Диференциация, бъбрек, нефрогенеза, нефронни предшественици,

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

АБСТРАКТ

Наличието на нефрон, определено по време на феталния период, диктува бъбречното и свързаното с него сърдечно-съдово здраве през целия живот. Тук показваме, че въпреки отрицателните му ефекти върхурастеж на бъбреците, генетичното увеличаване на GDNF удължава нефрогенната програма отвъд нормалното й спиране. Многоетапният механистичен анализ разкри, че излишъкът от GDNF поддържа нефронните прогенитори и нефрогенезата чрез повишена експресия на неговите секретирани мишени и увеличено WNT сигнализиране, което води до ефект от две части върху поддържането на нефронните прогенитори. Ненормално висок GDNF in ембрионалните бъбреци се регулират нагореизвестните му мишени, но също и Wnt9b и Axin2, със съпътстващото забавяне на пролиферацията на нефронни прогенитори. Намаляването на нивата на GDNF в постнатален периодбъбреците се нормализиратуретерната пъпка и създава благоприятна среда за продължаване на нефрогенната програма, както се демонстрира от морфологично и молекулярно нормално постнатално самообновяване и диференциация на прогениторния нефрон. Тези резултати установяват, че излишъкът от GDNF има двуфазен ефект върху нефронните предшественици при мишки, които могат вярно да реагират на манипулирането на дозировката на GDNF по време на феталния и постнаталния период. Нашите резултати предполагат, че усещането на нивото на сигнализираща активност е важен механизъм, чрез който GDNF и други молекули допринасят за спецификацията на продължителността на живота на нефронния прогенитор.

добавка cistanche tubulosa срещу deserticolaзаподхранване на бъбреците

ВЪВЕДЕНИЕ

Бъбрекът на бозайника е нерегенериращ орган за филтриране на кръвта с основни функции за детоксикация и електролитно балансиране.

Нефроните, изпълняващи тези функции, се раждат по време на феталния период, тъй като бъбрекът на възрастен показва само ограничен капацитет за възстановяване или компенсаторно гломерулно разширяване (хипертрофия) (Chawla и Kimmel, 2012; Rinkevich et al., 2014; Romagnani et al., 2013). Вродената ниска маса на нефрона е широко приет рисков фактор за хипертония, протеинурия, гломерулосклероза и краен стадий на бъбречно заболяване (Bertram et al., 2011; Hoy et al., 2008) и по този начин значително влияе върху здравето на бъбреците през целия живот. Нефрогенната програма завършва между гестационните седмици 35-37 при хора и постнаталния ден (P) 3 при мишка (Hartman et al., 2007; Hinchliffe et al., 1991; Ryan et al., 2018), но механизмите, допринасящи до прекратяването са слабо разбрани. Постулира се, че са включени специфични за етапа промени в моделите на растеж (Cebrián et al., 2004) и клетъчно присъщите механизми за усещане на възрастта (Chen et al., 2015a). Молекулярно, индуцираното от костен морфогенетичен протеин (BMP) SMAD сигнализиране (Brown et al., 2015), хамартин (Tsc1) (Volovelsky et al., 2018) и микроРНК регулация (Yermalovich et al., 2019) участват в определянето на нефрогенния продължителност на програмата. Пластичността на нефрогенната програма обаче не е напълно проучена. Нефроните се диференцират от нефронов прогениторен пул (NP), известен също като метанефричен или капачен мезенхим. NPs, експресиращи уникален репертоар от маркери, включително SIX2, невротрофичен фактор, получен от глиална клетъчна линия (GDNF) и CITED1, присъстват само в ембрионалния бъбрек, където обграждат всеки връх на уретерната пъпка (UB) от неговото установяване (Boyle et al., 2008; Self et al., 2006). Процесът на нефрогенеза е синхронизиран с разклоняването на UB, което едновременно поддържа самообновяването в недиференцираната популация на NP и индуцира подгрупа от NP да претърпи постепенен преход от мезенхим към епител чрез добре дефинирани прекурсорни етапи (претубуларни агрегати, PA; бъбречни везикули , RV; тела с форма на запетая, CSB; S-образни тела, SSB), които в крайна сметка се диференцират във функционални нефрони (Kobayashi et al., 2008; Lindström et al., 2018). Балансът в самообновяването спрямо диференциацията в рамките на NP популацията зависи от сигналите, медииращи реципрочните индуктивни тъканни взаимодействия, протичащи между UB и съседния мезенхим. Сигнали, получени от метанефричен мезенхим и NP, като GDNF и фибробластни растежни фактори (FGF), регулират морфогенезата на UB, чрез която ембрионалният бъбрек расте по размер, постига своята форма и установява системата на събирателния канал (Costantini и Kopan, 2010). GDNF-активираната RET сигнализация в UB върховете регулира транскрипционен профил, отговорен за контрола на прогениторите на събирателния канал и морфогенезата на UB (Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019; Lu et al., 2009; Ola et al. , 2011; Riccio et al., 2016). GDNF-регулираните транскрипти също включват секретирани протеини, като WNT11 и CRLF1, с демонстриран потенциал за регулиране на нефрогенната програма (O'Brien et al., 2018; Schmidt-Ott et al., 2005). Други регулатори на нефрогенезата, получени от UB, са WNT9b и FGF-лиганди, влияещи върху поддържането и диференциацията на NP (Barak et al., 2012; Carroll et al., 2005; Kiefer et al., 2012). По-рано сме докладвали, че генетичното разрушаване на Gdnf 3' нетранслираната област причинява 3- до 6-кратно повишена експресия на ендогенен GDNF и води до бъбречна хипоплазия поради дефект на разклоняване на UB (Kumar et al., 2015 г.). За разлика от смъртността при новородени при Gdnf нокаути, Gdnfhyper/hyper мишките оцеляват до 3 седмици и разкриват съществената роля на GDNF в събирането на самообновяването на прогениторните канали (Costantini, 2012; Kumar et al., 2015; Li et al., 2019). Тук ние демонстрираме, че излишъкът от GDNF, въпреки отрицателния му ефект върху цялостния растеж на бъбреците, може да удължи продължителността на живота на NP, като по този начин допълнително укрепва новопризнатата пластичност на бъбреците на бозайниците.

КЛЮЧОВИ ДУМИ:Диференциация, бъбрек, нефрогенеза, нефронни предшественици, мишка

РЕЗУЛТАТИ

Ембрионалната нефрогенна програма зависи от GDNF

Пространственото разположение на ШЕСТ2-положителни НП в ембрионалния и ранния постнатален периодбъбрециследва стереотипен, добре описан модел, при който първоначалната многоклетъчна пластова тъкан изтънява с течение на времето, без да се засяга много цялостната организация на нишата (Short et al., 2014). NPs в Gdnfhyper/hyper бъбреците бяха разпределени около необичайно широк UB като по-тънък слой (Фиг. 1A-F; Фиг. S1A, B). Количественото определяне на NPs при E11.5 разкрива първоначално увеличение, което е временно нормализирано при E12.5, но силно намалява при E14.5 в Gdnfhyper/hyper бъбреците (фиг. 1E-G; фиг. S1C-F). Анализът на митозата показа, че както ендогенно повишеният, така и екзогенно допълненият GDNF причинява значително намаляване на pHH3 плюс NPC (Фиг. 1H; Фиг. S1G). Взети заедно, данните показват, че излишъкът от GDNF, който функционира предимно в UB, където се експресират неговите рецептори (Pachnis et al., 1993), предизвиква бърз спад в пролиферацията на NP клетки по време на ранното развитие на бъбреците.

Известно е, че преждевременната или ускорена диференциация на NP може да причини спад на NP клетките в тяхната ниша (Kobayashi et al., 2008; O'Brien, 2018). За да се оцени това, нефрогенезата беше изследвана чрез оцветяване с LEF1 и циклин D1, които маркират съответно най-ранните клетки, ангажирани с диференциация, и нефрони, подложени на пълна епителизация (Lindström et al., 2015). Това показва общ спад в броя на ранните прекурсори на нефрони и показва намалена диференциация на нефрони в ембрионални Gdnfhyper/hyperбъбреци(фиг. 2). Оценката на гломерулната плътност допълнително подкрепи това и демонстрира по-ниски общи плътности в хиподиспластичните Gdnfhyper/hyper бъбреци, отколкото в бъбреците от див тип (WT) (фиг. S1G). Интересно е, че анализът на кортикалните гломерули в рамките на общата измерена площ и особено съотношенията кортикални към общи гломерули разкри малко по-високи от WT съотношенията в Gdnfhyper/hyper (Таблица 1; 17 процента в Gdnfhyper/hyper, 12 процента в WT). Това показва, че въпреки ранното забавяне на самообновяването и диференциацията на NP, бъбреците, изправени пред излишък на GDNF по време на органогенезата, имат продължаваща постнатална нефрогенеза с незначително увеличение на най-късно родените нефрони, които са най-кортикално разположени (Rumballe et al., 2011; Short и др., 2014).

Излишният GDNF удължава продължителността на живота на постнаталния NP пулМного модели мишки с дефицит нарастеж на бъбреците, или поради морфогенеза на UB и/или диференциация на нефрони, умират веднага след раждането (Kuure and Sariola, 2020). Въпреки значителната хипоплазия, аномалии в морфологията на UB и силно нарушена ембрионална нефрогенеза (фиг. 2), Gdnfhyper/hyper мишките оцеляват до 3 седмици след раждането (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019), предоставяйки възможност за изследване на постнаталната нефрогенеза.

Както беше установено (O'Brien, 2018), нашият анализ на популациите на NP при P1-P10 разкри драматична загуба в WT бъбреците при P3, в която SIX2-позитивността беше открита главно в

диференциращи прекурсори на нефрон и само 10 процента от анализираните UB върхове (ниши) са покрити с нефронни прогениторни клетки (NPC) (Фиг. 3A, n=2 бъбреци). Въпреки това, SIX2-положителни NPs бяха открити в 59 процента от Gdnfhyper/hyper ниши при P3 (фиг. 3B, n=2 бъбреци). По подобен начин, PAX2-позитивните NP са открити в NP нишите на Gdnfhyper/hyper бъбреците при P3, но PAX2-позитивните клетки са локализирани изключително в диференциращите нефронови прекурсори в WTбъбреци(Фиг. 3C,D).

Нефрогенеза при постнатална Gdnfhyper/hyperбъбрецидемонстрира значително подобрение от това в ембрионалните бъбреци, както е илюстрирано от подобни модели на прекурсори на нефрон в WT и Gdnfhyper/hyper бъбреци (Фиг. 3E-H; сравнете с Фиг. 2). накрая

открихме, че ~18 процента от NP нишите поддържат ШЕСТ2-положителни NPC на P4, а ангажираните NPC присъстват в Gdnfhyper/hyperбъбрецидо P6, докато ангажираните NPC бяха открити в WT

бъбрецисамо до P4 (фиг. 4; фиг. S1H). Това показва, че продължителността на живота на NP in vivo не е предварително фиксирана и предполага, че модулирането на нивата на растежен фактор, по-специално GDNF, допринася за времето на крайната вълна на диференциация на нефрона.

Ние предположихме, че персистиращите NPC в постнаталните Gdnfhyper/hyper бъбреци могат или да са резултат от общи компенсаторни механизми, провокирани от UB разклоняващи дефекти, водещи до бъбречна хипоплазия (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019) или алтернативно да произлизат от GDNF-специфични ефекти върху популацията на NP. За да се прави разлика между опциите, постнаталните NPs бяха анализирани в други модели на бъбречна хипоплазия. Fgf9;20-дефицитбъбреципоказват подобно изтъняване на ембрионалните NP клетъчни слоеве (Barak et al., 2012), както е открито в Gdnfhyper/hyperбъбреци, но не успяхме да открием SIX2- и/или PAX2-положителни клетки в техните постнатални NP ниши (фиг. S2). За по-нататъшно разработване на това, ние анализирахме Hoxb7Cre; Mek1fl/fl; Mek2 плюс /- бъбреци (Ihermann-Hella et al., 2014), при които, подобно на Gdnfhyper/hyper мишки, бъбречната хипоплазия е причинена от нарушено UB разклоняване. Този модел също така липсваше признаци на продължителна нефрогенеза, както се открива чрез наличието на SIX2- и/или PAX2-положителни клетки в техните постнатални NP ниши (фиг. S3), подкрепяйки мнението, че бъбречната хипоплазия като това не е достатъчно за поддържане на постнаталната нефрогенеза.

Публикуваните данни също показват, че бъбречната хипоплазия сама по себе си не е в състояние да поддържа постнатална поддръжка на NP (Kuure и Sariola, 2020), което допълнително предполага активна роля на GDNF. Не можем обаче напълно да изключим възможността излишните фактори на растеж, различни от GDNF, да имат същия ефект.

Устойчивите постнатални НП поддържат нефрогенната програма след нейното нормално прекратяване

Устойчивите постнатални НП поддържат нефрогенната програма след нейното нормално прекратяване

След това потенциалът за диференциация на устойчиви NPs в постнаталния Gdnfhyper/hyperбъбрецибеше прегледан. Анализът на Ki67 разкрива сравними модели на постнатална пролиферация в WT и Gdnfhyper/hyper бъбреците до P4 (фиг. 5A, B). От P5 нататък, Ki67-позитивните клетки намаляват в зоната на кортикална диференциация на WT бъбреците (фиг. 5C,E,G). Такъв спад в кортикалната пролиферация не е открит в Gdnfhyper/hyper бъбреците, които показват активно циклични клетки в структури, подобни на прекурсор на нефрон при P7 (фиг. 5D, F,

H), но вече не на P12 (фиг. S4A, B).

Анализът на постнаталната диференциация на нефрона демонстрира прекомерно количество прекурсори на нефрон в Gdnfhyper/hyperбъбрецидо P7, докато те са открити в WT бъбреците само до P4 (фиг. 6; фиг. S4C-F). Такава персистираща постнатална нефрогенеза, обаче, не успя да увеличи гломерулната плътност от тази в късните ембрионални стадии (фиг. S5A-C; 6.4 ± 2.1 срещу 10.2 ± 1.2, съответно; средно ± sem). Съотношението на кортикалните гломерули в Gdnfhyper/hyper бъбреците при P7 (59 процента) е 1,5 пъти по-високо

Фиг. 1. Нефронните прогенитори се изчерпват в ембрионален Gdnf хипер/хипербъбреци. (A,B) Маркерът SIX2 на нефронов прогенитор (NP) (червен) се локализира към върховете на уретерната пъпка (UB), затварящи мезенхима (калбиндин, зелен) в WT (A; n=4 бъбреци) и Gdnfhyper/hyper (B; n=5 бъбреци) бъбреци при E11.5. (C, D) E12.5 WT (C) и Gdnfhyper/hyper (D) бъбреци, култивирани in vitro за 24 часа и оцветени за SIX2 (червено), за да се визуализира NP популация и калбиндин (зелен) за UB (n{{9} } бъбреци/ лечение, три независими експеримента). (E,F) NPs са в изобилие в E14.5 WT бъбрек (E; 42,6/връх), докато в Gdnfhyper/hyper бъбрек NPs са ясно намалени (F; стрелки, 29,8/връх) (n=207 за WT и 431 за Gdnfhyper/hyper връхчета, анализирани в девет бъбрека/генотип).

Белите стрелки сочат към NP клетките (червени).

(G) Анализ на SIX2-положително количество NP в WT и Gdnfhyper/hyperбъбреципоказва сравними първоначални NP пулове при E12.5. Данните са представени като средно количество от SIX2-положителни NPs±sem в сравнение с тези на WT котила, които са настроени на 100 процента и отразяват резултатите, получени от четири независими котила (WT: 100±15,61 процента, n{{ 7}}; Gdnfhyper/hyper: 124,74±33,89 процента, n=5; P=0.533, двустранен t-тест в SPSS). (H) Съотношението на пролифериращи SIX2-положителни NPs в Gdnfhyper/hyper бъбреци при E12.5 показва значително намаление в сравнение с WT бъбрек. Данните са представени като средна пропорция на пролифериращи SIX2-положителни NPs±sem в сравнение с тези на WT котила, които са настроени на 100 процента и отразяват резултатите, получени от три независими котила (WT: 100±9,04 процента, n{{ 25}}; Gdnfhyper/hyper: 56,94±12,67 процента, n=5;

*P=0.024, двустранен t-тест в SPSS). Скала: 100 µm.

отколкото в WTбъбреци(39 процента) (Таблица 1), подкрепящи мнението, че устойчивият постнатален NP пул в Gdnfhyper/hyper бъбреците индуцира нови нефрони след нормалното спиране на нефрогенезата.

Gdnfhyper/hyper мишки с продължителна нефрогенеза в тежко хиподиспластични бъбреци не показват признаци на неоплазия или туморогенеза по време на краткия си живот (Kumar et al., 2015; Turconi et al., 2020).

Gdnfwt/hyper бъбреците показват по-лек ембрионален спад на NPC, отколкото Gdnfhyper/hyperбъбреци. Тези мишки живеят нормален живот и не показват туморибъбрекs и други органи (Turconi et al., 2020) (фиг. S6A-D, n=62). Двукратното увеличение на GDNF по време на ембриогенезата обаче не успява да поддържа популацията на NP в постнаталните Gdnfwt/хипер бъбреци (фиг. S6E, F), което предполага стегнато

Фиг. 2. Ефект от излишъка на GDNF върху ембрионалната нефрогенеза. (A) LEF1 (червен), маркер на претубуларни агрегати, дистални бъбречни везикули и S-образни тела, в WT E14.5 бъбрек. (B) E14.5 Gdnfhyper/hyper бъбрек показва много малко LEF1-положителни диференциращи нефронни прекурсори и типично изобилие от епител на уретерната пъпка (UB), както се открива чрез оцветяване с калбиндин (зелено).

(C) Циклин D1 (червено) оцветява всички предшественици на диференциращи се нефрони (звездичките маркират претубуларни агрегати и тела с форма на запетая, стрелките сочат към S-образни тела), които могат да се наблюдават изобилно до UB епител (зелен) в E14.5 WTбъбрек.

(D) Значително по-малко диференциращи нефронни прекурсори се откриват в E14.5 Gdnfhyper/hyperбъбрек. (E, F) Локализация на циклин D1 (червено) в E16.5 WT (E) и

Gdnfhyper/hyper (F) бъбреци. Калбиндин (зелен)

оцветяването визуализира UB епител във всички изображения. За всяко оцветяване на даден етап n=3 бъбреци/генотип. Скала: 100 µm.

Таблица 1. Количествено определяне на гломерулната плътност в Gdnfhyper/hyper бъбреците при E18.5 и P7

Данните са средно количество нефрон на кубичен mm±sem (n=4 бъбреци/генотип, средно осем слайда, анализирани за всеки бъбрек с интервали от 125 µm, за да се избегне повторното преброяване на едни и същи гломерули). Делът на кортикалните гломерули в WT бъбреците при E18.5 е 12 процента, докато в Gdnfhyper/hyper бъбреците е 17 процента. При P7 делът на гломерулите в кората се увеличава допълнително в Gdnfhyper/hyperбъбреци,което предполага, че нефроните все още активно се диференцират.

прагова граница за способността на GDNF да модулира нефрогенната програма.

Устойчивата постнатална нефрогенеза зависи от промените в GDNF-индуцираното сигнализиране

Gdnf експресията се губи от WT бъбреците от P2 (www.gudmap.org), докато неговата иРНК и протеин все още присъстват в Gdnfhyper/hyper

Устойчивата постнатална нефрогенеза зависи от промените в GDNF-индуцираното сигнализиране

Gdnf изразът се губи от WTбъбрециот P2 (www.gudmap.org), докато неговата иРНК и протеин все още присъстват в Gdnfhyper/hyper

бъбрецичак до P7 (фиг. 7A-D). Консервативният GDNF рецепторен комплекс се експресира само в епителните UB върхове (Costantini, 2012;

Golden et al., 1999). Благодарение на локализацията на рецептора в тъканта, съседна на NPC популацията, ние подозирахме, че ефектите на повишения ендогенен GDNF върху нефрогенезата трябва да бъдат медиирани

чрез получени от UB, секретирани, GDNF-зависими молекули (http:/ www.signalpeptide.de/index.php) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011; Schmidt-Ott et al., 2005) (Таблица 2), или други молекули, чиято експресия може да се промени поради големия UB.

Експресионният анализ на UB-получени, секретирани GDNF-мишени разкрива значително повишаване на регулацията на Crlf1, Srgn и Wnt11 в Gdnfhyper/hyper бъбреците при E14.5 (Фиг. 7E). Също така, експресията на Wnt9b е значително повишена (фиг. 7E). Допълнителен анализ на WNT/- катенин сигнални мишени (Clevers and Nusse, 2012) в E14.5 контрола и Gdnfhyper/hyper бъбреци демонстрира значително повишаване на регулацията на каноничната мишена Axin2 (P=0.003371), докато NP-експресирана WNT цели (Karner et al., 2011) показаха тенденция на регулиране надолу, вероятно отразявайки намаления общ брой на NPC (фиг. S7A). Заедно те показват, че не само увеличеното GDNF-индуцирано сигнализиране, но също и увеличеното Wnt9- и Wnt11-индуцирано сигнализиране с известни функции в регулирането на NPC участват в медиирането на реципрочна комуникация от мутантния UB към съседния NP пул при E14.5 (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018).

Фиг. 3. Диференциация на нефрона при спиране на бъбречната морфогенеза. (A) P3 WT бъбрек е загубил кортикални ШЕСТ2-положителни нефронни предшественици (NP), както е показано от загубата на клетки в мезенхима на капачката (стрелка). Вместо това, SIX2 се локализира в латерален мезенхим и ранни прекурсори на нефрон (стрелки).

Количественото определяне на 48 NP ниши (анализирани номера на върха) разкрива само пет ниши с NP. (B) Cap mesenchyme положителен за SIX2 все още присъства в Gdnfhyper/hyper бъбрек при P3 (стрелки). Количественото определяне на 107 NP ниши (анализирани числа на върха) разкрива 63 ниши с NP клетки. (C, D) PAX2 (червено) и калбиндин (зелено) оцветяване в WT (C) и Gdnfhyper/hyper

(D) бъбреци при P3. Стрелките сочат към позицията, където NP клетките се поддържат в Gdnfhyper/hyperбъбреци.

(E,F) Сравнимо количество циклин D1-положителни (червени) прекурсори на нефрон в P3 WT (E) и Gdnfhyper/hyper

(F) бъбреци. (G,H) Визуализация на LEF1-положителни прекурсори на нефрон (червено) и уретерален епител (зелено) разкрива подобна продължаваща нефрогенеза при WT

(G) и Gdnfhyper/hyper (H) бъбреци. За всяко оцветяване

n{0}} бъбреци/генотип. Скала: 100 µm.

Молекулярна характеристика на P5 Gdnfhyper/hyperбъбреципоказаха постоянна регулация на Crlf1, Etv4, Etv5, Cited1 и Uncx4.1 (известен също като Uncx), но също така разкриха повишена експресия на потенциален нишов фактор Lama1 (Rayagiri et al., 2018), индуктор на диференциация на нефрони Wnt4 (Stark et al. , 1994) и WNT сигнализиращ агонист R-спондин 1 (Rspo1) (Фиг. 7F; Фиг. S7B). Такъв транскрипционен профил предполага увеличен ефект, получен от UB върху NP, които изглежда претърпяват вълна на диференциация, базирана на намалената експресия на Fgf9 и Fgf20 и изместена локализация на SIX2 плюс клетки (Фигури 4C, D и 7F). Ние функционално тествахме дали най-значително повишените изрази на Crfl1, Wnt11 и Wnt9b евентуално влияят на нефрогенната програма при мишката. CRLF1, в комплекс с неговия физиологичен лиганд кардиотрофин-подобен цитокин, индуцира диференциация в изолирани мезенхимни култури от бъбрек на плъх (Schmidt-Ott et al., 2005). Характеризирането на Crfl1-нокаутирани бъбреци разкри сравним размер на бъбреците и нефрогенеза с WT бъбреци (фиг. S6C-F), което предполага незаменими функции на CRLF1 in vivo. След това беше тестван приносът на повишеното канонично WNT сигнализиране към фенотипите, причинени от излишъка на GDNF. IWR1 инхибира танкирази 1 и 2, които са необходими за нормалното развитие на бъбреците (Chen et al., 2009; Huang et al., 2009; Karner et al., 2010). Третирането с IWR1 облекчи броя на върха на UB и морфологията в присъствието на излишък от GDNF (фиг. S8). И накрая, ние попитахме дали значително повишената експресия на Wnt11 в Gdnfhyper/hyper бъбреците допринася за удължената нефрогенна програма в Gdnfhyper/hyper мишки чрез пресичане на Wnt11 нокаут-алел към фона на Gdnfhyper. Това не успя да генерира двойна хомозигота

Фиг. 4. Нефронните прогенитори се поддържат постоянно в постнаталните Gdnfhyper/hyper бъбреци. (A, B) Локализацията на маркер SIX2 на нефрон прогенитор (NP) (червен) в WT при P4 (A) и P6 (B) показва загуба на NPs в WT бъбреци, в които SIX2 се открива само в слабо положителни бъбречни везикули (звездички) . (C) В Gdnfhyper/hyper бъбреците при P4 SIX2 се локализира също към NPs, затварящи уретерната пъпка (зелени) върхове (стрелки) (n=315 върхове в WT и 245 в Gdnfhyper/hyper анализирани в четири бъбрека/генотип). (D) Локализацията на SIX2 (червен) и калбиндин (зелен) в P6 Gdnfhyper/hyper бъбреци разкрива персистирането на ангажирани NP клетки (13; * показва диференциращи нефрони) в мутантния бъбрек (n=3 бъбреци/генотип) . Количественото определяне на NP клетъчни ниши показа много малко накрайници, които нямат никакви SIX2-положителни NPs в WT бъбреците, докато 81 процента от нишите в Gdnfhyper/hyper бъбреците (n=2, 16 ниши) са придружени с SIX2-позитивност в ангажирани и диференциращи нефронни прекурсори. Скала: 100 µm.

Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− потомство (Таблица 3; n=95; P=0.005 Gdnfwt//hyper;Wnt11 плюс /− размножаване). Тези резултати показват ембрионална смъртност за Gdnfhyper/hyper; Wnt11−/− мутанти и ни принудиха да фокусираме анализа върху Gdnfhyper/hyper; Wnt11 плюс /- бъбреците. Отстраняването на един Wnt11 алел в Gdnfhyper/hyper фон леко подобри морфологията на UB и намали размера на бъбрека допълнително от този в Gdnfhyper/hyper бъбреците, вероятно отразявайки намаленото образуване на кисти на събирателния канал при намаляване на дозата на Wnt11 (фиг. S9A-C). Въпреки това, SIX2-позитивна NP популация беше повишена (29,8 NPC/върх спрямо 40,7 NPC/върх при E14.5 и 20,3 NPC/върх спрямо 30,9 при P0) и нефрогенезата беше подобрена в зоната на кортикална диференциация на Gdnfhyper/hyper ;Wnt1 плюс /- бъбреци (фиг. 8; фиг. S9D-F; сравнете също с фиг. 1F). По този начин тези резултати предполагат, че повишените нива на GDNF увеличават няколко получени от пъпките GDNF/Ret мишени, които, не сами, а в комбинация помежду си и заедно с повишено канонично WNT сигнализиране, регулират NPC в ембрионални бъбреци.

ДИСКУСИЯ Броят на нефроните се определя по време на живота на плода и може да варира значително между отделните индивиди. Разширяването на NP и продължителността на живота силно влияят върху окончателното снабдяване с нефрони и следователно идентифицирането на регулаторни механизми, които контролират самообновяването на NP, е важно. Тук показваме, че невротропният фактор GDNF, за който е известно, че инициира бъбречното развитие и регулира морфогенезата на UB (Costantini, 2010; Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019), въпреки отрицателните си ефекти върху растежа на бъбреците, е способен да за удължаване на нефрогенната програма отвъд нормалното й прекратяване. Нашите резултати показват, че излишъкът от GDNF има двуфазен ефект върху самообновяването и поддръжката на NP. Въз основа на нашия анализ предлагаме модел за това как функционира излишният GDNF в Gdnfhyper/hyper бъбреците

чрез механизми, които включват промени в прогресията на клетъчния цикъл и капацитета за усещане на нивата на растежния фактор. Първоначално в ембрионалните бъбреци високите нива на GDNF причиняват бърз спад в броя на NP на ниша, което е типично за много миши модели с първичен дефицит на UB (Carroll and Das, 2013; Chen et al., 2015b; Costantini and Kopan, 2010; Liu et al., 2018). Преждевременният спад на NP, наблюдаван в тези публикувани по-рано модели, обикновено се причинява от тяхната ненавременна диференциация, което не е случаят с Gdnfhyper/hyper бъбреците. Вместо това, излишъкът от GDNF е способен да поддържа активен клетъчен цикъл в постнаталната бъбречна кора значително по-дълго, отколкото се наблюдава при WT бъбреците. Пролиферацията възниква в NP клетки, които се поддържат по-дълго, отколкото в WT бъбреците, и те продължават да произвеждат нови нефрони. В бъдеще ще бъде интересно да се види дали ще бъде възможно да се администрира излишък от GDNF по начин, благоприятен за продължаване на постнаталната нефрогенеза, без да се засяга сериозно морфогенезата на UB, за да се наруши цялостният растеж на органа. Нашите данни показват, че ранният спад в ембрионалните NP на Gdnfhyper/hyper бъбреците се дължи по-скоро на намалена клетъчна пролиферация, отколкото на повишена преждевременна диференциация. Този клетъчен механизъм се поддържа от молекулярни промени, открити в известни мишени на GDNF (Crlf1, Wnt11 и Srgn) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011) и във важни регулатори на сигнализиране за поддържане на NP клетки (Wnt9b, Wnt11 и техните транскрипционни цели) (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; O'Brien et al., 2018). Предишно изследване на дълголетието и устойчивостта на NP клетките чрез премахване на NP популацията с дифтериен токсин А или чрез нарушаване на активирането на MAPK/ERK, които и двете водят до бърз спад на NP клетките без положителен ефект върху продължителността на живота им (Cebrián et al., 2014 ; Ihermann-Hella et al., 2018), заедно с нашите резултати предполагат, че пролиферацията на NP клетки по своята същност играе основна роля при определянето на общия им живот. В съгласие, NP клетките в късните ембрионални бъбреци показват значително намалени скорости на пролиферация и ускорена диференциация, докато трансплантацията на стари NP клетки в бъбреци в по-ранен стадий удължава техния живот (Chen et al., 2015a). Въз основа на нашите резултати, ние предлагаме, че GDNF допринася за механизма, чрез който NP клетките усещат възрастта си на развитие и в крайна сметка продължителността на живота си. В нормален бъбрек, експресията на GDNF е висока в началото на бъбречната морфогенеза и по време на активната фаза на растеж, докато ясен спад в нивата на GDNF се наблюдава в късните ембрионални бъбреци, което води до загуба на експресия в ранен постнатален стадий (Фигури 7 и 9) . Нивата на GDNF в ранните Gdnfhyper/hyper бъбреци са необичайно високи, което изглежда инхибиращо пролиферацията на NP клетки, вероятно поради откритите клетъчни и молекулярни промени в мутантния UB, като например променен WNT път

(Фиг. 7E,F; Фиг. S7A,B), който има известни ефекти върху биологията на NPC (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). Подобно на WT бъбреците, нивата на Gdnf mRNA и GDNF протеин намаляват в постнаталните Gdnfhyper/hyper бъбреци, в които Gdnf се манипулира на пост-транскрипционно ниво, което позволява ендогенна времева регулация на експресията (Kumar et al., 2015). Вероятно това намалява експресията на GDNF до нивото, което е допустимо за самообновяване и диференциация на NP клетки, които се откриват като продължителна нефрогенна програма в постнатални бъбреци (фиг. 9). Такава новопризната пластичност, зависима от растежен фактор, в бъбречната диференциация носи надежда за нейното използване за регенеративни цели в бъдеще. Първите улики за възможността за удължаване на периода на диференциация на нефрона идват от експерименти, инхибиращи BMP/

Фиг. 5. Устойчива кортикална пролиферация в постнатални Gdnfhyper/hyper бъбреци. (A, B) Ki67 оцветяване в P4 WT (A) и Gdnfhyper/hyper (B) бъбреци показва подобен модел на пролиферативни клетки в кортикалните бъбреци (червени стрелки) и на двата генотипа. (C, D) В P5 WT бъбреци (C) Ki67-позитивността е значително намалена в кората (червена стрелка), докато Gdnfhyper/hyper бъбреците (D) все още показват фокално много висока пролиферация (червени стрелки). (E, F) Пролиферацията в WT кортикалния бъбрек (E) е допълнително намалена при P6, докато остава силно активна в Gdnfhyper/hyper бъбреците (F). (G,H) Ki67-позитивните пролиферативни клетки се локализират в медуларните бъбречни тубули (черна стрелка) в P7 WT бъбреците (G), но активната пролиферация все още се открива в кортикалните диференциращи нефронни структури (червени стрелки) на Gdnfhyper/hyper бъбреците (H). За всеки постнатален етап, n=3 бъбрека/генотип. Мащабна лента: 1 мм.

P7 само в Gdnfhyper/hyper бъбреците. (A, B) Маркерът за прекурсор на нефрон LEF1 (червен) в WT (A) и Gdnfhyper/hyper (B) бъбреците при P4 демонстрира продължаваща нефрогенеза и в двата генотипа (стрелки) (n=2 бъбреци/генотип). (C, D) P5 WT бъбреци (C) показват много малко LEF1-положителни клетки в кората, докато изобилна нефрогенеза се открива в Gdnfhyper/hyper бъбреци (D; стрелки; n=4 бъбреци/генотип) . (E, F) LEF1 вече не присъства в кората на WT бъбреците при P6 (E), докато изобилие от прекурсори на нефрон все още се откриват в Gdnfhyper/hyper бъбреците (F) (n=3 бъбреци/генотип). (G) Циклин D1 (бял) и JAG1 (червен) се локализират в диференцирани дистални тубули на нефрона (жълта стрелка и глава на стрелка) в P7 WT бъбрек (n=3 бъбреци). (H) В P7 Gdnfhyper/hyper бъбреците циклин D1 и JAG1 се локализират в тела с форма на запетая (върх на стрелка) и S-образна форма (стрелка) на прекурсори на нефрон в зоната на кортикална диференциация, като по този начин показват устойчива нефрогенеза в този късен постнатален стадий (n{ {19}} бъбреци). Скала: 100 µm.

SMAD1/5 сигнализиране, което доведе до малко по-големи бъбреци с повече нефрони, отколкото при бъбреците, третирани с носител (Brown et al., 2015). Намалената доза на Tsc1, кодиращ mTOR инхибитор, поддържа NP клетки за допълнителен ден, без докладвани ефекти върху броя на ембрионалните NP клетки (Volovelsky et al., 2018). Удължена нефрогенеза се наблюдава и при мишки със свръхекспресия на Lin28, Lin28b или инактивиран Let-7 (Let-7a1; Let-7d; Let-7f1) (Urbach et al ., 2014; Yermalovich et al., 2019), които също показват или директна туморогенеза, или активиране на Igf2 или H19h локусите, свързани с педиатричен рак на бъбрека, тумор на Wilms (Chen et al., 2018; Ogawa et al., 1993). Като забележка, не са открити промени в локализацията или нивата на pSMAD1/5 в Gdnfhyper/hyper бъбреците, които са хиподиспластични и съвместими с живота в продължение на три седмици.

Настоящото изследване се фокусира върху характеризирането на функцията на GDNF в нефрогенезата, която преди това е изследвана чрез намаляване на ендогенната доза Gdnf и води до намалено натрупване на нефрони (Cullen-McEwen et al., 2001, 2003). Каноничният рецепторен комплекс за GDNF се образува от RET тирозин киназата и нейния ко-рецептор GFRa1, които са изключително ко-експресирани само в UB епитела (Costantini, 2012; Golden et al., 1999; Pachnis et al., 1993) . GDNF е ключов нишов фактор за клетките на върха на UB (Chi et al., 2009; Riccio et al., 2016; Shakya et al., 2005). По-рано показахме, че излишъкът от GDNF разширява прогениторния пул на събирателния канал за сметка на удължаването на уретерния ствол, което води до разширен връх и къс фенотип на ствола поради дефекти в прогениторния мотилитет и скъсена дължина на клетъчния цикъл (Li et al., 2019). По време на ембрионалните стадии комбинираният ефект на анормално

Фиг. 7. Анализ на експресията на ключовите регулатори на бъбречното развитие. (A) Анализът на in situ хибридизация на Gdnf при P4 не може да открие никакви транскрипти в WT бъбрек (n=3 бъбреци). (B) Експресията на Gdnf се поддържа в P4 Gdnfhyper/hyper бъбрек и се локализира в зона на кортикална диференциация, в която се поддържат прогенитори на нефрон (червени стрелки) поради излишък на GDNF (n=3 бъбреци). (C) qRT-PCR анализ на Gdnf транскрипти в Gdnfwt/ko, WT, Gdnfwt/hyper и Gdnfhyper/hyper бъбреци при P7 (n=3 бъбреци/генотип). Експресията на Gdnf в Gdnfhyper/hyper бъбреците е значително по-висока, отколкото в WT (P=0.036) и Gdnfwt/ko (P=0.038) (средно±sem, двустранен t-тест в SPSS ). (D) ELISA анализ на нивата на GDNF протеин в P7 бъбреците (n=5 бъбреци/генотип) (средно ± sem). (E,F) базирано на qRT-PCR количествено определяне на относителните нива на експресия на избраните гени при E14 (E) и при P5 (F) (n=3 бъбреци/генотип на даден етап). Произведените от UB секретирани GDNF цели са изброени над пунктираната линия, докато други известни регулатори на нефрогенезата са представени под линията. Gdnfhyper/хипер бъбреците показват значителна регулация на Crlf1 (*P=0.019), Srgn (*P=0.021), Wnt11 (**P=0.001) и Wnt9b ( **P=0.01) при E14, докато при P5 значително увеличените генни експресии включват Crlf1 (**P=0.009), Etv4 (**P=0).{{ 39}}), Etv5 (*P=0.03), Lama1 (*P=0.014) и Wnt4 (*P=0.026). За разлика от това, транскрипцията на Sostdc1 (**P=0.000), Fgf9 (**P=0.001) и Fgf20 (**P=0.001 ) е значително намален в Gdnfhyper/hyper бъбреците при P5. Скала: 100 µm.

висок GDNF, аномални биофизични промени, предизвикани от морфологията на върха на UB и свързаните с тях молекулярни промени в мишените на GDNF и WNT пътя, изглежда, че съвместно тласкат NP клетките към намалена пролиферация. Тук показваме, че разширената морфология на върха на UB се подобрява с течение на времето, но продължава при леки форми до P4 в постнатални Gdnfhyper/hyper бъбреци (фиг. 5). UB върховите клетки все още присъстват молекулярно в P5 Gdnfhyper/hyper бъбреците, които експресират високи нива на GDNF-регулирани върхови маркери Crlf1, Etv4, Etv5 и Lama1, NPC-експресирани канонични WNT цели Cited1 и Uncx4.1, както и WNT агонист R -spondin1 (Фиг. 7E, F; Фиг. S7A, B) (Karner et al., 2011; Lu et al., 2009; Vidal et al., 2020). Такива молекулярни промени в постнаталния UB вероятно осигуряват благоприятна среда за продължително самообновяване на NP след P2/P3. Ние идентифицирахме получените от UB секретирани CRLF1 и WNT11 като мишени на GDNF, които заедно с увеличения каноничен WNT

сигнализирането, допълнително подсилено от повишената експресия на Wnt9b, медиира неговите ефекти върху регулацията на NP. Нашите данни също показват, че функцията на CRLF1 е излишна с други цитокини, тъй като нейното инактивиране не засяга бъбречната диференциация. Както WNT9b, така и WNT11 регулират много аспекти на NPC и нефрогенезата (Carroll et al., 2005; Karner et al., 2011; Majumdar et al., 2003; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). Повишената регулация на UB-експресиран Wnt9b, за който е известно, че регулира много аспекти на нефрогенезата, в Gdnfhyper/hyper бъбреците може да имитира неговата принудителна експресия в NPs, което нарушава тяхното поддържащо спрямо диференциационно равновесие (Kiefer et al., 2012) и по този начин механично допринася до небалансирано самообновяване на NP при Gdnfhyper/hyper нефрогенеза. Това се подкрепя от подобрена морфология на върха при канонично инхибиране на WNT от IWR1 в цели бъбреци, изправени пред излишен GDNF.

Таблица 2. Секретирани GDNF целеви гени с потенциал да повлияят на нефрогенната програма

Нашите резултати показват, че самото инхибиране на IWR1 има голям ефект върху NPC, които са разпръснати и хлабаво прилепнали към UB върховете. Каноничното инхибиране на WNT в самите NPC вероятно допринася за неуспеха да се увеличи техният фенотип в присъствието на излишък от GDNF. Това се подкрепя от нашите генетични експерименти, при които понижаването на UB-експресираната експресия на Wnt11 в Gdnfhyper/hyper фона подобрява поддържането и диференциацията на NP, но не успява напълно да спаси бъбречната хипоплазия, причинена от излишния GDNF. Това може поне отчасти да се дължи на неуспеха да се инактивират и двата Wnt11 алела в Gdnfhyper/hyper фона поради ембрионалната смъртност на Wnt11−/− (Nagy et al., 2016). По този начин, един оставащ алел Wnt11 може дори да увеличи GDNF каскадата, както беше предложено по-рано (Majumdar et al., 2003) и по този начин отчасти да забрани пълното спасяване на нефрогенезата. Нашето настоящо проучване не може да изключи възможността някои ефекти на GDNF върху NPs да се дължат на неканонично GDNF сигнализиране, тъй като неговите потенциални алтернативни сигнални рецептори се експресират от NPs (Brodbeck et al., 2004; Enomoto et al., 2004; Keefe Davis и др., 2013; Paratcha и др., 2003). Въпреки това, както делецията на NCAM, така и експресията на Gfra1 само в UB (чрез поставянето му под контрола на Ret промотора) поддържат нормален бъбречен фенотип (Cremer et al., 1994; Heuckeroth et al., 1999; Keefe Davis et al., 2013; Роси и др., 1999; Сариола и Саарма, 2003). Това предполага, че поне сами по себе си нито NCAM, нито GFRa1 са от съществено значение за нефрогенната програма. В обобщение, нашите експерименти предполагат, че GDNF, който е бил и в момента е в клинични изпитвания за болестта на Паркинсон (Kirkeby and Barker, 2019), може да има потенциал да служи като перспективно средство за подобряване на нефронното състояние в бъдеще. Необходими са допълнителни експерименти, за да се идентифицират възможните начини за прекомерно активиране на сигнализирането на GDNF без вредни ефекти върху растежа на бъбреците

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Животни

Грижата за животните и протоколите за изследване са извършени в съответствие с Кодекса за етично поведение при опити с животни, както и с директивите на Европейския съюз (Директива 2010/EU/63) и са одобрени от Националния съвет за експерименти с животни на Финландия. Мишките бяха настанени в индивидуално вентилирани клетки с храна и вода ad libitum. Оптимално овлажняване и отопление се осигуряват постоянно в сертифицирания център за лабораторни животни на университета в Хелзинки. Генерирането и генотипирането на миши модели Gdnfhyper (Kumar et al., 2015) и Fgf9; 20 (Barak et al., 2012) е описано по-рано. Gdnfhyper;Wnt11− малките са от кръстосвания на C57BL6 Wnt11−

Таблица 3. Обобщение на генотипове на потомство от Gdnfwt//hyper;Wnt11 плюс /− кръстосвания

(Nagy et al., 2016) и Gdnfhyper линии и са генотипирани, както е описано по-горе (Kumar et al., 2015; Nagy et al., 2016 ). Всички миши линии, използвани в проучванията, се поддържат на 129Ola/ICR/C57bl6 троен смесен фон. Генерирането на Crlf нокаут мишки е описано по-рано (Alexander et al., 1999). PCR генотипизирането се извършва с помощта на Neo-специфичен набор от праймери (5'-AGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3' и 5'-CCTGATCGACAAGACCGGCTTC-3') заедно с ген-специфични набори от праймери за Crlf1 (5'-GCCTAATAGGTGCTGGGTGA{{ 18}}′ и 5′-GACCCTATCTGCGTTTTTCCA-3′). Събиране на тъкани Ембрионите бяха подредени съгласно критериите на Theiler (1989), както е описано по-рано (Kuure et al., 2005) и събрани след цервикална дислокация на бременни жени при дълбока анестезия с CO2. Късни ембрионални и постнатални малки бяха умъртвени чрез обезглавяване. Тъканта се дисектира в среда на Dulbecco, допълнена с 0,2 процента говежди серумен албумин (BSA), последвано от фиксиране с 4 процента параформалдехид (PFA) или органна култура. Органна култура Бъбреци, изолирани от миши ембриони E11.5 и E12.5, се поставят на повърхността въздух-течност, поддържана от Transwell® полиестерна мембранна система (Costar) и се култивират при 37 градуса във влажна 5 процента CO2 атмосфера с бъбречна културална среда [F12 :DMEM (1:1) плюс Glutamax (Gibco)], допълнен с 10 процента фетален говежди серум и пеницилин-стрептомицин (Ihermann-Hella и Kuure, 2019). За in vitro културата със 100 ng/ml екзогенен GDNF (ProSpec Ltd) (Sainio et al., 1997), насочена към количествено определяне на NPC, всеки урогенитален блок, съдържащ метанефрос, окончателният бъбречен рудимент, беше наполовина по протежение на linea mediana ventralis. Половината от всяка проба се култивира с екзогенен GDNF, докато другата половина служи като контрола. Експериментите за инхибиране на WNT първо бяха тествани с 50-100 ng/ml GDNF и 50-100 µM IWR1 (I0131-25, Sigma-Aldrich). Въз основа на тези експерименти за зависимост от дозата оптималните концентрации бяха 50 ng/ml GDNF и 75 µM IWR1. Хистология и имунооцветяване За проучвания, изследващи представляващия интерес маркер върху парафинови срезове, бъбреците бяха дисектирани от ембрионите или малките на посочените етапи, последвано от тъканна обработка и срезове, както е описано по-горе (Li et al., 2019). Във всеки анализ бяха използвани минимум пет среза от всеки бъбрек и три до пет различни бъбрека на генотип. Точните номера на примерите са дадени в легендите на фигурите. Хематоксилин и еозин (H&E) и имунохистохимия, извършени върху парафинови срезове, бяха завършени, както е описано по-горе (Li et al., 2019). Накратко, дисектираната тъкан се фиксира за една нощ с 4% PFA (pH 7,4), последвано от дехидратация и парафинизация с автоматичен тъканен процесор (Leica ASP 200). Бяха приготвени срезове с дебелина 5 µm и депарафинизирани в ксилол, последвано от рехидратиране, преди да бъдат оцветени с Harris H&E или подложени на индуцирано от топлина извличане на антиген в буфер за извличане на антиген (10 mM цитрат; рН 6.0). За имунооцветяване се използва 3 процента BSA за блокиране (1 час при стайна температура), последвано от 30 минути третиране с 0,5 процента водороден пероксид за хромогенно оцветяване. След това срезовете се инкубират с първични антитела за една нощ при плюс 4 градуса, последвано от инкубиране на специфично за вида вторично антитяло за 2 часа при стайна температура. Хромогенното откриване беше реализирано с комплект EnVision Detection System-HRP (DAB) (Dako).

Фиг. 8. Генетичното намаляване на нивото на Wnt11 частично спасява загубата на нефронов прогенитор в Gdnfhyper/hyper бъбреците. (A) ШЕСТ2-положителни нефронни прогенитори (NP, червено) са оскъдни в E14.5 Gdnfhyper/hyper бъбреци (средно 29,8 NPs/върх в 552 върха, анализирани в девет бъбрека). (B) Gdnfhyper/hyper; Wnt11 плюс /− бъбреците показват увеличение на общото изобилие от NP на ниша при липса на един алел Wnt11 (средно 40.7 NPs/върх в 107 върха, анализирани в четири бъбрека ). (C,D) PAX2-положителните клетки в Gdnfhyper/hyper (C) и Gdnfhyper/hyper;Wnt11 плюс /− (D) бъбреците показват подобни модели и количество при E14.5. (EH) При P0 оцветяването с SIX2 демонстрира подобрение в броя на NP чрез премахването на един алел Wnt11 (средно 20,3 NPs/връх в 610 Gdnfhyper/hyper връхчета спрямо средно 30,9 NPs/връх в Gdnfhyper/hyper; Wnt11 плюс /− съвети, анализирани в шест бъбрека/генотип), което е подкрепено от PAX2 оцветяване. Разпределението на SIX2-положителни NPs (A′,B′,E′,F′) и PAX2- положителни клетки (C′,D′,G′,H′) са показани без калбиндин ( зелен) сигнал, който изобразява UB епитела във всички бъбреци. Скала: 200 µm.

Е11.5 и Е12.5 бъбреци, подложени на цялостно имунофлуоресцентно оцветяване, бяха фиксирани и пермеабилизирани с 100 процента леденостуден метанол за 10 минути преди инкубиране за една нощ с първични антитела. Инкубирането със съответните видово-специфични вторични антитела се прилага на втория ден след енергично промиване с PBST (0,1 процента Tween 20 в PBS). Подробности за първичните и вторичните антитела, използвани в настоящото изследване, са изброени в Таблица S1. Хибридизация in situ Хибридизацията in situ беше проведена, както е описано по-горе (Ihermann Hella et al., 2014). Накратко, анти-сенс РНК сонда срещу Gdnf екзони беше транскрибирана и хибридизирана върху дебели участъци, получени от P4 бъбреци (10-15 участъци/бъбрек, n=3 бъбреци/генотип), вградени в 4 процента нискотопима агароза (NuSieve GTG, Lonza). BM Purple се използва за колориметрична реакция

ELISA Нивата на GDNF протеин в P7.5 бъбреците бяха измерени чрез ELISA, както беше съобщено по-рано (Kumar et al., 2015). GDNF Emax® имуноанализ (Promega) беше използван с киселинно третиране при извършване на ELISA. По-подробно, за всеки генотип, три бъбрека бяха лизирани веднага след дисекцията. След измерване на протеиновата концентрация с DC протеинов анализ (Bio-Rad), 25 ug от общия протеин се зарежда в ямката на ELISA плака. Всяка проба беше анализирана в два екземпляра.

Изобразяване Имунооцветяването и in situ хибридизацията върху срезове бяха изобразени с помощта на Zeiss AxioImager, оборудван с HXP 120V флуоресцентен светлинен източник, Hamamatsu Orca Flash 4.0 LT B&W камера и Zeiss AxioCam 105 цветна камера , или с Leica DM5000B, оборудван с Leica EL 6000 металхалогенен източник на светлина и Hamamatsu Orca-Flash4.0 V2 sCMOS камера. Цялото имунофлуоресцентно оцветяване беше изобразено с помощта на Zeiss AxioImager с приложението Zeiss ApoTome. Изобразяването на цялостно изображение за измерване на размера на непокътнатия бъбрек беше извършено с помощта на Leica MZFLIII, оборудван с камера Leica DFC7000T. Количествени анализи, базирани на имунооцветяване и изобразяване. Количественото определяне на гломерулната плътност се изчислява от последователните секции на Е18.5 и Р7 бъбреци. Бъбреците бяха разрязани и срезовете за гломерулно количествено определяне бяха подбрани на всеки 125 µm, за да се избегне повторение на броя на гломерулите. Броят на гломерулите във всяка секция се преброява ръчно и площта на всеки бъбрек се измерва със софтуер Fiji ImageJ (V1.51) чрез очертаване на контура ръчно. За да се изчисли гломерулната плътност, общият брой на гломерулите

Фиг. 9. Схема на ефектите на излишния GDNF върху развиващите се бъбреци на мишка. (A) В ембрионални бъбреци, подложени на активен растеж, нефронните прогениторни клетки (NPC, червено) получават секретирани насочващи сигнали (напр. Wnt11 и Wnt9b) от върховете на пъпките на уретера (UBT, тъмно синьо), за да контролират баланса на пролиферацията на NP и самообновяването и тяхната диференциация в перитубуларни агрегати (PA, розов клетъчен клъстер). (B) В постнаталните бъбреци идентичността на върха на UB (UB, светло синьо) се губи, както е молекулярно доказано от спада в експресията на например Wnt9b, Wnt11, Crlf1 и Etv4/5, обозначени с тънки червени букви. Постепенната загуба на получените от UB секретирани фактори (Wnt9b, Wnt11 и Crlf1) допринася за намаляването на пролиферацията и самообновяването на NP. Едновременно с това нивата на GDNF и FGF намаляват, което съвпада с ускорената диференциация на NP. Те заедно изчерпват бързо запаса от NP, което води до спиране на нефрогенезата. (C) Излишъкът на GDNF в ембрионални бъбреци индуцира анормална UBT морфология и увеличава експресията на получените от пъпките, секретирани регулаторни молекули (Crlf1, Sign, Wnt11 и Wnt9b). Излишната експресия на секретирани молекули, получени от пъпки, има инхибиторен ефект върху NP клетъчния цикъл, което води до намалена пролиферация и самообновяване. Намаляването на общите NP числа забавя диференциацията на PA, както се установява от намалената експресия на Wnt4. (D) В постнаталните бъбреци морфологията на UBT и по този начин нишата, която осигурява за NPS, се нормализира въпреки по-високата от WT експресия на секретирани мишени, получени от пъпки (Crlf1, Etv4/5 и Lama1). Заедно с нормализираните Wnt9b и Wnt11 (не са показани), тези молекулярни промени субсидират нормалната пролиферация, самообновяване и диференциация на NP, както се вижда от поддържането на голяма популация на NP, по-висока експресия на Wnt4 и подобно количество прекурсори на нефрони (розови клъстери от клетки), както при WT ембрионални бъбреци. Чрез такива механизми конститутивният излишък на GDNF под неговия собствен промотор позволява на нефрогенната програма да продължи до P7. Тъмносив текст, непроменен израз; червен текст, намалено изражение; зелен текст, повишено изражение.

и броят на гломерулите в кората се преброяват отделно. След това за всяка проба се изчисляват средната обща бъбречна площ и общият и кортикалния брой на гломерулите. Средната гломерулна плътност се изчислява чрез разделяне на средния гломерулен брой на средната измерена площ. Средната стойност на кортикалните гломерули в рамките на цялата средна площ се изчислява чрез разделяне на средния брой на кортикалните гломерули на средната измерена обща площ. Записани са само гломерули с непокътнати форми. Количествено определяне на общия ШЕСТ2-положителен NPS при E11.5 (n=4 за WT, n=5 за Gdnfhyper/hyper) и E12.5 (n=10 бъбреци/ лечение, три независими експеримента) се основават на имунофлуоресцентното оцветяване на цялата верига. Изображенията бяха заснети с приложението Zeiss ApoTome и след това обработени със софтуера Imaris (Bitplane), използвайки проследяване на място. Всички изображения бяха обработени с идентични протоколи за анализ. За да се нормализира вариацията между котилата, средното количество на SIX2-положителни NPs в WT бъбреците във всяко котило беше зададено на 100 процента, а количеството на SIX2- положителни NPs в Gdnfhyper /хипер бъбреците се сравнява със средното количество в WT бъбреците в котилото. Митотичният индекс на SIX2-положителни NPS в E12.5 бъбреци (n=10 бъбреци/третиране, три независими експеримента), култивирани с екзогенен GDNF, бяха изчислени по подобен начин за нормализиране на вариацията между котилата.

Средният дял на пролифериращите SIX{{0}}положителни NPs в WT бъбреците и бъбреците, култивирани без екзогенен GNDF във всяко котило, беше зададен на 100 процента, а делът на пролифериращите SIX{{2 }}положителни NPs в присъствието на излишък от GDNF (Gdnfhyper/hyper бъбреци и екзогенно приложение) от едно и също котило беше нанесено на фигурата след сравняване с WT котила. Митотичният индекс на SIX2-положителен NPS в E11.5 бъбреци, култивирани с екзогенен GDNF, беше начертан като оригинални данни/стойност. Изчисляването на средния SIX2-положителен NPS за нефрогенна ниша (E14.5 и P0) и нефрогенни ниши с прогенитори (P3-P6) беше извършено чрез имунофлуоресцентно оцветяване в парафинови срезове. Броят на ШЕСТ2-положителни NPS беше преброен със софтуера Fiji ImageJ (V1.51) на всяка секция, избрана за анализа с помощта на анализ на частици, а броят на върховете беше преброен ръчно на съответните секции. Броят на анализираните проби при E14.5 беше три бъбрека за WT и Gdnfhyper/hyper бъбреци и два бъбрека за Gdnfhyper/hyper; Wnt11 плюс /-. Броят съвети, анализирани при E14.5, беше 207 в WT, 431 в Gdnfhyper/hyper и 107 за Gdnfhyper/hyper; Wnt11 плюс /- бъбреци. Броят на анализираните проби при P0 е три бъбрека на генотип, а броят на анализираните върхове, който е представен на съответните фигури, варира от 10 до 315, като е най-нисък в бъбреците WT P6, в които върховете рядко присъстват. Измерванията на върха на UB бяха извършени с помощта на програмата LAS X на операционната система на микроскопа Leica след 48 h култура в присъствието на определени химикали и визуализация на върховете с E-cadherin антитяло (Таблица S1). Върховете бяха измерени от шест бъбрека във всяко състояние на два независими набора от експерименти, в които броят на измерените връхчета беше: 101 за GDNF, 131 за IWR1 и 115 за 75 µM IWR1 плюс 50 ng/ml GDNF. Измерванията на размера на бъбреците в експерименти, оценяващи ефекта от делеция на Wnt11 в Gdnfhyper/hyper фон, бяха проведени със софтуера Fiji ImageJ (V1.51) върху изображения с цял монтаж чрез ръчно проследяване на контура на бъбрека. Статистически анализ Всички стойности са представени като средно±sem, с изключение на анализа на основните ефекти на Gdnf и Wnt11 върху размера на бъбрека, който е показан като средно±sd. Статистическата значимост е зададена на P<0.05 for="" all="" the="" analyses.="" independentsamples="" two-tailed="" t-test="" was="" used="" for="" pairwise="" comparisons="" with="" spss="" statistics="" software="" (ibm;="" version="" 25)="" in="" the="" study="" unless="" otherwise="" noted.="" the="" data="" obtained="" via="" in="" vitro="" tissue="" culture="" with="" exogenous="" gdnf="" was="" analyzed="" with="" the="" paired-sample="" t-test="" using="" spss="" statistics="" software.="" the="" impact="" of="" genetically="" modified="" gdnf="" and="" wnt11="" expression="" on="" kidney="" size="" was="" analyzed="" via="" two-way="" anova="" followed="" by="" main="" effects="" test="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" statistical="" significance="" for="" the="" deviation="" of="" gene="" distribution="" from="" mendelian="" ratio="" was="" performed="" using="" the="" χ2="" test="" also="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" data="" obtained="" from="" elisa,="" qrtpcr,="" and="" wnt="" inhibition="" experiments="" were="" analyzed="" with="" one-way="" anova="" followed="" by="" bonferroni="" posthoc="" test="" using="" spss="" statistics="" software.="" reverse="" transcription="" and="" quantitative="" rt-pcr="" (qrt-pcr)="" experiments="" were="" conducted="" as="" previously="" reported="" (kumar="" et="" al.,="" 2015).="" in="" more="" detail,="" 150-500="" ng="" of="" total="" rna="" from="" each="" sample="" (n="3" kidneys/genotype="" at="" the="" given="" stage)="" was="" treated="" with="" rnase-free="" dnase="" i="" (thermo="" fisher="" scientific).="" the="" reverse="" transcription="" reaction="" was="" performed="" with="" random="" hexamer="" primers="" and="" revertaid="" reverse="" transcriptase="" (thermo="" fisher="" scientific)="" immediately="" after="" inactivation="" of="" dnase="" i="" with="" 5="" mm="" edta="" at="" 65°c.="" complementary="" dna="" (cdna)="" was="" diluted="" 10×="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" qrt-pcr.="" for="" qrt-pcr,="" lightcycler="" 480="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" or="" bio-rad="" c1000="" touch="" thermal="" cycler="" upgraded="" to="" cfx384="" system="" (bio-rad),="" supplied="" with="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" and="" 250="" pmol="" primers="" were="" loaded="" into="" the="" well="" of="" 384-well="" plates="" with="" a="" total="" volume="" of="" 10="" µl.="" negative="" control="" was="" always="" included="" in="" every="" reaction="" via="" setting="" conditions="" with="" minus-reverse="" transcription="" or="" water.="" a="" combination="" of="" pgk1,="" hprt,="" and="" gapdh="" was="" used="" as="" the="" reference="" genes="" in="" all="" the="" qrt-pcr="" experiments,="" except="" the="" one="" with="" p7.5="" kidneys,="" in="" which="" mouse="" actb="" as="" the="" reference="" gene.="" primer="" sequences="" can="" be="" found="" in="" table="">

Благодарности Благодарим на персонала на звената за изображения и светлинна микроскопия на Biomedicum в Хелзинкския институт за науки за живота (HiLIFE) за тяхната ценна помощ при анализа на изображенията и техниките, свързани с количественото определяне. Мишките Wnt11 бяха любезно предоставени от професор Seppo Vainio (Университет на Оулу, Финландия) и изпратени до Центъра за лабораторни животни на HiLIFE, Университета в Хелзинки