от вида маслини, степента на зрялост на плода и метода на екстракция (традиционна система с едно пресоване или непрекъснати системи, базирани на центрофугиране на маслинова каша). В страните, производителки на маслини, OMW е важен за околната среда и икономиката и също така е евтин източник на полифенолни съединения с високи антиоксидантни свойства. Свойствата на зехтина, като неговите антиатерогенни, противовъзпалителни, против стареене и имунологични модулаторни ефекти, се приписват на неговите полифеноли. В това проучване методът на екстракция с точка на помътняване (CPE) е използван за възстановяване на полифенолни съединения от OMW. Общата мицеларна фаза на трите възстановявания е 24,2 процента, а общите полифеноли (след обработка с ултразвук) са 504 mg GAE/Kg. Освен това, добавянето на полифеноли, възстановени от OMW, подобрява зехтина и удължава срока му на годност, без да променя органолептичните му свойства. Имаше 42,2% промяна в полифенолите след 0,5% обогатяване на мицеларните дисперсии. По този начин се предполага, че методът CPE може да доведе до по-добро управление на отпадъците в производството на зехтин и да подобри хранителното качество на хранителните продукти.

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да улавя свободните радикали DPPH и може да улавя реактивни кислородни видове, да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена и също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на аниона от свободните радикали на тимина.

Кликнете върху Anti-aging Cistanche Para Que Serve

【За повече информация: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ключови думи: антиоксиданти; извличане на точка на помътняване; хранително-вкусовата промишленост; обогатяване; отпадъчни води от мелница за маслини; зехтин; полифеноли; възстановяване

1. Въведение

Търсенето на зехтин непрекъснато нараства в световен мащаб. В средиземноморската зона, която е най-голямата зона за производство на маслини в света, огромно количество агропромишлени отпадъчни води се генерират от индустрията за преработка на маслини [1,2]. Остатъците от отпадъчни води от мелницата за маслини (OMW) се състоят от твърди отпадъци - състоящи се от маслинова каша - както и течни отпадъци - състоящи се от зеленчуци и допълнителна вода, генерирана по време на декантирането. OMW има тъмнокафяв цвят (който може да стане черен) и отличителен, силен аромат, напомнящ на маслини [3]. Страничните продукти от мелницата за маслини имат екологично и икономическо значение в страните производителки на маслини. OMW създава високи нива на замърсители поради високото си органично натоварване и високото съдържание на фитотоксични и антибактериални полифенолни вещества, които са устойчиви на биологично разграждане [4]. Третирането и изхвърлянето на OMW се превръщат в сериозен екологичен проблем. По този начин страните производителки на зехтин са изправени пред сериозно предизвикателство да намерят екологосъобразно и икономически жизнеспособно решение за обработката и изхвърлянето на OMW.

Иновативна и екологична технология за извличане на биоактивни вещества, особено от храна, е екстракцията с точка на помътняване (CPE). Това е техника, при която химически или биологични компоненти се извличат с помощта на нейонни повърхностно активни вещества, които при нагряване до (или над) критична температура са склонни да се отделят от насипния разтвор и да създават облаци [5]. Повърхностноактивните вещества се използват специално като екстрагенти по време на CPE процеса. При правилните обстоятелства екстракцията се извършва при температура под точката на помътняване - когато повърхностноактивното вещество стане мътна (т.е. по-малко разтворимо от първоначалната проба или дори неразтворимо) - което води до разделянето на две фази: водната фаза и повърхностноактивното вещество - богата фаза. Поради процесите на помътняване, техниката води до предварителна концентрация на аналитите (като полифеноли) в богатата на повърхностно активно вещество фаза [6]. Освен това е доказано, че съединенията, разтворени от мицела, са защитени от окисление [7].

Полифенолните съединения, захарите и органичните киселини съставляват по-голямата част от OMW. OMW също има богати ресурси като калий и други минерални хранителни вещества, които могат да бъдат използвани отново като тор [8]. Въпреки това, OMW може да бъде естествен източник на антиоксиданти поради високото си съдържание на полифенолни съединения. Полифенолите в маслиновото масло имат потенциално полезни хранителни свойства за техните антиоксидантни и биологични дейности като антиалергични, противовъзпалителни, противоракови и антихипертония [9,10]. Ниският редокс потенциал на полифенолите, който им позволява да действат като редуциращи агенти чрез отдаване на водород или електрони и улавяне на свободните радикали, е в основата на тяхната антиоксидантна активност [7].

Производителите на масло се стремят да произвеждат хранителни продукти, които запазват своята хранителна стойност и срок на годност за продължителен период от време. Тези фактори правят добавките с антиоксиданти обичайна техника за понижаване на липидното окисление при производството на храни [11]. За да се предотврати окисляването в храни, съдържащи мазнини и масла, като хранителни добавки са използвани синтетични антиоксиданти, включително бутилиран хидрокситолуен (BHT), терт-бутил хидрохинон (TBHQ) и бутилиран хидроксианизол (BHA). Въпреки това беше разкрито, че тези химически антиоксиданти са свързани с различни опасности за здравето, включително рак и канцерогенеза [12].

Скорошни изследвания показват, че естествените антиоксиданти могат да предотвратят окисляването на хранителните масла [11–13]. Обогатяването на зехтина с полифенолни вещества може да увеличи срока на годност на зехтина, без това да повлияе на неговите органолептични характеристики. Въпреки това балансът антиоксидант/прооксидант зависи от много фактори, по-специално от дозата (напр. концентрация) и времето (напр. продължителност на съхранение) и това е много деликатен процес, който може лесно да бъде променен [14]. Следователно, възстановяването на полифенолни съединения не само предоставя икономическа възможност, но също така намалява екологичния заряд на отпадъчните води.

Целите на това проучване бяха първо да се възстановят полифенолните вещества от OMW с прилагането на метода CPE и второ да се обогати зехтинът с възстановените полифенолни вещества. Стабилността на полифенолите е важен параметър при това обогатяване. За тази цел са изследвани емулгатори, като лецитин.

2. Материали и методи

2.1. Материали

В това изследване е използвана проба от отпадъчни води от мелница за маслини (Olea europaea var. Koroneiki) от района на Превеза (Епир, Гърция). Пробата OMW беше специално събрана от индустрията за маслиново масло, замразена и доставена в нашата лаборатория същия ден. Зехтин от местен пазар в Кардица (Тесалия, Гърция) беше използван като матрица за контролната проба, съставена от необработени и рафинирани маслинови масла.

2.2. Реактиви

The 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH• ) and α-tocopherol were purchased from Alfa Aesar (Karlsruhe, Germany). Sodium chloride, citric acid, lecithin of soya (>97 процента), диетилов етер и изооктан са получени от Carlo Erba (Милано, Италия). Безводният натриев карбонат и натриевият хидроксид са от Penta (Прага, Чехия). Абсолютният етанол, метанолът, реагентът на Folin-Ciocalteu и монохидратът на галовата киселина са от Panreac (Барселона, Испания). Циклохексанът и n-хексанът са от Sigma-Aldrich (Steinheim, Германия). Дейонизираната вода, използвана в експериментите, е произведена с помощта на дейонизираща колона.

2.3. Екстракция на полифеноли от OMW

Използван е метод, наречен екстракция на точка на помътняване (CPE). Методът CPE се основава на идеята, че когато концентрацията на повърхностноактивно вещество в разтвор надвиши тази на критичната мицеларна дисперсия, тя може да генерира мицеларни дисперсии [6]. Фигура 1 показва експерименталните стъпки на метода CPE. Първо, пробата трябваше да бъде размразена, преди твърдите вещества да могат да бъдат отделени с помощта на центрофуга (Digicen 20-R, Orto Alresa, Мадрид, Испания) за 10 минути при 4500 rpm. След събиране на супернатанта се добавя лимонена киселина (50 процента), за да се доведе нивото на рН до 3,5. Цялата проба беше разделена на три части, като към всяка от тях беше добавен лецитин като повърхностноактивно вещество в концентрации съответно 1%, 3% и 5%, заедно с 30% сол. За разбъркване се използва интензивна магнитна бъркалка. След 20 минути разтворът се центрофугира в продължение на 5 минути при 4500 rpm. Горната мицеларна (повърхностноактивна) фаза (SP) и долната водна (водна) фаза (WP) бяха изследвани отделно. Първото възстановяване на полифенолните дисперсии се случи в този момент. С водната фаза, съдържаща неекстрахираните аналити, CPE методът беше извършен още два пъти при същите условия (2-ро и 3-то възстановяване). Храни 2023, 12, x ЗА РЕЦЕНЗИЯ 3 от 13 Абсолютният етанол, метанолът, реагентът на Folin–Ciocalteu и монохидратът на галова киселина бяха от Panreac (Барселона, Испания). Циклохексанът и n-хексанът са от Sigma-Aldrich (Steinheim, Германия). Дейонизираната вода, използвана в експериментите, е произведена с помощта на дейонизираща колона

2.4. Определяне на производителността на метода CPE

2.4.1. Общо съдържание на полифеноли

Според Chatzilazarou et al. [15], методът на Folin-Ciocalteu е използван за фотометрично определяне на общото съдържание на полифеноли (TPC). Накратко, 0.5 g мицеларни дисперсии и 0.5 mL реагент Folin–Ciocalteu бяха добавени към 25- mL мерителна колба. След 3 минути се добавя 1 mL Na2CO3 (35 процента, w/w). Използва се дейонизирана вода за напълване на колбите до необходимото ниво на обем и след това те се държат на тъмно за 60 минути. Shimadzu UV-1700 UV/Vis спектрофотометър (Киото, Япония) беше използван за измерване на абсорбцията при 750 nm. Използвани са стандартни разтвори (1–10 mg/L) за създаване на стандартна крива на галовата киселина. TPC се изразява като mg еквиваленти на галова киселина (GAE) на Kg мицеларни дисперсии.

Методът DPPH на Katsoyannos et al. [16], с някои модификации, беше използван за оценка на активността на отстраняване на радикалите на полифенолите, извлечени във фазата на повърхностно активното вещество, както и тези, които все още присъстват в пробата след третирането с CPE (водна фаза). Накратко, 1 mL, 0.1 mM разтвор на метанолов DPPH се добавя към 4 mL от разтвора на пробата (500, 1000 и 2000 mg/L). Сместа се разклаща старателно, преди да се остави да престои на стайна температура на тъмно в продължение на 30 минути, докато абсорбцията се измерва при 517 nm. Формулата, използвана за определяне на процентното инхибиране, беше: процентно инхибиране=100 × (Aконтрола − Asпроба)/Aконтрола, където Acontrol и Asample са абсорбциите. От активностите на почистване (проценти) спрямо концентрациите на съответната крива на пробата се определя IC50.

2.5. Обогатяване на зехтина с мицеларни дисперсии

Използване на ултразвукова сонда (Misonix Sonicator S3000, Qsonica, LLC, Newtown, CT, USA) и протокол за ултразвукова обработка (75 процента енергийна енергия за 60, 75 и 90 минути с 0,5 импулса цикли), беше изследвано намаляването на размера на мицелите. Методът CPE беше използван за възстановяване на мицеларни дисперсии, които след това бяха добавени към зехтина, за да го подобрят. За обогатяване се използват концентрации от 0,5, 1 и 5 процента.

2.6. Обогатен анализ на качеството на маслиновото масло

Съгласно Регламент на Комисията (ЕИО) № 2568/91 [17] е разработен методът за определяне на свободни мастни киселини (СМК) в зехтин.

2.6.2. Индекс на пречупване 

Рефрактометър (Quartz/Digital Abbe refractometer, Medline Scientific Limited, Oxon, UK) беше използван за измерване на индекса на пречупване на пробата. Инструментът беше калибриран с дестилирана вода, която имаше индекс на пречупване 1,3333 при 20 ◦C.

2.6.3. Колориметрия

Колориметърът беше използван за определяне на цвета на пробите от маслиново масло (Lovibond CAM-System 500, The Tintometer Ltd., Amesbury, UK). За да се определи цвета на CIELAB, проба (25 mL) се поставя в чаша от 50 mL и се поставя в колориметъра. Дефинирани са психометричен индекс на лекота, L*, и координати на цветност, a* и b*. Освен това формулата за изчисляване на наситеността, или C*, беше както следва: C*=[(a*)2 плюс (b*)2 ] 1/2.

2.6.4. Спектрофотометрично изследване в ултравиолетовия лъч

Използвайки спектрофотометър, методът на ултравиолетовото спектрофотометрично изследване беше извършен съгласно Регламент за изпълнение № 299/2013 на Комисията [18].

2.6.5. Метод Rancimat

Според Lalas et al. [19], методът Rancimat е използван за тестване на окислителната стабилност на пробите от зехтин. По-конкретно, реакционните съдове на Rancimat 743 (Metrhom LTD, Herisau, Швейцария) бяха напълнени с около 3 g от всеки зехтин. Избраните параметри бяха температура 90 ◦C и въздушен поток от 15 L/h. Точката, когато скоростта на окисляване се променя бързо и създава силна инфлексна точка на кривата на окисление, е известна като индукционно време и е представена от стойността на индекса на стабилност на зехтина. Това беше индукционният период (IP), който беше предоставен в часове. Освен това тази формула беше използвана за изчисляване на фактора на защита (PF): PF=(IP с антиоксидант)/(IP без антиоксидант). Инхибирането на липидното окисление се показва от защитен фактор, по-голям от единица, а антиоксидантната активност се подобрява от по-висока PF стойност.

2.6.6. Диференциална сканираща калориметрия

Диференциалната сканираща калориметрия (DSC) измерва температурите и топлинните потоци, свързани с преходите в материалите, като функция на времето и температурата. Тези мерки включват както количествени, така и качествени данни за физични и химични промени, включващи ендотермични или екзотермични процеси, както и промени в топлинния капацитет. DSC беше използван в това изследване за оценка на окислителната стабилност на маслото [20]. Използва се специален алуминиев съд за претегляне на 5 mg ± 0,5 mg масло. Беше добавен и празен тиган (справка). Потокът на кислород беше 20 mL/min и окислителните условия бяха програмирани в Diamond DSC (PerkinElmer Inc., Shelton, CT, USA). Пробата и еталонът бяха поставени върху DSC и термограмата беше инициирана при 40 ◦C за 1 min, последвано от 300 ◦C със скорост 10 ◦C/min. Началната температура на пика на окисление (Tmax) определя началната температура на окисляването.

2.6.7. Извличане на полифенолни съединения от обогатени маслинови масла

Извличането на полифеноли от маслиновите масла се извършва, както е описано от Kalantzakis et al. [21]. Проби от зехтин (1 g) се разтварят в 2 mL n-хексан и 2 mL 60:40 (v/v) разтвор на метанол/вода. Крайният разтвор се центрофугира при 4500 rpm за 5 минути след енергично разбъркване. Разтворимата в метанол/вода (полярна) фракция на пробите от маслиново масло беше получена и използвана както беше.

2.6.8. Общо съдържание на полифеноли

Както бе споменато по-горе, общото съдържание на полифенол (TPC) се определя с помощта на метода на Folin-Ciocalteu. TPC се изразява като mg еквиваленти на галова киселина (GAE) на Kg зехтин.

2.6.9. Дейност за отстраняване на радикали

Методът DPPH, както беше споменато по-горе, беше използван за оценка на активността за отстраняване на радикалите на полифенолите, извлечени от пробите от зехтин. Капацитетът за отстраняване на DPPH радикала се изразява като процент на инхибиране и IC50 се изчислява от активностите на почистване (проценти) спрямо концентрациите на съответната крива на пробата.

2.7. Статистически анализ

Резултатите са дадени за средната стойност и стандартното отклонение (SD) от три едновременни анализа. Използвайки IBM SPSS Statistics (Версия 26) статистически софтуерен пакет (SPSS Inc., Чикаго, Илинойс, САЩ), беше извършена еднопосочна ANOVA, за да се определи дали има някакви статистически значими разлики между средните стойности. Използвано е значително ниво на p < 0.05.

3. Резултати и дискусия

3.1. Възстановяване на полифеноли

Беше проведена водна фаза с концентриране на лецитин, където същата процедура беше използвана за възстановяване на полифеноли. Поради ниската концентрация на лецитин от 1 процент, не се произвежда мицел на повърхностноактивно вещество. От друга страна, когато имаше висока концентрация от 5 процента лецитин, това намали тяхната разтворимост във вода и доведе до образуването на две фази. Както температурата на равновесие (45 ◦C), така и съдържанието на сол (30 процента) са постоянни (трето възстановяване). Общата мицеларна фаза на трите възстановявания се изразява с помощта на колоната Total SP (Фигура 2).

Освен това, процедури за обработка с ултразвук (75 процента енергийна енергия за 60, 75 и 90 минути с импулсен цикъл от 0,5) с ултразвукова сонда бяха използвани за изследване на намаляването на размера на мицелите. Накрая, 0,5 процента от полифенолните дисперсии, възстановени чрез CPE метода, бяха добавени към маслото, за да се подобри. Този резултат може да бъде обяснен от Víctor-Ortega et al. [22], които откриха, че разтварянето на фенолни съединения върху мицелите на повърхностно активното вещество става наситено при по-високи концентрации на повърхностноактивното вещество и задържането на полифенолите намалява. В допълнение, според Sliwa и Sliwa [23], когато концентрацията на ПАВ е под критичната мицеларна концентрация (CMC), разтворимостта на активното вещество е ниска.

В Katsoyannos et al. [24] проучване, когато се прилагат 6 процента повърхностноактивно вещество Triton X-114, CPE техниката в OMW (след отстраняване на мастните съединения) води до възстановяване, по-високо от 60 процента. В друго проучване Gortzi et al. [25], показа, че при използване на прост и последващ CPE, общото възстановяване на фенол от OMW с различни концентрации на Genapol X-080 (2, 5 и 20 процента, v/v) достига до 89,5 процента. В допълнение, Katsoyannos et al. [16], използва двуетапен CPE с 5 процента плюс 5 процента Tween 80, за да възстанови до 94,4 процента от общите феноли от OMW. И накрая, в Alibade et al. [6] проучване, лецитинът е използван като повърхностно активно вещество, докато CPE е използван за възстановяване на фенолни съединения от отпадъци от винена утайка (WSL). Фазите, богати на повърхностно активно вещество, показват силна антиоксидантна активност. Техните открития показват, че CPE и лецитинът могат да се използват за успешно отделяне на полифеноли от WSL.

3.2. Обогатяване на маслиново масло с полифеноли от отпадъчни води от маслиново масло

Наблюдавана е промяна в органолептичните свойства на мицеларните дисперсии след обогатяване с 0.5 процента w/v (мътност). Тази модификация доведе до окончателния избор на 3 процента обогатяване с лецитин. За постигане на по-добри резултати първото възстановяване се комбинира с второто и третото. Освен това обработката с ултразвук се оказа успешна за намаляване на мицеларните дисперсии. Петролната система реагира отрицателно на количества от 1% и 5%. След няколко часа обогатяване, утайката се вижда в маслените проби.

Първоначалната проба беше подложена на метода CPE, което доведе до спадане на концентрацията на полифенол от 3448 mg на 346 mg GAE/Kg (Фигура 3). На молекулярно ниво намаляването на броя на водородните връзки между полифенолите и водата позволява включването на полифеноли в мицела за сметка на неговото разтваряне [26]. След това мицелите се третират с ултразвук и метанол за извличане на полифенолите, повишавайки съдържанието на полифенол до 1562 mg GAE/Kg. Крайната концентрация на полифеноли е 504 mg GAE/Kg (след обработка с ултразвук), което показва, че намаляването на мицеларната дисперсия води до спад в концентрацията на общите полифеноли [27]. Освен това, продължителното ултразвуково време кара частиците да се разтварят в разтворителя, намалявайки стойността на TPC [28].

【За повече информация: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】