Разработване на многофункционален козметичен крем с биоактивни материали от Streptomyces

Рам Хари Дахал1 , Туан Ман Нгуен1,2, Донг Сеоп Шим3, Джун Йънг Ким4, Джангюл Лий4 и Джайсу Ким1,*

Резюме:Все повече се използват различни козметични продукти с една единствена функция, но козметиката с многофункционални дейности остава ограничена. Имахме за цел да разработим многофункционален козметичен крем сантиоксидант, антитирозиназни, против стареене и антимикробни дейности. Антимикробните дейности се извършват по метода на дисковата дифузия. Клетъчната токсичност и клетъчната пролиферация бяха оценени в 96-ямкова плака с различни клетъчни линии като HaCaT, RAW264.7, CCD-986Sk, B16F1 и B16F10. Инхибирането на гъбичната тирозиназа, инхибирането на еластазата и 1,1-дифенил-2-пикрилхидразил (DPPH) активностите за отстраняване на радикали бяха оценени и беше изчислено IC50. Мезопорестите силициеви частици бяха синтезирани с помощта на Pluronic P123 и тетраетил орто-силикат (TEOS). Снимките на лицето са заснети от VISIA-CR (Система за изображения на лицето за клинични изследвания). Грапавостта на изображението беше анализирана от софтуера PRIMOS, а яркостта на изображението беше анализирана от Chromameter CR-400. Суровият продукт от щам T65 инхибира различни човешки патогенни бактерии като Bacillus subtilis, Escherichia coli, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus epidermidis. IC50 на суровия продукт Т65 за активността на гъбена тирозиназа, еластаза и DPPH радикали са 58,73, 14,68 и 6,31 ug/mL, съответно. Суровият продукт T65 пролиферира колаген тип I в клетки CCD-986Sk до 145,91 процента ± 9,11 процента (средно ± SD; средно за 24, 48 и 72 часа) при 250 pg/mL. Синтезираните мезопорести частици (SBA-15) потвърдиха устойчивото представяне чрез контролно освобождаване за три дни. Формулиран функционален козметичен крем, съдържащ T65 вграден SBA-15, значително намалява грапавостта на кожата с 4,670 процента и увеличава яркостта на кожата с 0,472 процента след прилагане в продължение на 4 седмици. Суровият продукт Т65 инхибира както грам-положителните, така и грам-отрицателните патогени. Синтезирана мезопореста частица, SBA-15, потвърди, че физиологично активното вещество е освободено в състояние на устойчиво освобождаване. Суровият продукт T65 показа безупречно антимикробно действие,антиоксидант, анти-стареене и избелващи дейности с нецитотоксични ефекти върху различни клетъчни линии, свързани с човешката кожа.

Ключови думи: антиоксидант; цитотоксичност; анти-тирозиназа; против стареене; антимикробно; мезопорести силициеви частици; Козмецевтични състави; естетическо приложение

cistanche изгубена империя билкисъщо има aефект на избелване на кожата.

1. Въведение

Кожата е най-големият орган и външна обвивка на човешкото тяло. Визуалният вид на кожата позволява да се оцени възрастта, пола, здравето, привлекателността и красотата [1,2]. Козметичните продукти се използват широко за подобряване на външния вид на кожата и намаляване на стареенето на кожата. В допълнение, локалното приложение на козметика показва как да се увеличи привлекателността чрез манипулиране на факторите на красотата, свързани с контраста на лицето [3,4]. Козметичната индустрия непрекъснато търси нови и естествени биоактивни материали със свойства против стареене, антиоксиданти, антитирозиназа и антимикробни свойства за козметични формулировки за подобряване на подходите за грижа за кожата [5,6].

Стареенето на кожата е сложен биологичен процес, причинен от различни вътрешни и външни фактори, които водят до физиологична дисфункция и загуба на структурната цялост на кожата. Вътрешното стареене, обикновено известно като естествено стареене (хронологично стареене) на кожата, е свързано с хормонални промени въз основа на възрастта, докато външното стареене е свързано с движение на мускулите, замърсяване, никотин, излагане на слънчева радиация, кофеин, температура, начин на живот като като диета (хранене), липса на сън, стрес и други здравословни състояния [7–9]. Еластинът помага на кожата да се върне в първоначалното си положение след движение, докато еластазата, произведена в ацинарните клетки, разгражда еластина и води до стареене на кожата [9]. Антиеластазата инхибира еластазата и запазва еластина в първоначалното му състояние, което предотвратява стареенето на кожата. Козметични продукти или продукти за грижа за кожата със свойства против стареене влияят положително на стареенето на кожата [10–13].

Свободните радикали обикновено се генерират по време на клетъчния метаболизъм. Реактивните кислородни видове (ROS) и реактивните азотни видове (RNS), като анионен радикал, супероксид, пероксид, хидроксилен радикал, азотен оксид (NO), пероксинитрит и хипохлорна киселина са отговорни за окислителното увреждане на клетките, липидите, протеините, и ДНК, което води до атеросклероза, карциногенеза, сърдечно-съдови заболявания, клетъчно стареене, хронично възпаление, диабет, хипертония, мутагенеза, невродегенерации, ревматоиден артрит, инсулт, септичен шок и други дегенеративни заболявания [7,14–17]. Антиоксидантите предотвратяват окисляването на протеини и генерирането на ROS и RNS, което може да намали увреждането на свободните радикали в нормалните тъкани чрез борба с оксидативния стрес [17–19].

Кожата произвежда тъмен пигмент, известен като меланин. Производството на меланин предпазва кожата от UV-индуцирано увреждане [9]. Въпреки това свръхпроизводството и натрупването на меланин причинява кожна хиперпигментация, което води до естетични усложнения като мелазма, лунички, сенилни лентигини, невус и ефелис ​​[9,20]. Тирозиназата е гликопротеин, намиращ се в мембраните на меланозомите, които са отговорни за биосинтезата на меланин чрез хидроксилиране на l-тирозиназа до 3,4-дихидроксифенилаланин (l-DOPA) и последващо окисление на l-DOPA до допахинон [21]. Поради спонтанната полимеризация допахинонът накрая се превръща в меланин [22]. Свръхпроизведеният меланин трябва да се контролира, за да се поддържа целостта на кожата. Ето защо откриването на нови инхибитори на тирозиназата за разработването на козмецевтични състави предизвика значителен интерес [23–25].

Антимикробните консерванти се добавят към козметичните продукти за поддържане на микробиологичната чистота през целия период на тяхното приложение [26]. Вместо да се използват козметични консерванти като метилпарабен, естествените антимикробни съединения с други функции са по-добри и по-полезни за човешкото здраве [27–29]. Вторичните метаболити, изолирани от бактериални ресурси, могат да имат както консервиращи, така и антимикробни свойства, които инхибират колонизацията на бактериални патогени (Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus aureus) в кожата [9,26,28].

Биоактивните съединения, произведени от почвени или морски бактерии, особено актинобактерии, са неизползвани и все още неизследвани [23,30]. Различни биоактивни съединения, които са приложими в козмецевтичната и козметична индустрия, включително тези със свойства против стареене, антиоксиданти, антитирозиназа, антимикробни и нецитотоксични свойства, имат голям потенциал за нови приложения.

Има множество изследвания върху биоактивни материали, изолирани от растения, които понастоящем се използват в козмецевтични формулировки, но са налични много малко изследвания върху биоактивни материали от бактерии [9,21,24–27,31]. Това проучване имаше за цел да оцени козмецевтичния потенциал на екстракти от етил ацетат от бактериален щам Streptomyces sp. T65 за антиоксидантни, против стареене, против тирозиназа и антибактериални действия и всякакви цитотоксични ефекти върху различни миши и човешки клетъчни линии. В допълнение, ние имахме за цел да синтезираме мезопорести силициеви частици. И накрая, основната цел на това проучване беше да се разработи крайният козметичен продукт за локално приложение, като се използва биоактивен материал, извлечен от почвени микроорганизми.

2. Материали и методи

2.1. Реактиви, клетъчни линии и оборудване

Всички използвани разтворители са с аналитичен клас. B16-F10 меланомна клетъчна линия, B16-F1 миша меланомна клетъчна линия и човешка кератиноцитна клетъчна линия (HaCaT) бяха закупени от American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Модифицираната среда на Eagles на Dulbecco (DMEM), пеницилин-стрептомицин и топлинно инактивиран фетален говежди серум (HI FBS) бяха закупени от Gibco (Thermo Fisher Scientific Korea Ltd., Сеул, Южна Корея). Комплектът за броене на клетки-8 (CCK-8) е закупен от Dojindo (Кумамото, Япония). Миша макрофагова клетъчна линия RAW264.7 и CCD-986Sk човешки фибробласти бяха закупени от Корейската банка за клетъчни линии (Сеул, Южна Корея). Липополизахарид (LPS, Escherichia coli, серотип O11:B4), сулфаниламид, нафтил етилендиамин дихидрохлорид, тирозиназа от гъби, свинска панкреатична еластаза, l-тирозин, аскорбинова киселина, арбутин, N-Succ-(Ala)3-p-нитроанилид , 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолиев бромид (MTT), колаген тип I, Tween 20, тетраметилбензидин (TMB) ), тетраетил ортосиликат (TEOS), pluronic P-123 (поли(етилен гликол)-блок-поли(пропилен гликол)-блок-поли(етилен гликол); PEG-PPG-PEG) и -меланоцит -стимулиращ хормон (-MSH) са закупени от Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 1,1-дифенил-2-пикрилхидразил (DPPH) и олеанолова киселина са закупени от Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). COL1A1 (Колаген, тип I, алфа 1) първично антитяло и вторично антитяло, конюгирано с HRP (пероксидаза от хрян) бяха закупени от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Четец на микроплаки SpectraMax 340PC384 (Molecular Devices, Сънивейл, Калифорния, САЩ) беше използван за 96-отчитане на ямкови плаки.

2.2. Патогенни бактериални щамове

Staphylococcus epidermidis KACC 13234 и Pseudomonas aeruginosa KACC 10185 са закупени от Корейската селскостопанска колекция (KACC, Jeonju, Южна Корея); Bacillus subtilis KEMB 51201-001, Escherichia coli KEMB 212-234 и Staphylococcus aureus KEMB 7301-069 бяха получени от Korea Environmental Microorganisms Bank (KEMB, Suwon South Korea); и Propionibacterium acnes KCTC 3314 е закупен от Корейската колекция за типови култури (KCTC, Jeongeup, Южна Корея).

2.3. Изолация и консервация

Бяха събрани различни почвени проби от рекултивирани пасища в Hwaseong (37◦16′10" N 126◦45′43" E) и гората на университета Kyonggi (37◦18′1" N 127◦2′20" E) в Корея. Бактериите бяха изолирани с помощта на метод, описан по-рано [9]. Колониите бяха набраздени върху R2A плаки всяка 1 седмица за краткотрайно съхранение и съхранявани при -80 ◦C като суспензия в R2A бульон, допълнен с 20 процента (v/v) глицерол за дългосрочно съхранение.

2.4. Скрининг, идентификация и филогенетична позиция на изолирани щамове

Скринингът за козметични и антимикробни активности на изолирани щамове беше завършен, както е описано по-горе [9]. Бактериите, имащи функции, бяха идентифицирани с помощта на 16S rRNA генно секвениране. Геномна ДНК на щамове се екстрахира с помощта на комплект InstaGene Matrix (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, САЩ) и генът 16S rRNA се амплифицира чрез PCR, използвайки универсалния бактериален праймер 27F и 1492R [32]. PCR продуктът се пречиства с многоекранна филтърна плака (Millipore Corp., Bedford, MA, USA) и се секвенира с ДНК анализатор Applied Biosystems 3770XL, използвайки комплект за секвениране на цикли BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, Калифорния, САЩ). Почти пълна последователност, съобразена със софтуера SeqMan (DNASTAR Inc., Madison, WI, USA). Най-близкият щам от изолирани функционални щамове беше идентифициран с помощта на EzBioCloud [33] и базата данни NCBI GenBank [34]. Свързани 16S rRNA последователности бяха получени от GenBank и филогенетичният анализ беше извършен с помощта на MEGA7 [35].

2.5. Бактериална култура

P. acnes се култивира чрез инкубиране при 37 ◦C в продължение на 3-4 дни анаеробно в анаеробен бульон на Schaedler (Oxoid). За анаеробната култура беше използван BBL анаеробен съд с GasPak EZ Gas Generating Container System (Becton Dickinson, NJ, USA). S. epidermidis и S. aureus се култивират в TSB (Tryptic соев бульон) среда (Oxoid) при 37 ◦C за 24 часа аеробно. E. coli, P. aeruginosa и B. subtilis се култивират в среда LB (Luria-Bertani) (Oxoid). Изолирани бактериални щамове се култивират в R2A при 28 ◦C в продължение на 4–5 дни.

2.6. Ферментация

За процеса на ферментация, инокулумът се приготвя в R2A бульон при 28 ◦C за 4–5 дни при 150 pm. Щам T65 беше ферментирал с помощта на 1-2 процента инокулум в среда ISP2 (International Streptomyces Project 2) при 28 ◦C за 1 седмица при 140 pm.

2.7. Екстракция

Събраната културална среда се центрофугира при 11, 305 × g за 20 минути при 4 ◦ C с центрофуга с голям капацитет от 1736R (LABOGENE, Сеул, Корея). Супернатантата на културата се филтрира с филтърна хартия с размер 150 mm (Whatman 1001-150, GE Healthcare, Maidstone, UK), за да се елиминират клетъчните остатъци и се концентрира с ротационен изпарител при 40 °C. След това концентрираният суров продукт се екстрахира два пъти с равен обем, като се използват пет различни разтворителя (n-хексан, диетилов етер, дихлорометан, хлороформ и етилацетат). Установено е, че етилацетатът е най-добрият разтворител и са проведени допълнителни анализи с помощта на екстракт от етилацетат. Органичният слой се отделя с делителна фуния и се изпарява до сухо. Накрая, изсушеният суров продукт се разтваря в метанол за по-нататъшна оценка.

екстракт от цистанче

2.8. Събиране на активни фракции чрез препаративна HPLC (Prep-HPLC)

Активните фракции от суровия екстракт от култура на Т65 бяха събрани с помощта на препаративна HPLC (Agilent 1200 серия). Shim-pack-PREP-ODS (K) C18 обратна колона (30 mm id × 25 cm) с размер на частиците 15 μm беше използвана като неподвижна фаза. За подвижната фаза се използват 0,1 процента HCHOOH вода (разтворител А) и ацетонитрил (разтворител В). Използвани са концентрации на разтворител В от 10 процента до 100 процента от 0 минути до 60 минути и 100 процента от 60 минути до 75 минути. Скоростта на потока беше 15 mL/min. Използван е многовълнов детектор (MWD) с 208, 230, 254 и 280 nm. Събраните фракции от 14 минути до 21 минути се изпаряват до сухо и се разтварят в метанол (суров продукт Т65) за по-нататъшна оценка.

2.9. Клетъчна жизнеспособност на HaCaT клетка

Клетъчната жизнеспособност на HaCaT клетките беше определена с CCK-8 (Cell Counting Kit-8) анализ съгласно инструкциите на производителя. Клетките HaCaT се посяват в 96-плаки с ямки при 104 клетки на ямка и след това се инкубират при 37 °C в продължение на 24 часа в среда на Dulbecco, модифицирана на Eagles (DMEM), съдържаща 10 процента фетален волски серум (FBS). Клетките се третират с различни концентрации на суров продукт Т65 (10 mg/mL, 1 mg/mL, 100 ug/mL, 10 ug/mL, 1 ug/mL, 100 ng/ml и 1 ng/mL) и се инкубират при стайна температура в продължение на 2 часа във влажна атмосфера, съдържаща 5 процента CO2 с добавяне на 10 μL реагент CCK-8. Абсорбцията на реакционната смес се измерва със спектрофотометър с микроплака при 450 nm и се изчислява процентът на клетъчна жизнеспособност.

2.10. Оценка на антиоксидантните активности

2.10.1. Оценка на токсичността в клетки RAW264.7

Клетките RAW264.7 се поддържат в DMEM, съдържащ 10 процента FBS, 100 U/mL пеницилин и 100 ug/mL стрептомицин при 37 ◦C в 5% CO2 инкубатор. Клетките RAW264.7 се посяват в 96-ямкова микротитърна плака с плоско дъно при плътност от 104 клетки на ямка с различни концентрации (0–1 mg/mL) от суровия продукт Т65 и се инкубират при 37 ◦C за 24 h в инкубатор с 5 процента CO2. След 24 часа инкубация, клетките се промиват два пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и към всяка ямка се добавят 190 μL прясна среда и 10 μL работен разтвор на МТТ (5 mg/mL) и след това плаката се инкубира при 37 ◦C за 4 часа в инкубатор с 5 процента CO2. След това супернатантата се отстранява и образуваните формазанови кристали се разтварят чрез добавяне на 150 μL DMSO (диметил сулфоксид) във всяка ямка за 10 минути при 37 ◦C в 5% CO2 инкубатор. Интензитетът на разтворените формазанови кристали се определя количествено с помощта на четец на микроплаки при 570 nm.

2.10.2. Определяне на азотен оксид

Клетките RAW264.7 (105 клетки/mL) бяха предварително третирани с различни концентрации на суров продукт T65 (15.5–125 ug/mL) за 30 минути, последвано от стимулация с 1 ug/mL LPS за 24 часа. Концентрацията на NO, освободен от клетките, се определя с реактив на Griess, като се използва стандартната крива на NO2– [36]. Сто микролитра супернатант на културата се инкубират със 100 μL реагент на Griess (смес от N-1-нафтил етилендиамин дихидрохлорид (NEDHC) и сулфаниламид) при стайна температура за 20 минути на тъмно. Абсорбцията се измерва при 540 nm.

2.10.3. DPPH тест за отстраняване на свободни радикали

Дейностите за отстраняване на свободните радикали от DPPH се провеждат съгласно описан по-горе метод [9]. Суровият продукт от екстракт от култура Т65 се разрежда до концентрации 600, 200, 100, 20 и 4 ug/mL в метанол. Реакционната смес от 180 μL беше направена с 90 μL от 0,1 mM DPPH (разтворен в МеОН) и 90 μL от разтвори на проби с различни концентрации (Таблица S1). Тестовите реакции се смесват старателно в 96-плаки с ямки, инкубират се при 37 ◦C за 30 минути и абсорбцията се измерва при 516 nm със спектрофотометър. Процентът на инхибиране на DPPH се изчислява, както следва:

Инхибиране (процент)=[1 − (ODexp − ODcon) / (ODstd − ODbln)] × 100 (1)

където ODexp е абсорбцията на експерименталната проба; ODcon е абсорбцията на контролата; ODstd, абсорбцията на стандарта; и ODbln, абсорбцията на празната проба.

2.11. Оценка на дейностите против стареене

2.11.1. Оценка на цитотоксичността в CCD-986Sk клетки

Клетъчната цитотоксичност на различни концентрации (0–1 mg/mL) на суровия продукт Т65 във фибробластни клетки на човешка кожа (CCD-986Sk) се определя чрез МТТ анализ, както е описано по-рано за МТТ анализ на RAW264.7 клетки.

2.11.2. Пролиферация на човешки фибробласти с помощта на CCD-986Sk клетки

Клетъчната пролиферация на човешки дермален фибробласт (HDF) беше определена в CCD{{0}}Sk клетки с помощта на CCK-8 анализ. CCD-986Sk клетки се посяват в 96-плаки с ямки при 5 × 103 клетки/ямка и след това се инкубират при 37 ◦C за 24 часа в DMEM, съдържащ 10 процента FBS. Клетките се третират с различни концентрации на суров продукт T65 (0–1 mg/mL) и се инкубират при стайна температура в продължение на 2 часа във влажна атмосфера, съдържаща 5 процента CO2 с добавяне на 10 μL реагент CCK-8. Абсорбцията на реакционната смес се измерва с четец на микроплаки при 450 nm и процентът на жизнеспособните клетки се определя в сравнение с абсорбцията на нетретираните клетки.

Cistanche е против стареене.

2.11.3. Анализ на синтеза на колаген тип I

Синтезът на колаген тип I беше анализиран чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). CCD-986Sk клетки се посяват в 96-плаки с ямки при плътност 5 × 103 клетки/ямка в DMEM, съдържащ 10 процента FBS, и се инкубират при 37 ◦ C за 24 часа. Различни концентрации на суров продукт Т65 (31,25–25{{30}} pg/mL) се добавят в среда без FBS за 24 часа. След това, 100 μL културална среда и колаген тип I се добавят в покрити с колаген 96-ямкови плаки и се инкубират при 37 ◦C за 24, 48 и 72 часа. Всяка ямка се промива с 0,05 процента буфериран с фосфат физиологичен разтвор с 0,1 процента Tween 20 (PBST) и се добавя първичното антитяло COL1A1 и се инкубира в продължение на 1 час. Отново ямките се промиват с 0.05 процента PBST и се добавя вторично антитяло, конюгирано с HRP (пероксидаза от хрян) и се инкубира в продължение на 1 час. Всяка ямка се промива с 0.05 процента PBST и се добавя TMB (тетраметилбензидин). След получаване на желания интензитет на цвета (син), реакцията се прекратява чрез добавяне на 0,5 N H2SO4, което оцветява разтвора в жълто. Абсорбцията се измерва при 450 nm с четец на микроплаки и се определя производството на колаген тип I.

2.11.4. Тест за инхибиране на еластаза

Активностите на инхибиране на свинската панкреатична еластаза (PPE) бяха анализирани съгласно описаната по-рано процедура [9]. Суровият продукт Т65 се разрежда до концентрации от 30{{10}}0, 1000, 500 и 100 ug/mL в метанол. Реакционната смес се приготвя с 0,2 М Tris-HCl буфер (рН 8,0), 0,5 mM N-Succ-(Ala)3-ρ-нитроанилид (SANA) като субстрат, свинска панкреатична еластаза (3,5 U/mL в 0.2 М Tris-HCl буфер; рН 8.0) и инхибитора (проба). Всяка проба беше предварително инкубирана при 37 ◦C за 15 минути и общата реакционна смес беше инкубирана при 37 ◦C за 20 минути. Абсорбцията се измерва при 400 nm. Общата реакционна смес от 150 μL се приготвя, както е показано в таблица S2. Крайните концентрации на пробата в реакционната смес бяха 300, 100, 50 и 10 ug/mL. Процентът на PPE инхибиране се изчислява с помощта на формула (1).

2.12. Оценка на избелващите дейности

2.12.1. Оценка на цитотоксичността в B16F1 клетки

Цитотоксичността на суровия продукт Т65 към B16F1 меланомни клетки се определя чрез МТТ анализ. Клетките B16F1 се посяват в 96-плаки с ямки при 104 клетки на ямка и след това се инкубират при 37 ◦C за 24 часа в DMEM, съдържащ 10 процента FBS. Клетките се третират с различни концентрации на суров продукт T65 (0–1 mg/mL) и се инкубират при стайна температура в продължение на 2 часа във влажна атмосфера, съдържаща 5 процента CO2. Абсорбцията на реакционната смес се измерва със спектрофотометър с микроплака при 450 nm и се изчислява процентът на клетъчна жизнеспособност.

2.12.2. Инхибиране на синтеза на меланин в клетки B16F10

Клетките B16F10 бяха предварително третирани с -MSH в 6-плаки с ямки при 105 клетки на ямка и инкубирани при 37 ◦C за 24 часа в DMEM, съдържащ 10 процента FBS, за насърчаване на синтеза на меланин. Клетките се инкубират с различни концентрации на суров продукт Т65 (31,25–125 ug/mL) и 100 ug/mL арбутин като положителна контрола в присъствието или отсъствието на -MSH за 48 часа. Наблюдава се инхибиране на синтеза на меланин в меланомни клетки B16F10.

Cistanche инхибира образуването на меланин.

2.12.3. Тест за инхибиране на гъбена тирозиназа

Инхибиращите активности на гъбичната тирозиназа се определят, както е описано по-горе [9]. Суровият продукт Т65 се разрежда до концентрации от 3000, 1000, 500 и 100 ug/mL в метанол. Реакционната смес се приготвя с 0,1 М калиев фосфатен буфер (рН 6,8), 3 тМ разтвор на l-тирозин [разтворен в DW (дестилирана вода)] и 2000 U/mL гъбена тирозиназа (разтворен в 0,05 М калиев фосфатен буфер, рН 6,8 ; Сигма) в 96-ямкови плаки. Общата тестова смес от 150 μL (120 μL фосфатен буфер, 10 μL l-тирозин, 15 μL разтвор на пробата и 5 μL гъбена тирозиназа; Таблица S3) се инкубира при 37 ◦C за 10 минути и абсорбцията се измерва при 475 nm. Крайните концентрации на пробата в реакционната смес бяха 300, 100, 50 и 10 ug/mL. Стандартът беше без разтвор на пробата, контролата беше без l-тирозин, а празната проба беше без l-тирозин и разтвор на пробата. Процентът на инхибиране на тирозиназата се изчислява чрез прилагане на формула (1).

2.13. Анализ на аминокиселините

Свободната аминокиселина на суровия продукт Т65 се определя чрез метода GC-FID (газова хроматография – пламъчно йонизационен детектор) в Корейския полимерен тестов и изследователски институт (Koptri). За метода GC-FID използваната машина беше Agilent 6890N GC-FID; колона, ZB-AAA (10 m × 0,25 mm); температура на инжекционната част, 250 ◦C; инжекционна колона, 2 μL; съотношение на разделяне, 5:1; температурен режим, 110 ◦C → 32 ◦C/min → 320 ◦C; детектор, FID @ 320 ◦C; носител, азотен газ, 1.5 mL/min; производител, Phenomenex; аминокиселинен стандарт; и концентрация 200 μmol/L.

Съставните аминокиселини на суровия продукт T65 се определят чрез метода GC-FID (газова хроматография – пламъчно йонизационен детектор) в Корейския полимерен тестов и изследователски институт (Koptri). За GC-FID използваната машина беше Agilent 6890N GC-FID; колона, ZB-AAA (10 m × 0,25 mm); температура на инжекционната част, 250 ◦C; инжекционна колона, 2 μL; съотношение на разделяне, 5:1; температурен режим, 110 ◦C → 32 ◦C/min → 320 ◦C; детектор, FID @ 320 ◦C; носител, азотен газ, 1.5 mL/min; производител, Phenomenex; аминокиселинен стандарт; и концентрация 200 μmol/L.

2.14. Мастна киселина

Мастната киселина на суровия продукт T65 се определя чрез метода GC-FID (газова хроматография – пламъчно йонизационен детектор) в Корейския полимерен тестов и изследователски институт (Koptri). За GC-FID използваната машина беше Agilent 6890N GC-FID; колона, Supelco SP–2500 (100 m × 0,25 mm × 0,20 μm); температура на инжекционната част, 250 ◦C; инжекционна колона, 1 μL; съотношение на разделяне, 50:1; температурен режим, 100 ◦C (4 min) → 3 ◦C/min → 240 ◦C (15 min); детектор, FID @ 285 ◦C; носител, азотен газ, 0.8 mL/min; производител, SUPELCO 37 Component FAME Mix; и концентрация 0,5 mg/mL.

2.15. Антимикробни дейности

Инхибирането на патогенните бактерии се извършва чрез метода на дискова дифузия. Сто микролитра култура на P. acnes при 108 CFU (образуваща колония единица)/mL се разпръскват и инкубират при 35 ◦C анаеробно в продължение на 2-3 дни върху агарови плаки на Schaedler заедно с 6 mm диск (Whatman), съдържащ 15 ug от суровия екстракт, разтворен в метанол, и се измерват зоните на инхибиране. По подобен начин, 100 μL от S. epidermidis, S. aureus, B. subtilis, E. coli и P. aeruginosa при 108 CFU/mL бяха разпръснати и инкубирани при 35 ◦C аеробно върху R2A или LBA плаки за 1-2 дни и бяха измерени зоните на инхибиране.

2.16. Синтез на мезопореста силициева частица

Индуциращият структурата полимер се разтваря в дейонизирана вода, за да се получи мицелен разтвор. Мезопорестите силициеви материали бяха синтезирани съгласно методите, описани в литературата [37]. За синтеза на мезопорести силициеви частици (SBA-15), 10 g Pluronic P123 (EO20PO70EO20, BASF Corporation, Florham Park, NJ, USA), се разтварят в 55 mL 2 М HCl, последвано от разбъркване при стайна температура температура за 30 мин. Освен това към разтвора се добавят 22 g тетраетилортосиликат (TEOS) и се разбърква допълнително в продължение на 30 минути и се поставя при 36 ◦C за 24 часа и след това се поставя в пещта, в която температурата се поддържа на 100 ◦C и се оставя за 4 дни в статично състояние. След 4 дни разтворът се промени в мътен разтвор в бутилката. Мътният разтвор се филтрува с двата слоя целулозна филтърна хартия и се промива с EtOH (два пъти) и DI (дейонизирана) вода (два пъти). Полученият филтриран прах се изсушава в конвекционна пещ при 120 °C и се поставя в муфелната пещ (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Сеул, Южна Корея). Шест проби бяха синтезирани при същите условия, но в различна партида. Трансмисионни електронни микрографии (ТЕМ) на синтезиран SBA-15 са направени в Националния университет в Сеул чрез трансмисионна електронна микроскопия (Talos L120C; FEI).

2.17. BET анализ на повърхността

Размерът на частиците на силициевия диоксид се измерва с Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Lt., Malvern, Обединеното кралство). За подготовката на пробата за BET (Brunauer–Emmett–Teller) анализ, 5 g P-123 се добавят към 76 g 2M HCl и се разбъркват при 250 rpm в продължение на 24 часа. След 24 часа, когато P-123 беше напълно разтворен, 160 mL DI (дейонизирана) вода и TEOS бяха равномерно добавени (15 mL/min) и разбъркани при 750 rpm в продължение на 24 часа. След това образуваният прах се отделя чрез филтруване и отделеният прах се поставя в напръстник и се промива със Soxhlet в продължение на 24 часа. След това се промива с DI вода и се изгаря в муфелна пещ (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Южна Корея). Проведени са BET анализи на повърхностната площ, за да се потвърди ефективността на праха, произведен чрез синтез на SBA-15. BET анализите бяха завършени от университета Инха и националния университет Чангуон.

Газовият сорбционен анализатор (Autosorb iQ, Quantachrome Instruments, Ashland, OR, САЩ) беше използван за изследване на повърхностната площ и разпределението на размера на порите на приготвени мезопорести силициеви материали. Повърхностната площ и разпределението на размера на порите бяха изчислени с помощта на софтуер ASiQwin (Anton Paar Quanta Tech Inc., Boynton Beach, FL, USA) на базата на изотерми на адсорбция-десорбция. Първичните синтезирани частици се дегазират при 300 ◦C/3h, след което изотермите на адсорбция и десорбция на N2 се измерват при температура от -196 ◦C. Многоточковият BET анализ беше приложен за изчисляване на общата повърхност.

2.18. Оценка на устойчивостта

За да се потвърди наличието на T65 в вградения SBA-15, следното представяне беше проведено, както следва: 12 g SBA-15 и 1,2 g суров продукт T65 бяха смесени в 500 mL ацетонитрил. Разтворът се разбърква в продължение на 18 часа при 30 ◦C. След филтруване сместа се филтрува и филтруваните частици се сушат в конвекционна пещ при 100 °C. За да се намери самата частица T65 в SBA-15, 1 g изсушен T65, вграден в SBA-15, се разтваря в ацетонитрил и се добавят 25 mL 3 М флуорна киселина. Сместа се разбърква при стайна температура в продължение на 24 часа, докато разтворът стане бистър. След това разтворът се филтрира и разтворът на филтрата се използва като проба. Пробите, получени от горните експерименти, се анализират чрез HPLC.

За да се определи свойството на контролирано освобождаване, 35 mL вграден SBA-15 се изсипват в 50 mL минерално масло (M3516; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) и се смесват добре. След това към сместа се добавят 50 mL DI вода и се разклаща при стайна температура в продължение на 6 часа и след това се оставя на бюрото в продължение на 12 часа. Когато течният слой беше отделен, водният слой беше изхвърлен и 1 mL маслен слой беше събран като проба за HPLC анализ. Същият експеримент се повтаря на втория и третия ден и пробата отново се анализира с помощта на HPLC.

2.19. Козметична формула и приложение

2.19.1. Формулировка и тест за стабилност

Козметичен продукт е формулиран от крем от типа емулгатор. Стабилността на козметичната формула се определя чрез съхраняване на козметичния продукт при различни температури (37, 45 и 60 ◦C), включително във фризер, хладилник и при стайна температура до 28 дни. Стабилността на козметичния крем се наблюдава през първата, втората, третата и четвъртата седмица.

2.19.2. Клинични изпитвания, доброволци и методи на приложение

Функционален козметичен крем, съдържащ суров продукт T65, беше приложен на 21 жени доброволки за определяне на подобряването на бръчките и ефикасността на избелване чрез грапавост на кожата и яркост на кожата. Всички експериментални процедури за човешко участие за това проучване бяха одобрени от Elad Institutional Review Board (IRB) (EL-P-7400). Беше получено информирано съгласие от всички отделни участници. Проведени са тестове преди прилагането на продукта, след 2 седмици и след 4 седмици. Приблизително 5 mg от козметичния продукт се прилага два пъти на ден (сутрин и вечер) върху лицето след почистване на лицето и се разнася нежно според текстурата на кожата. На доброволците не е било разрешено да използват други кремове или продукти 1 седмица преди изпитването и по време на изпитването.

2.19.3. Методи за заснемане и обработка на изображения

Снимките са заснети от VISIA-CR. Грапавостта на изображенията беше анализирана от софтуера PRIMOS (PRIMOS версия 5.8E, Canfield Scientific, Inc., Parsippany-Troy Hills, NJ, USA). Средната грапавост (Ra) и максималната дълбочина на грапавостта (Rmax) бяха изчислени по следната формула:

Ra или Rmax процент (проценти)=(стойност преди третиране − стойност след третиране)/стойност преди третиране × 100 (2)

Яркостта на изображенията беше анализирана от Chromameter CR-400. L* е параметърът на яркостта и се измерва по следната формула:

L* процент на нарастване (процент)=(стойност преди третиране − стойност след третиране)/стойност преди третиране × 100 (3)

2.20. Статистически анализ

Статистическите изчисления на стойността на IC50 бяха извършени от статистически софтуер OriginPro 8.5 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA). Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра и всички резултати бяха представени като средно ± SD от три отделни експеримента. Данните бяха анализирани чрез t-тест на независима проба, еднопосочен анализ на дисперсията (еднопосочен ANOVA), последван от post-hoc теста на Tukey, използвайки OriginPro 8.5. Разликите се считат за значими при p <>

3. Резултати и дискусии

3.1. Изолиране, селекция и филогенеза на избрани активни щамове

От събраните почвени проби са изолирани общо 2285 щама бактерии. Резултатите от скрининга показват, че 102 щама бактерии имат функции, приложими към козмецевтичните продукти (Таблица S4). Въз основа на първичен скрининг Streptomyces sp. Установено е, че T65 има по-висока активност за всички козметични приложения, а именно антиоксидантна, антиеластазна, антитирозиназна и антимикробна активност. И накрая, щамът T65 беше избран за допълнителна оценка, за да се идентифицира потенциалното му приложение в козмецевтиката. Филогенетичният анализ показа, че щам T65 образува клад с Streptomyces bungoensis DSM 41781T (най-близкият щам на базата на 16S rRNA генна последователност) със силна стойност за първоначално зареждане (Фигура S1).

3.2. Откриване и събиране на биоактивен материал

Смесени биоактивни материали от екстракт от етилацетатна култура T65 бяха събрани от Prep-HPLC. Биоактивните материали бяха измерени при 208, 230, 254 и 280 nm с детектори. Фракциите се събират въз основа на времето (от 14 минути до 21 минути). Събраните фракции се изпаряват до сухо и се разтварят в метанол (суров продукт Т65) и се използват за всички оценки, включително антимикробни активности.

3.3. Цитотоксичност в HaCaT клетка

Клетъчната жизнеспособност в човешката кератиноцитна клетъчна линия (HaCaT клетка) остава незасегната от суровия продукт Т65 до 10 mg/mL. От друга страна, клетъчната жизнеспособност се повишава в зависимост от дозата, когато се прилагат концентрации от 10 ng/mL до 10 mg/mL от суровия продукт T65 (Фигура S2). Този обхват на концентрация води до повече от 100 процента клетъчна жизнеспособност, което показва, че насърчава пролиферацията на HaCaT клетки и следователно е нетоксичен за HaCaT клетъчната линия.

3.4. Антиоксидантни дейности

3.4.1. Цитотоксичност в клетка RAW264.7

Цитотоксичността на суровия продукт Т65 беше оценена чрез клетъчна жизнеспособност в RAW264.7 макрофаги чрез метода на МТТ анализ. Суровият продукт Т65 не показва цитотоксичен ефект върху клетъчни линии RAW264.7.

Напротив, суровият продукт Т65 спомага за пролиферацията на RAW264.7 клетки по дозозависим начин, когато се третира с 13,5 до 1000 ug/mL. Когато се използва 1000 ug/mL суров продукт Т65, клетъчната жизнеспособност на клетки RAW264.7 е 118.7 процента (р <0.05). тези="" резултати="" показват,="" че="" суровото="" съединение="" т65="" е="" нетоксично="" до="" 1="" mg/ml="" и="" може="" да="" се="" използва="" в="" козмецевтични="">

3.4.2. Инхибиране на производството на азотен оксид (NO).

Реактивът на Griess се използва за определяне на нивата на NO. За да се определи инхибирането на NO, RAW264.7клетки бяха третирани с 1 ug/mL LPS (липополизахарид) заедно с различни концентрации на Т65 суров продукт. Клетките RAW264.7 се активират от LPS и производството на NO се измерва като концентрация на нитрит в културалната среда. В сравнение само с LPS, суровият продукт T65 значително (p < 0.001)="" инхибира="" концентрацията="" на="" нитрит="" в="" lps-стимулираните="" raw264.7="" клетки="" по="" зависим="" от="" концентрацията="" начин,="" когато="" се="" използва="" от="" 15,5="" до="" 125="" ug/ml="" (фигура="" 2).="" макрофагите="" са="" lps-подобна="" експресия="" на="" индуцируема="" no="" синтаза="" (inos)="" чрез="" сигнализиране="" на="" клетъчно="" активиране="" чрез="" рецептори="" [38].="" lps="" е="" активатор="" на="" макрофагите="" и="" играе="" важна="" роля="" в="" производството="" на="" no="" в="" клетки="" на="" бозайници="" [39].="" no="" е="" свободен="" радикал,="" произведен="" от="" имунокомпетентни="" клетки="" като="" макрофаги="" [40].="" производството="" на="" no="" има="" фагоцитен="" ефект="" върху="" макрофагите.="" по="" този="" начин,="" макрофагова="" клетъчна="" линия="" raw264.7="" беше="" избрана="" за="" антиоксидантен="" анализ.="" дълго="" време="" се="" обръща="" значително="" внимание="" на="" търсенето="" на="" естествени="" антиоксиданти,="" които="" да="" инхибират="" производството="" на="" no="" [41].="" при="" 125="" ug/ml,="" суровият="" продукт="" t65="" достатъчно="" намалява="" нивата="" на="" no="" с="" 57,4="" процента="" в="" сравнение="" с="" no,="" произведен="" от="" 1="" ug/ml="" lps.="" въз="" основа="" на="" инхибирането="" на="" no,="" произведен="" в="" lps-индуцираната="" raw264.7="" макрофагова="" клетъчна="" линия,="" екстрактът="" от="" култура="" t65="" може="" да="" се="" счита="" за="" мощен="">

DPPPHrRaaddiciacal lsScacvaveennggininggpAerccteivnitayges при различни концентрации и IC50 стойност на суровия продукт T65 са дадени в таблица S5. Аскорбиновата киселина (витамин С) се използва като стандарт, тъй като се използва в лосиони, кремове, серуми и пластири, за които е добре известно, че имат мощни антиоксидантни действия за локално приложение [42]. Установено е, че IC50 за дейностите по отстраняване на радикалите на DPPH за вторичните продукти на витамин С и Т65 е съответно 5,01 и 6,31 ug/mL (Фигура 3).

Има само няколко проучвания за антиоксидантната активност на бактериални изолати в сравнение с тези от растителни материали и повечето проучвания са фокусирани върху добре установени растителни продукти [43–49]. Концентрация от 10 ug/mL продукт е в състояние да улови 68,66 ± 2,83 процента свободен радикал DPPH. IC50 на суровия продукт T65 е почти сравним с този на най-силния антиоксидант витамин С, което показва, че той може да се използва като антиоксидантно средство във формулата на козмецевтични продукти.

3.5.1. Цитотоксичност в CCD-986Sk клетки

Цитотоксичността на суровите съединения на Т65 в клетки от човешки дермални фибробласти (HDF) беше оценена в CCD-986Sk клетъчна линия с помощта на МТТ анализ. Когато беше доставена концентрация на суровия продукт Т65 от 0 до 1 mg/mL, HDF клетките пролиферираха по дозозависим начин до концентрация от 500 ug/mL. Този резултат показва, че суровите съединения от Т65 са нецитотоксични за HDF клетките. Установено е обаче, че концентрация над 1 mg/mL е цитотоксична и само 81,34 процента от клетките оцеляват в сравнение с контролата (Фигура 4).

3.5.2. Пролиферация на HDF

Пролиферацията на HDF клетки се определя с помощта на CCD{{0}}Sk клетъчна линия. Т65 суровият продукт пролиферира HDF клетките по зависим от концентрацията начин от 0 до 500 ug/mL (Фигура 5). Въпреки това, той е цитотоксичен при концентрация от 1 mg/mL. Растежът на човешки дермални епителни клетки потвърди способността за подобряване на бръчките чрез промяна в първично култивираните клетки, изолирани от човешки дермални клетки и секретиран колаген [50,51].

3.5.3. Синтез на колаген тип I

Синтезът на колаген тип I беше открит чрез ELISA. Суровият продукт на T65 при 250 pg/mL повишава концентрацията на колаген тип I по дозозависим начин до 145,91 процента ± 9,11 процента (средно ± SD; средно от 24, 48 и 72 часа). Резултатът от три експеримента на 24, 48 и 72 часа показа синтеза на колаген тип I (Фигура 6). По този начин секрецията на колаген от дермални клетки, придружена от растеж на човешки дермални епителни клетки, потвърди способността за подобряване на бръчките на съединенията Т65.

3.6. Избелващи дейности

3.6.1. Цитотоксичност в B16F1 клетки

Резултатът от цитотоксичността на суровия продукт Т65 върху меланомни клетки B16F1 чрез МТТ анализ е показан на Фигура 8. Резултатът от инкубацията на суровия продукт Т65 в клетки B16F1 показва нетоксичен ефект до концентрация от 1 mg/mL. Клетките B16F1 пролиферират по дозозависим начин до концентрация от 62,5 ug/mL, но значително (p < 0.05)="" зависимо="" от="" дозата="" намаление="" на="" клетъчната="" жизнеспособност="" е="" оценено="" от="" 125="" до="" 1000="" ug/ml.="" въпреки="" това,="" при="" концентрация="" от="" 1="" mg/ml,="" се="" наблюдават="" 99,12="" процента="" ±="" 4,16="" процента="" жизнеспособни="" клетки="" (фигура="" 8).="" експерименталните="" резултати="" показват,="" че="" етилацетатният="" екстракт="" от="" култура="" на="" щам="" t65="" не="" е="" цитотоксичен="" за="" клетъчната="" линия="" на="" меланома="" b16f1="" и="" може="" да="" се="" използва="" във="" формулата="" на="" козметични="" продукти="" за="" избелване="" на="" човешка="">

3.6.2. Инхибиране на синтеза на меланин в клетки B16F10

За потвърждение на избелващия ефект, B16F10 клетки, клетъчна линия, която секретира и произвеждамеланин в клетките. За насърчаване на синтеза на меланин, B16F10 беше допълнен с 1 ug -MSH. Като положителна контрола се използва арбутин (100 ug/mL; комерсиален избелващ агент). Микроскопското наблюдение на този експеримент показа почти пълно инхибиране на меланина чрез прилагане на 125 ug/mL екстракт от култура T65 за 48 часа (Фигура 9A, B). Този експеримент доказа, че екстрактът от култура T65 има потенциала да инхибира синтеза на меланин в зависимост от дозата и може да се използва като избелващ агент за формулирането на козметични продукти за локално приложение.

3.7. Мезопорести силициеви материали

Мезопорестият материал е материал, съдържащ пори с диаметър от 2 до 50 nm според номенклатурата на IUPAC (Международен съюз за чиста и приложна химия) и следователно мезопорестият силициев диоксид е материал от силициев диоксид, който има пори с диаметър 2–50 nm. Този материал е докладван през 70-те години на миналия век първо в патенти на САЩ, но не е добре забелязан в свързаните области и по този начин подобен материал е независимо проучен и синтезиран от Япония отново през 1990 г. [69]. По-подробни изследвания бяха последвани от Mobil Corporation Laboratories и те нарекоха този материал MCM (Mobil кристален материал), с примери като MCM-41 или MCM-48, чийто диаметър на мезопорите варира от 2 до 6 nm [70,71]. Друга изследователска група в Калифорнийския университет, Санта Барбара, успя да синтезира мезопорест силициев диоксид с по-голям размер на порите (5–30 nm) 6 години по-късно и го нарече SBA (аморфен материал на Санта Барбара) -15 [72] . Мезопорният силициев диоксид първоначално е проектиран да се използва като молекулярно сито поради собствения си структурен характер, но напоследък той намери широк спектър от приложения в доставянето на лекарства, катализатор, биосензор, съхранение на енергия и т.н.

Има различни разлики в мезопорестите материали SBA-15 и MCM-41. Въпреки това, най-простият начин за разграничаване на тези две е дебелината на стената на силициев диоксид. SBA-15 с по-дебела стена от силициев диоксид има по-стабилна и твърда структура в сравнение с тази на MCM-41, която има по-тънка дебелина на стената. Освен това синтетичният метод на SBA-15 е по-прост от този на MCM-41. Поради тези разлики, SBA-15 беше избран да пренася биоактивен суров продукт T65 вътре в мезопората на силициевия материал.

3.8. Синтез на мезопорести силициеви частици

След като процесът на калциниране се проведе при 200 ◦C за 2 часа и 600 ◦C за 3 часа непрекъснато, се получава полученият бял мезопорест прах от силициев диоксид. В този процес бяха синтезирани SBA-15 от 8 nm пори. Установено е, че размерите на частиците на SBA-15 са 11,539–13,630 mm в диаметър (Фигура S4) и са определени от две различни съоръжения: лабораторията на университета Inha и лабораторията на националния университет Changwon. В допълнение, всичките шест проби на фигура S4 бяха синтезирани по същия метод, но различна партида.

Когато сместа се поддържа при 60 ◦C и се оставя за 4 дни при статични условия, следвайки горния метод, се познава SBA -15 от 5 nm пори. Освен това, когато температурата се контролира при 120 ◦C, се синтезира SBA -15 от 10 nm. Според резултатите размерът на мезопорите може да се контролира в зависимост от процеса на стареене [73]. SBA-15 от 10 nm пори (Фигура 11) беше използван за по-нататъшна обработка, тъй като мезопорестите силициеви наноматериали с големи пори имат по-добри действия за доставяне на биомолекули от тесните пори [74].

3.9. Оценка на устойчивото представяне

За да се определи дали мезопорестият SBA-15 има способност за контролирано освобождаване, SBA-15 и суровият продукт T65 се смесват заедно в DI вода, метанол, ацетонитрил или разтворител етиленгликол. Когато SBA-15 и вода се смесват, разтворът се превръща в суспензия поради коагулацията между повърхността на силициевия диоксид и водата. Метанолът е добър разтворител както за силициев диоксид, така и за суровия продукт Т65. Въпреки това, поради токсичност, метанолът е заменен с ацетонитрил. Частиците за коефициента на потапяне T65 бяха определени от PV стойността (Таблица S13). Както е показано в таблица S13, PV стойността на SBA-15 намалява след потапяне със суровия продукт T65. Това показа, че материалите T65 са потопени добре в мезопорестите силициеви частици.

За да се определи дали има T65 вътре в частицата, самият T65 беше изследван чрез HPLC (Фигура S5). Както се вижда от данните, имаше два специфични пика (вътре в червената кутия), които винаги бяха видими в случая на екстракти от култура T65, въпреки че партидата на препарата T65 беше променена. Тези два пика имат времена на задържане от 10 минути и 12 минути при 230 nm. Филтратната проба беше изследвана с HPLC, за да се определи дали Т65 присъства във вградения SBA-15. Както е показано на фигура S6, два специфични пика са наблюдавани близо до 10 минути и 12 минути. Освен това се наблюдава малък пик близо до 18 минути време на задържане, което е много важно за проследяване на продуктите T65, които се освобождават във времето.

Фигура 12 представя контролираното освобождаване на устойчивия тест на T65 вграден SBA-15 от 0 до 3 дни. Специфичният пик на Т65 се вижда близо до 15 и 20 минути от дни 0 до 3. Суровите продукти на Т65 са правилно потопени и постепенно се секретират с течение на времето. В допълнение, мезопорестите материали от силициев диоксид (SBA-15), предложени в това проучване, могат да носят физиологично активни вещества в суровия продукт T65 и потвърждават, че физиологично активните вещества са били освободени по начин с продължително освобождаване след натоварване. Освен това мезопорестият материал от силициев диоксид, предложен в това проучване, може в бъдеще да се използва като добър носител за импрегниране на различни функционални материали и като материал с продължително освобождаване чрез поддържане на различни физиологично активни вещества.

4. Изводи

Вторичните биоактивни материали, извлечени от почвените микроорганизми, представляват интерес за козметични приложения поради техните антимикробни, антиоксидантни, против бръчки, избелващи кожата и антимикробни действия. Това изследване описва новата активност на екстракт от етил ацетат от култура на щам T65 за функционалните съставки в козметични формулировки. Суровият продукт T65 е нетоксичен за различните клетъчни линии, като HaCaT (човешки кератиноцит), RAW264.7 (макрофагова клетка), CCD-986Sk (фибробластна клетка на човешка кожа) и B16F1 и B16F10 меланомни клетки . В допълнение, суровият продукт T65 показа регулиране на синтеза на колаген тип I, което е много важно за намаляване на бръчките по кожата. Освен това, суровият продукт T65 инхибира в достатъчна степен човешките патогенни бактерии като B.subtilis, E. coli, P. acnes, S. aureus и S. epidermidis, което може да помогне за предотвратяване на развалянето на козметичния продукт и колонизирането на патогенни бактерии образуване на акне вулгарис върху човешката кожа. Освен това, суровият продукт T65 инхибира тирозиназата на гъбите за избелващ ефект и свинската панкреатична еластаза за дейности против стареене и инхибира NO и погълнати DPPH радикали за антиоксидантни дейности. Синтезът на мезопорести силициеви частици, SBA-15, доказа, че суровият продукт T65 ще бъде ефективен в козмецевтичните формулировки с ефективни свойства на контролирано освобождаване. И накрая, прилагането in vivo на формулиран козметичен продукт заедно със суровия продукт T65 върху лицата на доброволци доказа избелващия ефект и ефекта против бръчки на T65. Въпреки това, химията на различните биоактивни съединения и молекулярните механизми, свързани с различните дейности за инхибиране на ензими и патогени, остават да бъдат открити. В заключение, нашето проучване силно подкрепи идеята, че бактериалните ресурси могат да се добавят към локално прилаганите козметични продукти за избелващ ефект, образуване на бръчки, антиоксидантен ефект и антимикробни действия.

cistanche pharma special

За повече подробности, моля, щракнете тук.