Откриване и идентифициране на потенциални антимеланогенни активни съставки на Bletilla Striata

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 и Hongjiang Chen1,2*

Резюме

Заден план:Bletilla striata е основното лекарство от много класически формули за избелване на кожата в традиционната китайска медицина (TCM) и напоследък се използва широко в козметичната индустрия. Въпреки това, активните му съставки все още не са ясни и влакнестите му корени не се използват ефективно. Целта на настоящото изследване е да се открият и идентифицират неговите потенциални антимеланогенни активни съставки чрез модел на риба зебра и молекулярно докинг.

Методи:Theантиоксидантактивностите са оценени чрез 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH) радикална активност, 2,2'-азино-бис-(3-етилбентиазолин-6-сулфонова киселина) (ABTS ) активност за отстраняване на радикали и редуциране на желязоантиоксидантанализ на мощност (FRAP). Антимеланогенната активност се оценява оттирозиназаинхибиторендейностin vitro и меланинов инхибитор при рибки зебра. Химическите профили бяха извършени чрез ултра-високо ефективна течна хроматография, комбинирана с квадруполна време-пролетна тандемна масспектрометрия (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Междувременно, потенциалните антимеланогенни активни съставки бяха временно идентифицирани чрез молекулярно докингване.

Резултати:95-процентният етанолов екстракт от фиброзни корени на B. striata (EFB) притежава най-силните инхибиторни активности на DPPH, ABTS, FRAP и тирозиназа, с IC50 5.94 mg/L, 11.69 mg/L, 6.92 mmol FeSO4/g, и 58.92 mg/L, съответно. В допълнение, EFB и 95-процентният етанолов екстракт от клубена на B. striata (ETB) значително намаляват синтеза на меланин в ембриони на риба зебра по дозозависим начин. 39 химически състава, включително 24 стилбеноида, бяха условно идентифицирани от EFB и ETB. Молекулярният докинг показва, че има 83 (включително 60 стилбеноиди) и 85 (включително 70 стилбеноиди) съединения, показващи по-силен афинитет на свързване към тирозиназа и аденилат циклаза.

Заключение:Настоящите констатации подкрепят обосновката за използването на EFB и ETB като естествени агенти за избелване на кожата във фармацевтичната и козметичната промишленост.

Ключови думи: Bletilla striata, антиоксидант, антимеланогенна активност, UPLC-Q-TOF-MS/MS, риба зебра, молекулярен докинг

Щракнете, за да цистанче странични ефекти и ползи за антиоксидант

Заден план

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. е тревисто многогодишно растение, широко разпространено в Азия, като Китай, Корея и Япония [1]. Изсушената грудка на B. striata, известна още като Baiji, записана за първи път в класическия труд на Shennong от Materia Medica, е била широко използвана като традиционна китайска медицина (TCM) от хиляди години в Китай. Китайските фармакопеи посочват, че притежава способността да действа стягащо при хемостаза и аналгезия, поради което се използва широко за лечение на хематемеза, хемоптиза, травматично кървене, язви, подуване и напукана кожа [2, 3]. Фармакологичните изследвания показват, че B. striata притежава широк спектър от биологични действия, като зарастване на рани [4, 5], противоязвена [6, 7], хемостатична [8],анти-възпаление[9], антиоксидант[10], антибактериално [11], противогрипно вирусно [12] и против стареене [13]. В същото време B. striata съдържа различни класове химически състави, включителнополизахариди[14], бибензили, фенантрени, антрахинони,флавоноидии 2-изобутилмалати [3, 15] и др.

B. striata е основното лекарство на много класически формули за избелване на кожата в TCM [16] и напоследък се използва широко в козметичната индустрия [17]. Въпреки това, неговите активни съставки все още са неясни и дори някои резултати от изследванията са противоположни. Например, резултатите от изследването, дадени от Chenet al. показват, че 95 процента етанолов екстракт от B. striata притежава по-висока тирозиназна инхибиторна активност от тази на неговия воден екстракт със степен на инхибиране от 68,36 процента in vitro [18], докато резултатът от Huang et al. показаха, че инхибиторната активност на водния екстракт от B. striata върху тирозиназата е по-силна от тази на 95 процента етанолов екстракт в рамките на степен на инхибиране от 62 процента in vitro [19]. Резултатите от изследването на Luetal [20] и Linghuetal [21] показаха, че както водният, така и 95-процентният етанолов екстракт от B. striata, особено неговото фракциониране с хлороформ, могат да инхибират растежа на B16 клетките и да индуцират тяхната апоптоза по начин, зависим от концентрацията.

Тъй като in vitro тестовете за инхибиране на тирозиназа и меланомни клетъчни линии не включват сложните физиологични условия in vivo и абсорбцията, метаболизма, разпределението и екскрецията на тестовата проба, много от пробите показват значителна инхибиторна активност срещу тирозиназни и меланомни клетъчни линии в vitro, въпреки това, показва слаба ефективност или дори неефективност in vivo [22,23]. Глабридинът показва значителна инхибиторна активност на тирозиназата с IC50 0.43μmol/L, което е 176 пъти по-силно от това на коджиковата киселина. Независимо от това, не е имало инхибиращ ефект върху пигментацията на рибата зебра in vivo [24].

Междувременно влакнестите корени на B. striata (FB) са страничните продукти, генерирани по време на обработката на B. striatatuber (TB). Съвременни изследвания показват, че FB съдържа подобни съединения с ТБ и с по-високо съдържание на фенол [25]. В допълнение, антибактериалната [26], антиоксидантната и антитирозиназната активност на FB екстракта са по-силни от тези на TB екстракта [25]. Ресурсите на FB обаче не бяха използвани ефективно и бяха изоставени в земеделските земи, което доведе до загуба на FB ресурси и замърсяване на околната среда [27].

Риба зебра (Danio rerio), малка тропическа сладководна риба, е нововъзникващ животински модел за фармакологията

и токсикологични изследвания in vivo, с много предимства, включително ниска цена, кратък жизнен цикъл, висока прозрачност, лесна поддръжка, висока плодовитост и необходими по-малко тестови проби [28, 29]. Освен това рибата зебра има меланинови пигменти на повърхността, което позволява лесно наблюдение на процеса на пигментация и е широко използвана в антимеланогенното изследване [28, 30].

В настоящото изследване сравнихме антиоксидантната и инхибиторната активност на тирозиназата на суровия полизахарид и 95 процента етанолов екстракт от TB и FB in vitro и антимеланогенните активности в модел на рибка зебра. Междувременно, потенциалните антимеланогенни активни съставки бяха временно идентифицирани чрез молекулярно докингване. Ние открихме, че 95 процента етанолов екстракт от TB (ETB) и FB (EFB) притежава значителни антиоксидантни и антитирозиназни активности и може да намали синтеза на меланин в ембриони на риба зебра по дозозависим начин. По този начин ETB и EFB могат да се използват като естествени агенти за избелване на кожата във фармацевтичната и козметичната промишленост.

Методи

Химикали и реактиви

Тирозиназа, 3-(3,4-дихидроксифенил)-L-аланин (L-DOPA) и арбутин са закупени от компанията за реагенти Aladdin (Шанхай, Китай). 2,2-дифенил{{8 }}пикрилхидразил (DPPH), 2,2'-азино-бис-(3-етилбентиазолин-6-сулфонова киселина) (ABTS),6-хидрокси-2,5,7 ,8-тетраметилхроман-2-карбоксилова киселина (Trolox) и 2,4,6-трис (2-пиридил)-s-триазин (TPTZ) са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Ацетонитрил и метанол (клас HPLC) бяха закупени от Tedia (Fairfield, OH, USA). Дейонизираната вода се приготвя от водната система Milli-Q (18.2 MΩ, Millipore, САЩ).

Процедура за събиране и извличане на растения

B. striata беше събрана от Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd. (Quzhou, Zhejiang, Китай). Образците от ваучери бяха депозирани в Хербариума на Фармацевтичния колеж на Zhejiang (номер на достъп 190615). Цялото растение беше разделено на грудки и влакнести корени. Впоследствие те бяха нарязани на малки парчета и съответно изсушени чрез вакуумно лиофилизиране.

Изсушените и прахообразни проби (TB и FB) се екстрахират под обратен хладник с 95 процента етанол три пъти (1,5 часа за всеки път). Екстрактът се филтрува с помощта на филтърна хартия What man (No.1). Филтратът се концентрира до сухо в ротационен изпарител (Hei-VAP, Heidolph, Германия) при 50 градуса и след това се изсушава чрез вакуумна сушилня чрез замразяване. Добивите при екстракция с етанол на TB (ETB) и FB (EFB) са съответно 5,21 и 6,53 процента. Остатъците бяха използвани за извличане на суровия полизахарид чрез диспергиране във вода при 80 градуса за 4 часа и утаяване с етанол [31]. Добивите на полизахариди от TB (PTB) и FB (PFB) са съответно 14,75 и 6,45 процента.

екстракт от цистанче

Химичен анализ

Химическият анализ беше извършен на ултрависоко ефективна течна хроматография, комбинирана с квадруполна времепролетна тандемна масспектрометрия (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Хроматографското разделяне се извършва на Waters Acquity UPLC tem (Waters Corp., Milford, MA, САЩ) с колона WatersBEH Shield RP C18 (100×2.1mm, 1.7μm) при 3{ {43}} степен. Подвижната фаза се състои от 0,1 процента мравчена киселина във вода (А) и ацетонитрил (В), с линеен градиент: 0–3 минути, 5–16 процента В; 3–8 минути, 16–30 процента B; 8–10 минути, 30–35 процента B; 10–15 минути, 35–55 процента B; 15–18 минути, 55–80 процента B; 18–19 минути, 80–5 процента B; 19–20 минути, 5 процента B. Скоростта на потока беше 0,3 mL/min, а инжекционният обем беше 2 μL.

Експериментите TOF-MS/MS бяха проведени с помощта на AB SCEIX Triple TOF 5600 масспектрометрия (AB SCIEX, Foster City, Калифорния, САЩ), оборудвана с йонизация с електроспрей (ESI). MS откриването се провежда по метода на отрицателна йонизация. Параметрите бяха зададени както следва: температурата на източника и температурата на десолватация бяха съответно 100 градуса и 450 градуса; дебитът на газ за десолватация е 900 L/h; капилярното напрежение е 2kV; напрежението на конуса е 40 V; енергията на сблъсък е 22 eV; и пълният сканспектър е от 100 до 2000 Da.

Антиоксидантни анализи DPPH радикална активност

Активността за отстраняване на DPPH радикали се определя в съответствие с Ali et al. с леки модификации [32]. Накратко, 50 μL разтвор на тестова проба се смесва с 150 μLDPPH етанолов разтвор (0.2mM) в 96-плаки с ямки и се държи на тъмно за 30 минути . Абсорбцията на сместа при 517 nm (А1) беше оценена чрез спектрофотометър за микроплака (Thermo Fisher Scientific, Америка). Празният разтвор без тестова проба, смесен с DPPHетанолов разтвор, се определя като положителна група (A0). Празният разтвор без DPPH, смесен с разтвор на тестова проба, беше определен като празна група (А2). Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра. Степента на поглъщане на DPPH радикали се изчислява по следната формула:

Скорост на отстраняване на DPPH радикали (проценти) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 процента.

ABTS радикална активност

Капацитетът за отстраняване на радикали ABTS се измерва с помощта на метода, описан от Ali et al. [32]. Накратко, водният разтвор на 7mMABST се смесва с 2,45 mM калиев персулфат в съотношение 1:1 (обем/обем) и се инкубира при стайна температура на тъмно в продължение на 16 часа, за да се получи ABST плюс основния разтвор. Основният разтвор се разрежда с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), за да се регулира абсорбцията на (0.72±0.2) при 734nm. 20 μL тестови проби при различни концентрации се смесват старателно с 180 μL ABTS плюс разтвор. Реактивните смеси се държат на тъмно в продължение на 5 минути и след това се измерва абсорбцията (В1) при 734 nm. Абсорбцията на смесите без тестова проба и ABST плюс бяха определени като B и B, съответно. Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра. Скоростта на поглъщане на радикали ABTS се изчислява по следната формула:

Скорост на отстраняване на радикали ABTS (проценти) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 процента.

Анализ на желязо-намаляваща антиоксидантна мощност (FRAP)

Редукционната активност на третото желязо се определя съгласно процедурите на Kosakowska et al. [33]. 300mM ацетатен буфер, 10mM TPTZ (2,4,6-трис (2-пиридил)-s-триазин) и 20mM FeCl3 се смесват при (v/v/v) съотношение 10:1:1 за приготвяне на работния реагент. 100 μL от всеки разтвор на тестова проба се смесва със 100 μL TPTZ работен реагент, инкубира се при 37 градуса за 20 минути и абсорбцията се определя при 593 nm. Междувременно серия от стандартни разтвори на FeSO4 в диапазони на концентрация 0–1000ug/mL бяха използвани за изготвяне на калибрационната крива. Капацитетът за редуциране на желязо е изчислен при образуването на интензивен Fe2 плюс -TPTZ син комплекс. Резултатите бяха изразени като Fe2 плюс антиоксидантен капацитет (mmol FeSO4/g екстракт).

Тирозиназна инхибиторна активност

Инхибиторните активности на тирозиназата се определят чрез спектрофотометричен метод, като се използва L-DOPA като субстрат [34]. Накратко, 50 μL пробни разтвори при различни концентрации се смесват с 50 μL тирозиназа (200 единици/mL, разтворени във фосфатен буфер с рН 6,8) в 96-ямка плаки и се инкубират за 15 минути при 25 градуса. След това реакцията се инициира с добавяне на L-DOPA (50 μL). След инкубиране в продължение на 30 минути при 25 градуса, абсорбцията при 490 nm (Aa) се определя с помощта на мултискан спектрофотометър за микроплаки (ThermoFisher Scientific, Америка). По същия начин, абсорбцията на пробните ямки без тирозиназа (Ab) и контролните ямки с ензим, но без проба (Ab) бяха открити по едно и също време. Инхибиторната активност на тирозиназата се изчислява по следното уравнение:

Степен на инхибиране на тирозиназата (проценти)=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 процента.

IC50 се изчислява с помощта на уравнението на GraphPad Prism, както е показано по-долу:

Y=min плюс (max − min)/1 плюс 10(x−logIC50) × наклон на хълма

X представлява концентрацията на инхибитора; Y представлява данните за инхибиране (проценти) заедно с техните минимални (мин) и максимални (максимални) стойности; Наклонът на хълма е факторът на наклона.

Cistanche инхибира активността на тирозиназата.

Инхибитор на меланин в риба зебра

Рибки зебра от див тип AB линия (предоставени от Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, Zhejiang Province) бяха настанени във вода за риба (0.2 процента незабавна океанска сол в дейонизирана вода, pH 6,9–7,2, проводимост 48{ {18}}–510 mS/cm и твърдост 53,7–71,6mg/L CaCO3) в 14/10h светъл/тъмен фотопериод при постоянна температура 28±0,5 градуса и хранени с живи саламура два пъти дневно. Ембрионите на зебрата са получени от естествено хвърляне на хайвера и са събрани в рамките на 30 минути. Анализът на зебрата е акредитиран от Асоциацията за оценка и акредитация на грижите за лабораторни животни (AAALAC). Настоящото проучване е одобрено от IACUC (Институционален комитет за грижа и използване на животните) към Hunter Biotechnology, Inc. и номерът на одобрението на IACUC е 001458.

Ембрионите на етап 6 часа след оплождане (hpf) бяха третирани с всеки екстракт при шест концентрации (10, 30, 62,5,125, 250 и 500 mg/L) в продължение на 72 часа, за да се оцени максималната нелетална концентрация (MNLC ). В резултат на това MNLC на целия екстракт бяха повече от 62,50 mg/L. 10 ембриони бяха поставени в 6-ямка и бяха изложени на тествани проби при концентрации от 10 и 30 mg/L от 6 hpf до 54 hpf (48h експозиция ). DMSO (0,05 процента, обем/обем) и арбутин (10 и 30 mg/L) бяха използвани съответно като нормална и положителна контрола.

Синхронизираните ембриони бяха събрани и наблюдавани под стереомикроскоп (SZX7, Olympus, Япония), оборудван с цифрова камера (VertA1, Китай). Натрупването на меланин, пряко свързано със зоните на пигментация на рибката зебра, беше изчислено с помощта на програмата за манипулиране на изображения GNUImage (GIMP версия 2.10.2) и изразено като процент по отношение на отрицателната контрола (натрупване на меланин 100 процента) [28, 30].

Молекулярно докинг изследване

158 съединения, изолирани от B. striata в литературата [2], включително 19 гликозиди, 28 бибензили, 19 фенан-трени, 18 бифенантрени, 23 дихидрофенантрени, 5 антоцианини, 11 стероиди, 8 тритерпеноиди, 12 фенолни киселини, 5 хинони, и 10 други съединения бяха използвани като лиганди. 3D структурите бяха начертани от ChemBio3D и бяха оптимизирани с помощта на MM2 и Autodock Tools. 3D кристалната структура на тирозиназа (PDBID: 5M8N) и аденилат циклаза (PDB ID: 5IV3) бяха извлечени от RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Всички водни молекули и хетероатоми бяха отстранени от кристалните структури с помощта на Chimera и MGL Tools. И накрая, Autodock

Vina беше използван за свързване на рецепторния протеин с малките молекули лиганди. Параметрите на докинг мястото на рецепторния протеин бяха зададени като -36.700, 7.034, -19.104 и -17.467, -22.807, 2.786, съответно, според оригиналния лиганд мимозин и LRE1 [35]. За да се постигне по-висока изчислителна точност, бяха генерирани 20 параметъра за изчерпателност за всеки рецептор и конформацията с най-висок афинитет беше избрана като крайна докинг конформация и визуализирана в Pymol2.3. Междувременно оригиналните лиганди мимозин и LRE1 бяха взети като положителна контрола [36].

In silico ADMET прогноза

Първите 3 попадения от B. striata притежават по-добър афинитет на свързване с тирозиназа и аденилат циклаза, бяха подложени на ADMET анализ. QikProp в Schrodingersuite беше използван за изчисляване на техните физични свойства и характеристики, свързани с лекарството, включително молекулно тегло (MW), прогнозиран коефициент на разпределение октанол/вода (QPlogPo/w), прогнозирана разтворимост във вода (QPlogS), прогнозирана видима Caco-2 клетка пропускливост за чревно-кръвната бариера (QPPCaco), предвиден коефициент на разпределение мозък/кръв (QPlogBB), предвидена пропускливост на кожата (QPlogKp), предвидена IC50 за блокиране на HERGK плюс канали (QPlog HERG) и предвидена човешка орална абсорбция. Свойствата бяха оценени въз основа на петоричното правило на Липински и литература [37, 38].

Симулация на молекулярната динамика

За да се изследват стабилността и динамичните флуктуации на комплекса лиганд-протеин при симулирана биологична среда и допълнително да се валидират резултатите от докинга, съединението блестрин D (75) беше избрано като лиганд за симулационното изследване на молекулярната динамика (MD), въз основа на резултат от молекулярно докинг. Комплексът от блестрин D с тирозиназа и аденилат циклаза бяха извършени MD симулации и работеха за 100 ns, използвайки воден режим TIP3P. Стойностите на средно квадратично отклонение (RMSD) на атомите на протеиновия гръбнак спрямо първоначалната структура бяха изчислени, за да се изследва стабилността на протеина в хода на периода на симулация [39].

Резултати

Химичен състав

Типичните базови пикови хроматограми на ETB и EFB бяха показани на Фиг. 1. Софтуерът PeakView беше използван за идентифициране на съставките. Молекулната формула е определена точно в рамките на масова грешка от 10 ppm. Точното молекулно тегло и фрагментите бяха използвани за идентифициране на компонентите според литературата и безплатната база данни за химическа структура, като ChemSpider и Massbank. В резултат на това 39 химични състава, включително 24 стилбеноида (бибензили, фенантрени и техните производни), 6 гликозида, 4 фенолни киселини, 3 хинона, 1 стероид и 1 друго съединение бяха условно идентифицирани от EFB и ETB. В същото време тяхното относително полу-количествено определяне беше извършено чрез измерване на пиковите площи на всяко съединение в режим MS, използвайки екстрахираните йонни хроматограми [40]. Подробната информация за идентификацията и тяхното относително съдържание (светлини на топлинната карта, колкото по-тъмен е цветът, толкова по-висок е концентрация) са обобщени в таблица 1.

Антиоксидантен капацитет

Добре известно е, че ултравиолетовото А (UVA) облъчване може да индуцира производството на реактивни кислородни видове (ROS) и да медиира прекомерната меланогенеза в кожните клетки. Естественият полифенол е инхибитор на генерирането на ROS и може да е отговорен за антимеланогенната активност на растителните екстракти [41]. , 42]. По този начин, в настоящото изследване, антиоксидантният капацитет беше оценен чрез DPPH, ABTS радикална активност и FRAPassay. Резултатите (Таблица 2 и Фиг. 2) показаха, че EFB (IC50=5.94mg/L) притежава най-силната DPPHрадикална активност in vitro в сравнение с PTB(IC50=548.24 mg/L) , PFB (IC50=285.81 mg/L) и ETB(IC50=65.25mg/L). Подобна тенденция се наблюдава при ABTS и FRAP анализ. 95-процентните етанолни екстракти от TB и PB имат по-силна антиоксидантна активност in vitro от техните сурови полизахариди. В допълнение, EFB проявява по-силна антиоксидантна активност от ETB, което е в съответствие с резултатите от предишни изследвания [25].

Тирозиназна инхибиторна активност

Тирозиназата е ключовият ограничаващ скоростта ензим в пътя на биосинтезата на меланин и е широко използван за идентифициране на потенциала на природните продукти с антимеланогенезен ефект [43]. Резултатите (фиг. 3) показват, че ETB и EPB имат по-силна тирозиназна инхибиторна активност от PTB и PPB in vitro, което е в съответствие с предишни резултати от изследвания [25]. EFB показва по-силна активност на инхибиране на тирозиназата в зависимост от дозата (между 20 и 200 mg/L) с IC50=58.92mg/L отколкото ETB(IC50=75.44mg/L) и положителното съединение арбутин (IC{ {11}}.02 mg/L).

Инхибитор на меланин в риба зебра

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), което показва, че носителят 0,05 процента DMSO не е повлиял производството на меланин в ембриони на риба зебра. Въпреки това, след излагане на тестваните проби и арбутин в продължение на 48 часа, ембрионите на рибките зебра показват различни степени на отлагане на меланин (фигури 3B, 4), с изключение на PFB 10 mg/L група. Прави впечатление, че относителното съдържание на меланин в групите с ETB 10 mg/L (78,38 процента) и 30 mg/L (64,72 процента) е значително по-ниско от това в групите с PTB 10 mg/L (93,06 процента) и 30 mg/L (82,02 процента) (p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Молекулярен докинг

Тирозиназата е ензимът, ограничаващ скоростта в биосинтезата на меланин: хидроксилиране на тирозин до 3,4-дихидрокси-фенилаланин (DOPA) и окисление на DOPA тодопахинон. Следователно, тирозиназата се счита за критична цел за развитието на инхибитори на меланогенезата [44]. В допълнение, аденилатциклазата е ключов ензим на cAMP-индуцираната меланогенеза. Свързването на меланотропин алфа полипептид (-MSH) с MC1R рецепторите индуцира активирането на аденилат циклазата, повишаване на нивото на сАМР, повишена експресия на тирозиназния ген и впоследствие увеличаване на синтеза на меланин [45]. Ето защо, ние извършихме молекулярно докинг изследване на 158 съединения, изолирани от B. striata по-рано [2], с тирозиназа и аденилат циклаза. Енергиите на свързване на изследваните лиганди с тирозиназа и аденилатциклаза са обобщени в таблица S1. Има 83 (включително 60 стилбеноиди) и 85 (включително 70 стилбеноиди) съединения, които показват по-силен афинитет на свързване към тирозиназа и аденилат циклаза, в сравнение с тези на оригиналните лиганди мимозин (- 6,4 kcal/mol) и LRE1 (- 8,5 kcal /mol). 1,8-бис(р-хидроксибензил)-4-метоксифенантрен-2,7-диол (56), блестрин D (75) и 2,7-дихидрокси -1,6-бис(р-хидроксибензил)-4-мет-окси-9,10-дихидрофенантрен (93) са първите три лиганда към тирозиназата, с енергия на свързване -10.2, 10.0 и 9.7kcal/mol, съответно. Докато блестрин D(75), блестрин B (73) и 3,3′-дихидрокси-5-метокси-2,5′,6-трис(р-хидроксибензил) бибензил (42) са първите три лиганда към аденилат циклаза, с генериране на свързване - 12,1, - 11,9 и - 11,6 kcal/mol, съответно. Техните теоретични афинитети на свързване и взаимодействия лиганд-аминокиселина са обобщени в таблица 3.

Струва си да се отбележи, че блестрин D (75), бифенантреново съединение, влиза в свързващия джоб на тирозиназа и аденилат циклаза (фиг. 5) и проявява значителни афинитети на свързване към тирозиназата и аденилат циклазата. Взаимодействията на Van der Walls допринасят за общата стойност на енергийното взаимодействие, докато хидроксилната група произвежда водородни връзки с аминокиселинни остатъци Glu 451, Arg114 на тирозиназа и Val 167 на аденилат циклаза, съответно (Таблица 3 и Фиг. S1). Съединение 93 също показва значителни афинитети на свързване към тирозиназа чрез образуване на 6 водородни връзки с аминокиселинни остатъци Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 и Gln236.

In silico ADMET прогноза

Прогнозираните стойности на няколко важни параметъра заедно с техния приемлив диапазон бяха обобщени в таблица 4. Освен QPlogS на 3,3′,5-триметоксибибензил, блестрин B и блестрин D, и QPlogBB на 3,3′,{{6} }триметоксибибензил, всички други изчислени свойства на ADMET на първите три попадения бяха в рамките на очакваните диапазони, междувременно QPlog HERG на всичките три най-добри попадения беше по-малко от -5, което показва, че те са лекарствен потенциал за употреба от хора. QPlog Kp на всичките три най-добри попадения както за тирозиназа, така и за аденилатциклаза, с изключение на 3,3′,5-триметоксибибензил, са в благоприятния диапазон, което показва, че тези съединения могат лесно да проникнат в кожата.

Молекулярна динамична симулация

Графиката на RMSD показа, че стойностите на RMSD на комплекса протеин-лиганд не се колебаят значително през целия период на симулация. Стойностите на RMSD (фиг. 6A) на блестрин D с тирозиназа и аденилатциклазен комплекс бяха определени в диапазона от 1,5 до 2,8 Å и съответно от 2.0 до 3,6 Å. Стойността на RMSF, отразяваща гъвкавостта на всяка остатъчна симулация. Остатъците с по-високи RMSF стойности разкриха, че са по-гъвкави (фиг. 6B). Установено е, че RMSF стойностите на аминокиселинните остатъци в бримковите области силно варират. Въпреки че остатъците от активните сайтове поддържат малка стойност на RMSF (по-малко от 1.0Å), като Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 и Arg230 в тирозиназата и Val167, Leu102, Phe45, Lys95 и Leu166 в аденилат циклазата, което показва, че джобовете за подвързване са запазени стабилни. Молекулните взаимодействия на блестрин D с тирозиназа и аденилат циклаза са показани на фиг. 7.

Свободните енергии на свързване бяха изчислени чрез метода на молекулярната механика-генерализирана повърхностна площ (MM-GBSA) [39]. Предсказаната свободна енергия на свързване на блестрин D с тирозиназа и аденилатциклаза беше -96,94 kcal/mol и -139,69 kcal/mol, съответно, което предполага, че взаимодействията на свързване са били спонтанни (Таблица 5). Освен това, приносите, благоприятстващи свързването на лиганда, бяха неполярно взаимодействие на солватация, ван дер Ваалс и електростатично взаимодействие.

Струва си да се отбележи, че видовете и съдържанието на химическите компоненти в EFB са повече от тези в ETB. Пиковите площи на всички идентифицирани съединения в EFB са приблизително два пъти по-големи от тези в ETB. Mili-tarine беше най-разпространеното съединение както в EFB, така и в ETB, което притежаваше значителна антиоксидантна, противовъзпалителна и невропротективна активност и беше избрано като химичен маркер за контрол на качеството на B. striata в изданието на Китайската фармакопея 2020 [46]. Относителната пикова площ на militarine в EFB (38,39 × 106) е малко по-висока от тази в ETB (30,48 × 106). Гастродин е добре познато съединение в много китайски билкови лекарства, като Gastrodia elata, което проявява значителни инхибиторни ефекти върху тирозиназата и премахване на радикали [30]. Относителната пикова площ на гастродин в EFB (1,43 × 106) е малко по-ниска от тази в ETB (2,17 × 106).

95-процентните етанолни екстракти от TB и PB имат по-силна антиокислителна активност in vitro от техните сурови полизахариди. В допълнение, EFB проявява по-силна антиоксидантна активност от ETB, което е в съответствие с предишните резултати от изследване [25]. Това явление може да се дължи на факта, че EFB съдържа по-високо ниво на антиоксидантни съединения, като милитарини и стилбеноиди (естествени растителни полифеноли). Например, относителната пикова площ на 4,8,4′,8′-тетраметокси-[1,1′-бифенантрен]-2,7,2′,7′-тетрол, бифенантрен с четири фенолни хидроксилни групи, беше 9,15×106 във FB, докато беше 0,01×106 inTB.

В настоящото проучване, PPB и PTB показват лека активност на инхибиране на тирозиназата в зависимост от дозата. Въпреки това, то демонстрира, че не е открита никаква активност във водния екстракт от PB (съдържа PPB) [25]. Това явление може да се дължи на различната подготовка на пробата. Водният екстракт от PB се използва за оценка на инхибиторната активност на тирозиназата в експеримента на Jiang [25], докато в настоящото изследване водният екстракт се утаява с етанол, за да се получи суровият полизахарид.

Напоследък моделът на зебрата се използва широко при оценката на антимеланогенезния ефект in vivo [47, 48]. Arbu-tin, хидрохиноново глюкозидно съединение, съществуващо в различни растения, което е било използвано в търговската мрежа в козметичната индустрия, беше зададено като положителна контрола. Антимеланогенезните активности на ETB и EFB са по-силни от тези на арбутина, което показва, че ETB и EFB могат да се прилагат като агенти за изсветляване на кожата в козметичната индустрия.

Относителната пикова площ на блестрин D в EFB(1,91 × 106) е приблизително четири пъти по-голяма от тази в ETB(0.46 × 10). Относителната пикова площ на съединение 56 (8,73 × 106) и 93 (0,64 × 106) в EFB също е значително по-висока от тази в ETB (по-малко от 0,01 × 106 и 0,10 × 106). Това може да е една от причините, поради които EFB проявява по-силни антимеланогенни ефекти от ETB. Интересно е да се отбележи, че първите три лиганда към тирозиназата и аденилатциклазата принадлежат към стилбеноидите (бибензили, фенантрени и техните производни). Стилбеноидите са естествените растителни полифеноли, който привлече голям интерес през последните години поради тяхната забележителна биоактивност като противовъзпалителна, антимикробна и антиоксидантна активност [49]. Ресвератролът е най-често срещаният стилбеноид. Предишните изследвания показват, че ресвератролът и неговите производни могат значително да инхибират каталитичната активност, генната експресия и посттранслационните модификации на тирозиназата. По този начин те се оказаха потенциално полезни като средства за изсветляване на кожата и против стареене в козметиката [41, 50].

Cistanche се оказа потенциално полезен като агент за изсветляване на кожата и против стареене в козметиката.

За повече информация, моля щракнете върху снимката.

Изводи

В това проучване антиоксидантната и антимеланогенна активност на суровия полизахарид от B. striatatuber (PTB) и фиброзни корени (FPB) и 95 процента етанолекстракт от B. striata tuber (ETB) и фиброзни корени (EFB) бяха систематично изследвани . Резултатите показват, че EFB притежава най-силната DPPH, ABTS радикална активност и редуцираща активност на фери желязо. В допълнение, ETB и EFB могат значително да намалят тирозиназната активност in vitro и синтеза на меланин на ембриони на риба зебра по дозозависим начин. Молекулният докинг показва, че има голям брой съединения, предимно принадлежащи към стилбеноиди, проявяващи по-силен афинитет на свързване към тирозиназа и аденилат циклаза, в сравнение с афинитета на свързване на оригиналния лиганд. Настоящите открития подкрепят обосновката за използването на ETB и EFB като естествени агенти за избелване на кожата във фармацевтичната и козметичната промишленост.