Модел на Drosophila за изследване на чревната микробиота в поведението и невродегенеративните заболявания, част 1

Резюме:

Все повече доказателства сочат, че чревната микробиота е свързана с няколко физиологични процеса и развитието на болести при бозайниците; обаче основните механизми остават неизследвани най-вече поради сложността на микробиома на червата на бозайниците. Плодовата муха, Drosophila melanogaster, е ценен животински модел за изучаване на взаимодействията микробиота на гостоприемника и червата в транслационни аспекти.

Животните и паметта са много интересна връзка. От лоялността на кучетата до интелигентността на мишките, спомените на животните отдавна са обект на чудо и любопитство. Въпреки че животните се различават по това колко добре помнят, паметта им дава основание да се заключи, че животните не само имат силен инстинкт за самосъхранение, но също така могат да се учат от опита, което предполага, че паметта е важна.

На първо място, кучетата и котките са двата най-подходящи домашни любимци за отглеждане от хората. Всички са много умни и имат много добри спомени. Те могат да запомнят миризмата и звука на собственика и околната среда, а също така могат да изразяват емоции чрез определени поведения. Силата на тази памет се отразява в способността на кучетата и котките да намират изгубените си стопани. Дори ако е минало много време, откакто собственикът си е тръгнал, стига да има места и миризми, които могат да бъдат идентифицирани, те ще продължат да търсят.

Второ, мишките също са едно от животните с особено висок коефициент на интелигентност. Паметта на мишките е много по-добра от предполагаемото. Те могат да си спомнят къде отиват, къде е храната им и територията им, а също така могат да разпознават и запомнят хора или животни, които са били опасност за тях. Експерименти на някои изследователи са установили, че мишките също разпознават и реагират на околната среда чрез музика и тонове, което показва, че животинската памет включва сетивна, емоционална и логическа интелигентност.

Като цяло паметта на животните е донесла много изненади и открития на хората. Те не само могат да се защитят, но и могат да изградят по-тясно доверие и отношения с хората. Освен това животните са вдъхновили различни експерименти и изследвания, които са помогнали на учените да разберат по-добре природата и механизмите на паметта. И така, нека се възхищаваме на интелигентността и паметта на животните и да се възхищаваме на техните умни и гъвкави мозъци. Вижда се, че независимо дали е човек или животно, паметта е много важна. Cistanche може значително да подобри нашата памет, тъй като Cistanche е традиционен китайски лекарствен материал с много уникални ефекти, един от които е да подобрява паметта. Ефикасността на мляното месо идва от различни активни съставки, които съдържа, включително карбоксилна киселина, полизахариди, флавоноиди и др. Тези съставки могат да насърчат здравето на мозъка по различни канали.

Кликнете върху краткосрочната памет за това как да подобрите

Наличието на мощни генетични инструменти и ресурси в Drosophila позволи на учените да разгадаят механизмите, чрез които чревните микроби влияят върху фитнеса, здравето и поведението на своите гостоприемници.

Моделите на Drosophila са широко използвани не само за изследване на поведението на животните (т.е. ухажване, агресия, сън и учене и памет), но и някои невродегенеративни заболявания, свързани с човека (т.е. болестта на Алцхаймер и болестта на Паркинсон) в миналото. Този преглед изчерпателно обобщава настоящото разбиране за чревната микробиота на Drosophila и нейното въздействие върху поведението на мухите, физиологията и невродегенеративните заболявания.
Ключови думи:

Drosophila melanogaster; микробиота; чревно-мозъчна ос; поведения; учене и памет; невродегенеративни заболявания.

1. Въведение
Плодовата муха, Drosophila melanogaster, е важно експериментално животно, използвано в биомедицински изследвания. Плодовата мушица е използвана за първи път като експериментален организъм от Касъл през 1901 г. и Морган през 1909 г. за генетични изследвания. Тъй като Drosophila се използва като модел на организъм повече от век, са разработени няколко техники за справяне със специфични научни въпроси.

Drosophila има сравнително кратък живот и сложно поведение. Наличието на мощни инструменти за генетична манипулация в специфични тъкани или органи позволи на учените да изследват молекулярните механизми, регулиращи поведението на дрозофила, като адаптивна реакция към околната среда, както и вродени (ухажване, агресия, сън и др.) [1 –3] и научено поведение (обонятелна памет и памет за ухажване) [4–6].

През последните 20 години Drosophila се използва като идеален in vivo модел за изследване на невродегенеративни заболявания, като болестта на Алцхаймер (AD) и болестта на Паркинсон (PD) [7,8]. Видните сигнални пътища, които регулират растежа и функциите на невроните при хората, са запазени в Drosophila, което позволява използването на този модел на организъм за изследване на човешки невродегенеративни заболявания.

Например моделът на Drosophila на AD, разработен чрез ектопично експресиране на човешки A 42 протеин в мозъка на мухата, проявява клинични симптоми, свързани с пациенти с AD, като зависимо от възрастта увреждане на краткосрочната памет, дефекти в ученето, повишена будност и прекъсване на съня [8]. ,9]. Това предполага, че Drosophila може да се използва като идеален in vivo модел за скрининг на нови лекарства за лечение на AD.

Натрупващи се доказателства подкрепят идеята, че добре балансираната чревна микробиота е от съществено значение за човешкото здраве [10,11]. Намесата в състава на чревната микробиота може да повлияе неблагоприятно на здравето и физиологията на гостоприемника, което води до различни неврологични заболявания, като поведенчески аномалии, невродегенеративни заболявания и невропсихиатрични разстройства [12–14].

Проучванията показват, че чревните бактерии могат да произвеждат няколко невротрансмитери, включително допамин, гама-аминомаслена киселина (GABA) и серотонин [15]. Освен това, двупосочното пресичане между червата и централната нервна система (ЦНС) се медиира чрез чревната микробиота [16,17]. Последните проучвания показват, че промените в състава на чревната микробиота са свързани с някои неврологични заболявания [18–20].

Въпреки това, подробният механизъм за това как чревните бактерии регулират прогресията на заболяването, като влияят на комуникацията по оста на червата и мозъка, изисква допълнително изследване.

През последните 20 години повечето от изследванията на чревната микробиота използват модели на гризачи, за да изследват ролята на оста микробиота-черва-мозък. Въпреки това, многостранният организъм, Drosophila, е мощен изследователски модел, който позволява на учените да изследват механизмите, чрез които чревните микроби влияят на мозъчните функции (Фигура 1a, b). Микробите могат да бъдат генетично маркирани с флуоресцентен протеин, като по този начин тяхното разпределение в храносмилателния тракт на Drosophila може да бъде визуализирано (Фигура 1c) [21,22].

Фигура 1. Сравнение на храносмилателния тракт на човека и дрозофила. (а) Храносмилателни пътища на хора и дрозофила. Функционалните области на храносмилателния тракт при Drosophila и хората са сходни и включват хранопровода, предното и задното средно черво (тънките черва), дебелото черво (задното черво) и стомаха (културата). (b) Подрегиони на храносмилателния тракт на Drosophila, изобразяващи предното, средното и задното черво.

Предстомашието съдържа посев и предвентрикулус. Средното черво е допълнително разделено на области R1-R5. ( c ) Lactobacillus, маркиран с GFP, се захранва с възрастни Drosophila и конфокалните изображения показват разпределението на Lactobacillus (зелено) в различни области на храносмилателния тракт. Увеличените изображения на изрязването, регионите R2, R4 и R5 са показани в c1 до c4. Пробата беше имунооцветена с анти-интегрин-PS антитяло (червено). Скала, 500 µm.

2. Вродено поведение на Drosophila
Смята се, че вроденото поведение е заложено в мозъка на животните и е генетично кодирано и не изисква предварителен опит за правилно изпълнение. Вроденото поведение е силно адаптивно към вътрешното състояние на животните и външната среда, което позволява на животните да променят поведението си според различните условия на околната среда [23].

Drosophila е отличен животински модел за изучаване на молекулярните механизми на човешкото вродено поведение, тъй като има някои прилики в поведенческите фенотипове между мухите и хората. При Drosophila са изследвани различни вродени поведения, като поведение при чифтосване, агресивно поведение, сън/локомоторна активност и свързано с температурата поведение [3,24–28].

В допълнение, геномът на Drosophila е около 60% хомоложен с този на хората и приблизително 75% от гените, свързани с човешки заболявания, също имат хомолози в мухите [29]. Например, в поведението на сън допаминовата сигнализация регулира будността не само при Drosophila, но и при хората [30]. Тук представяме някои важни вродени поведения на Drosophila и обсъждаме връзката им с чревната микробиота (Таблица 1).

2.1. Чревна микробиота и поведение при чифтосване

Поведението при чифтосване при мъжки Drosophila включва поредица от стъпки: напредване към женската (ориентация), преследване на женската (следване), докосване на корема на женската (потупване), едностранно разгъване на крилата и вибрация (пеене), облизване на гениталиите на женската, хващане към гърба на женската (опит за копулация) и финална копулация [3,26]. Една мъжка муха се опитва да се чифтосва с една девствена женска и измерването на сексуалния ентусиазъм на мъжката муха към женската се нарича индекс на ухажване (CI).

CI е времето, прекарано от мъжката дрозофила в ухажване, разделено на общото време на експеримента. Добре известната невронна верига, която регулира поведението при чифтосване, е съставена от безплодни (fru)-експресиращи неврони. Fru-експресиращите неврони, включително първични сензорни аференти и централни интерневрони, като P1 клъстерни неврони, които предизвикват ухажване, могат да формират основната част от мъжката верига на ухажване [50].

Най-малко три проучвания съобщават, че чревната микробиота не влияе на поведението на ухажване при Drosophila [33,35,51]; обаче трябва да се отбележи, че всяко изследване използва различни диви видове мухи и използва различни методи за генериране на свободни от микроби мухи.

Противно на тези проучвания, Heys et al. показаха, че чревната микробиота противодейства на стратегията за мъжко размножаване чрез промяна на сексуалното сигнализиране на женската, което води до намален трансфер на сперма от мъжки мухи [31]. Аутбридингът при Drosophila увеличава генетичното разнообразие в потомството, повишава имунната защита и може да бъде повлиян от микробиотата на гостоприемника [31,52].

Предишно проучване показа, че в 1- и 3-ден след чифтосването моделът на генна експресия в тъканта на главата на мухата се променя, което засяга поведението на мухата, включително поведението при хранене, метаболизма и производството на яйца (след - поведение при чифтосване) [53]. Delbare и др. извърши широкомащабен RNA-seq анализ на девствени и чифтосани аксенични/конвенционални мухи и съобщи, че при чифтосани женски транскриптите, участващи в регулирането на репродукцията и невронните функции, са различно изобилни в зависимост от микробиотата на женските [32].

Нещо повече, статусът на микробиотата на мъжа повлиява плодовитостта както при конвенционалните, така и при аксеничните жени; обаче, той засяга транскрипционните профили само при аксенични, но не и при конвенционални жени.

2.2. Чревна микробиота и агресивно поведение

Агресивното поведение, което се наблюдава широко в животинското царство, е критично за оцеляването и възпроизводството [54]. При Drosophila агресивното поведение включва заплаха с крило, бокс, потупване с предния крак, хвърляне и блъскане с глава [2,33]. Jia и др. описва протокол за анализиране на агресивното поведение при мухи.

При този анализ две мъжки или женски мухи (на възраст 5–7 дни) се поставят в бойна камера, която след това бързо се покрива със стъклено покривно стъкло с размери 20 mm × 20 mm. Битката в продължение на 30 минути се записва с камера. Агресивното поведение се анализира чрез преброяване на броя на нападенията при мъжете и ударите с глава при жените и оценка на честотата на нападенията/латентността на битката. Честотата на ударите се дефинира като броя на ударите в минута след започването на ударите, докато латентността на борбата се определя като продължителността между началото на записа и първия удар [33].

Проучванията показват, че агресивното поведение се координира с визуални, обонятелни, вкусови, механосензорни и слухови входове. Тези входове се интегрират в тялото на мозъчната гъба (MB), страничния рог и централните сложни региони и накрая задвижват двигателните изходи през мускулите на крилата и краката.

Проучванията също предполагат, че невротрансмитери и невропептиди, като октопамин, серотонин, допамин, ацетилхолин и невропептид F (NPF), също играят важна роля в агресивното поведение [54].

Последните проучвания показват, че специфична чревна микробиота е свързана с агресивността на мухите. Jia и др. използва натриев хипохлорит и серия от протоколи за измиване за генериране на аксенични мухи [33].

В сравнение с конвенционалните мухи (Canton-S), аксеничните мухи показват по-малко агресивно поведение между самците, което показва, че свободните от микроби мухи имат намалена агресия между самците. Освен това, коменсални бактерии като Acetobacter, Lactobacilli и Enterococci насърчават агресивно поведение при аксенични мухи чрез микробна повторна колонизация. Авторите съобщават също така за 73% намаление на нивата на октопамин при свободни от микроби мухи, а генетичната манипулация на октопаминергичната невронна активност възстановява агресивното поведение при аксеничните мухи.

Същото проучване също съобщава за два ключови фактора, участващи в регулирането на агресията чрез експресия на октопамин. Единият е критичният период на развитие по време на ларвния стадий (48–98 часа след снасянето на яйца), в който добавянето на богата на дрожди диета възстановява агресивното поведение при аксеничните мухи. Другият фактор е храненето, тъй като то също е важно за експресията на октопамин и осигуряването на правилно хранене на аксеничните мухи нормализира агресивното поведение.

Тези констатации показват, че чревната микробиота и храненето по време на критичния период на развитие засягат експресията на октопамин, която регулира агресията при възрастни мъже [33].
2.3. Чревна микробиота и сън и двигателна активност
Системата Drosophila Activity Monitor (DAM) се използва за изследване на поведението на съня и движението при мухи [55]. В този анализ мухите се настаняват при условия на цикъл на 12 часа светлина/12 часа тъмнина [56,57].

Апаратът DAM има три основни компонента: (1) стъклена тръба, в която една муха може да се движи свободно, (2) инфрачервен лъч, който се насочва през средата на стъклената тръба, и (3) компютър за запис на поведенческите резултати [55]. При анализа на сън/локомоторно поведение системата DAM записва прекъсвания на инфрачервения лъч поради ходене на мухи в стъклени тръби, за да открие сън или движение [58].

Добре известната верига, свързана с поведението на съня в мозъка на Drosophila, е съставена от циркадни неврони. Светлината стимулира група големи вентрално-латерални неврони (l-vLN), които освобождават пигмент-диспергиращи фактори (PDF), за да стимулират група малки вентрално-латерални неврони (s-vLN). И накрая, s-vLNs регулират мозъчния локомоторен контролен център, елипсоидните тела, за да инхибират поведението на съня.

Както l-vLNs, така и s-vLNs експресират GABAA рецептори, които могат да инхибират будността чрез стимулиращи съня GABAergic неврони. MB също е важен регион на мозъка, който регулира съня чрез каталитичната субединица на протеин киназа А, ензим, активиран от релевантния за съня сАМР път [59]. Локомоторната активност е важна за оцеляването на Drosophila и се контролира от хормони, които също могат да бъдат анализирани с помощта на системата DAM. Кинг и др.

наскоро съобщи за наличието на пептидергична верига, която свързва циркадния часовник с локомоторната активност. s-vLN освобождават PDF файлове, които стимулират DN1 часовникови неврони, които от своя страна стимулират DH44 положителни pars intercerebralis (PI) неврони. DH44-позитивните PI неврони стимулират hugin-позитивните SEZ неврони, които накрая освобождават hugin невропептида към моторната верига във вентралната нервна връв, която регулира локомоторната активност в Drosophila [60].

Ефектът на чревната микробиота върху поведението на съня при Drosophila остава неясен. Селкриг и др. използва изогенния свободен от Wolbachia щам D. melanogaster Canton-S като див тип мухи и извърши анализи на съня и локомоторното поведение. Авторите генерират свободни от Wolbachia свободни от зародиши мухи Canton-S чрез измиване на яйцата с NaClO и нарекоха първото поколение като F1, а следващото поколение като F2.

Техните данни разкриват, че нито свободните от микроби F1, нито свободните от микроби мухи F2 проявяват значителна промяна в поведението на съня. Освен това, въпреки че свободните от зародиши F1 мухи не показват никаква промяна в локомоторното поведение, свободните от зародиши F2 мухи показват леко увеличение на локомоторната активност в сравнение с конвенционалните мухи [35].

Друго проучване на Silva et al. използва Canton-S и W1118 като мухи от див тип и използва NaClO за измиване на яйцата на мухата за 3–5 минути, за да генерира аксенични мухи [61]. Техните резултати разкриват, че в сравнение с конвенционалните мухи, аксеничните мухи са склонни да спят по-дълго време и показват намалено възстановяване на съня след лишаване от сън [34]. Състоянието на чревната микробиота на мухите обаче има малък ефект върху циркадната ритмичност на локомоторната активност.

Силва и др. и Selkrig et al. се фокусира върху разбирането на ролята на чревната микробиота в регулирането на съня и движението на Drosophila. Шретер и др. предложи възможен механизъм за обяснение на връзката между чревната микробиота и движението/съня. В това проучване щамът Oregon-R беше използван като див тип и мухите получиха диета с добавка на антибиотици, за да генерират третирани с антибиотици (ABX) мухи.

Резултатите показват, че мухите ABX имат повишена скорост на ходене, подобрени ежедневни дейности и намален сън през деня. Авторите съобщават също, че ензимът ксилоза изомераза, който катализира обратимата изомеризация на някои захари, присъстващи в Lactobacillus brevis, намалява локомоторната активност чрез модулиране на метаболизма на захарта чрез стимулиране на октопаминергичните неврони; този ензим обаче не влияе на съня [36].

2.4. Чревна микробиота и поведение, свързано с температурата

Температурата на околната среда силно влияе върху физиологията на ектотермите, като Drosophila. Температурното предпочитание (мухите избягват гореща или студена среда) и толерантността към горещи или ниски температури са важни за оцеляването на Drosophila. Анализът на температурния градиент се използва за изследване на температурните предпочитания при мухи.

Различни проучвания използват различни устройства с температурен градиент, но основният принцип е същият: едната страна на устройството е с ниска температура, а другата страна произвежда висока температура. Чрез поставяне на алуминиев лист между двете страни се получава температурен градиент. Мухите се поставят върху алуминиевия лист и им се позволява да изберат предпочитаната от тях температура [62,63].

Има два различни начина за изследване на поведението при избягване на температурата: единият е да се използва анализът на температурния градиент (описан по-горе), а другият е да се използва машината за анализ с два избора.

Машината за анализ с два избора съдържа четири квадранта, които са изградени с термоелектрически охлаждащ чип и алуминиев лист. При извършване на анализа за избягване на температурата, машината за анализ с два избора ще зададе постоянна температура (25 ◦C) в един набор от диагонални квадранти, а другите диагонални квадранти са зададени на експерименталната температура, която зависи от анализа [64] .

Възстановяването при студена кома е протокол за изследване на поведението на толерантност към температурата. В този анализ мухите се потапят във водно-гликолова баня, настроена на -3,5 ◦C (в зависимост от експерименталния план) за студен стрес или се излагат на температура 38,5 ◦C (в зависимост от експерименталния дизайн) за топлинен стрес, след което мухите се оставят да се възстановят и се измерва времето за възстановяване [37,65].

Последните проучвания показват, че чревната микробиота силно влияе на температурната толерантност при плодовите мушици. Хенри и др. генерирани аксенични мухи чрез дехлориране, при което яйцата на мухата се потапят в 2,7% хипохлорит за 2 минути, 70% етанол за 2 минути и накрая се промиват два пъти в автоклавирана вода [37]. След дехлориране, мухите се отглеждат в автоклавирана храна. Техните резултати показват, че студоустойчивостта на аксеничните мухи е дефектна в сравнение с тази на конвенционалните мухи. Въпреки това толерантността към топлина не е засегната при аксеничните мухи. Това предполага, че нарушаването на микробиотата намалява способността за справяне със студовия стрес [37]. Проучвания върху други видове Drosophila, като D. subobscura, предполагат, че конвенционалните мухи, изложени на меки топлинни условия (<34 ◦C) exhibit higher thermal tolerance than axenic flies [38].

For more information:1950477648nn@gamil.com