Двойни модулиращи ефекти на диосмин върху процесите на образуване на калциев оксалат в бъбречните камъни: кристализация, растеж, агрегация, адхезия на кристални клетки, интернализация в бъбречните тубулни клетки и инвазия през екстрацелуларен матрикс
Mar 16, 2022
за повече информация:ali.ma@wecistanche.com
Супапорн Хамчунa,b,c,1, Суниса Йодиa,1, Посетете Thongboonkerda,*
aОтдел за медицинска протеомика, Служба за изследване и развитие, Медицински факултет, болница Siriraj, Университет Mahidol, Банкок 10700, Тайланд
bКатедра по медицинска технология, Училище за съюзни здравни науки, Университет Phayao, Phayao 56000, Тайланд
cОтдел за върхови постижения в интегративната молекулярна биомедицина, Училище за съюзни здравни науки, Университет Phayao, Phayao 56000, Тайланд
Ключови думи: биоактивно съединение, флавоноид, инхибитор, модулатор, нефролитиаза, промотор, уролитиаза
АБСТРАКТ
Диосмине естествен флавонов гликозид (биофлавоноид), открит в плодовете и растенията с няколко фармакологични активности. Той се използва широко като хранителна добавка или терапевтичен агент при различни заболявания/разстройства. Въпреки че се препоръчва, доказателства за неговите защитни механизми срещубъбреккаменна болест (нефролитиаза/уролитиаза), особено калциев оксалат (CaOx) монохидрат (COM), който е най-често срещаният тип, остава неизяснен. В това проучване ние систематично оценихме ефектите отдиосмин(при 2,5–160 nM) на различни етапи набъбрекпроцеси на образуване на камъни, включително кристализация на COM, растеж на кристали, агрегация, адхезия на кристални клетки, интернализация в бъбречни тубулни клетки и инвазия през екстрацелуларен матрикс (ECM). Резултатите показаха товадиосминимаше зависими от дозата модулиращи ефекти върху всички споменати COM процеси на камъни в бъбреците.Диосминзначително увеличен брой и маса на COM кристали по време на кристализация, но намален размер и растеж на кристалите. Докатодиосминнасърчава кристалната агрегация, инхибира адхезията на кристалните клетки и интернализацията в клетките на бъбречните тубули. И накрая, диосминът насърчава кристалната инвазия през ECM. Нашите данни предоставят доказателства, демонстриращи както инхибиращи, така и насърчаващи ефекти на диосмин върху COMбъбрекпроцеси на образуване на камъни. Въз основа на тези двойни модулиращи действия на диосмин, неговата антиуролитиазна роля е съмнителна и трябва да се внимава при употребата му прибъбреккаменна болест.
1. Въведение
Диосмин(3′,5,7-трихидрокси-4′-метоксифлавон-7-рамноглюкозид) е естествен биофлавоноид, често срещан в различни растения и плодове, главно Citrus spp. [1,2]. Може да бъде синтезиран или получен от другия флавоноид, хесперидин [1,2]. Диосмин самостоятелно или в комбинация с хесперидин се използва широко като флеботропно лекарство за лечение на венозни и лимфни заболявания като хронична венозна недостатъчност и хемороиди [3,4]. В допълнение диосминът проявява няколко други биологични и фармакологични активности, включително антиоксидантна и противовъзпалителна активност [5,6], антимутагенни и антинеопластични свойства [7,8], антибиотични ефекти [9], антихипергликемични свойства [ 10], и защитни ефекти срещу многоорганни увреждания, т.е.
сърдечно-съдови [11], ретинални [12],бъбрек, чернодробно и мозъчно увреждане [13].
Бъбреккаменната болест (или нефролитиаза/уролитиаза) се причинява от твърди камъни, развити и отложени в бъбреците, и засяга хората във всички части на земното кълбо с висок процент на рецидив [14–17]. Сред всички различни причинни кристали, калциевият оксалат (CaOx), особено монохидратната форма (COM), е най-патогенният и най-често срещаният кристален компонент, открит в образуващите камъни (пациенти с камъни в бъбреците) [18]. Механично, COM кристалите имат най-мощната адхезивна способност и най-цитотоксичните ефекти върху бъбречните тубулни епителни клетки [19,20]. По време на патогенезата на камъните както плаковият модел на Randall, така и интратубуларната хипотеза имат общи характеристики на процесите на образуване на COM камъни, включително кристализация на COM, растеж, агрегация, задържане чрез повърхностна адхезия върху бъбречните тубулни клетки или бъбречното легенче, интернализация в клетките и инвазия в бъбречен интерстициум чрез екстрацелуларен матрикс (ECM) [21,22].
Напоследък много проучвания са фокусирани върху откриването на лекарства, използващи лечебни растения/плодове и техните биоактивни съединения, насочени към предотвратяване на ново и/или повтарящо се образуване на камъни. Редица предишни доклади показват, че някои биоактивни съединения, особено фенолни съединения (полифенол, флавоноид, флавонов гликозид и др.), извлечени от няколко лечебни растения/плодове, имат превантивни ефекти срещу патогенните механизми набъбреккаменна болест както in vitro, така и in vivo [23–25]. Сред тези полезни вещества, няколко доклада предполагат, че диосминът може да предотврати отлагането на CaOx кристали в бъбречната тъкан при животински модели [26,27]. Въпреки това, неговата точна модулираща роля (инхибиране или насърчаване) и механизми (етапи или процеси на образуване на камъни) при образуването на COM бъбречни камъни не са били изследвани. По този начин настоящото проучване систематично оценява ефектите отдиосмин(при 2,5–160 nM) на различни етапи набъбрекпроцеси на образуване на камъни, включително кристализация, растеж на кристали, агрегация, адхезия на кристални клетки, интернализация в бъбречните тубулни клетки и инвазия чрез ECM.
Кликнете, за даCistanche tubulosa дозировка за бъбречна функция
2. Материали и методи
2.1. Препарат с диосмин
Диосмин(Tokyo Chemical Industry; Токио, Япония) се разтваря със 100 процента диметилсулфоксид (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) и се правят работни аликвотни части при крайни концентрации от 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 и 160 nM за изследване на ефектите му върху COM кристали. В допълнение, 100 процента DMSO се използва като отрицателна контрола във всички експерименти.
2.2. Клетъчна култура
MDCK бъбречна тубуларна епителна клетъчна линия, получена от дистален тубуларен сегмент на нефрона (ATCC; Manassas, VA) се размножава в минималната есенциална среда на Eagle (MEM) (Gibco; Grand Island, NY), допълнена с 10 процента фетален говежди серум (FBS), 60 U/ml пеницилин G (Sigma-Aldrich) и 60 ug/ml стрептомицин (Sigma-Aldrich). Клетките се поддържат в овлажнен инкубатор с 5% CO2 при 37 ◦C.
2.3. COM кристализационен анализ
Кристализацията на COM се извършва, както е описано по-рано [28,29]. Накратко, 500 ul от 10 mM CaCl2⋅2H2O в кристализационен буфер (съдържащ 10 mM Tris-HCl и 90 mM NaCl) (рН 7,4) се добавят във всяка ямка на 24-плаката с ямки (Corning Inc.; Corning, Ню Йорк). Равен обем (4 ul) кристализационен буфер (празна контрола), DMSO (отрицателна контрола) илидиосмин(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 или 160 nM) се смесва с CaCl2. Накрая се добавят 500 ul от 1.0 mM Na2C2O4 в кристализационния буфер, за да се направят крайните концентрации на CaCl2 и Na2C2O4 съответно 5 mM и 0.5 mM. Сместа се инкубира при 25 ◦C за 1 час и след това се изследва. Кристалните изображения бяха заснети на случаен принцип от най-малко 15 полета с висока мощност (HPFs) под Nikon Eclipse Ti-S обърнат фазово-контрастен светлинен микроскоп (Nikon; Токио, Япония). Размерът и броят на кристалите бяха измерени от най-малко 15 HPFs за всяка проба, като се използва NIS Element D софтуер версия 4.11 (Nikon). Масата на кристала се изчислява от най-малко 100 кристала в 15 HPF, като се използва следната формула: Маса на кристала (µm2/HPF)=Среден размер на кристала във всяко поле (µm2) × Брой кристали във всяко поле (/HPF) ( 1)
2.4. Анализ на COM кристален растеж
Анализът на растежа на кристалите се извършва, както е описано по-рано [30,31].
Накратко, равен обем (500 ul) от 10 mM CaCl2⋅2H2O и 1,0 mM Na2C2O4 в кристализационен буфер беше смесен (1:1) (v/v) във всяка ямка на { {12}}кладенческа плоча. Сместа се инкубира при 25 ◦C за 1 час, за да се позволи пълна кристализация. В този момент (T0), равен обем (4 ul) кристализационен буфер (празна контрола), DMSO (отрицателна контрола) илидиосмин(2.5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 или 160 nM) беше добавен във всяка ямка и сместа беше допълнително инкубирана за 60 минути (Т60). При T0 и T60 кристалните изображения бяха заснети на случаен принцип от най-малко 15 HPFs под Nikon Eclipse Ti-S светлинен микроскоп с обърнат фазов контраст. Размерите на кристалите при T0 и T60 бяха измерени с помощта на софтуер NIS Element D версия 4.11 (Nikon), докато растежът на кристалите (представен от Δ размер на кристала) беше изчислен от най-малко 100 кристала в 15 HPF, като се използва следната формула: Δ размер на кристала (µm2)=Размер на кристала при T60 − Размер на кристала при T0 (2)
2.5. Анализ на COM кристална агрегация
Анализът на кристалната агрегация се извършва, както е описано по-рано [32,33]. Кристалите COM се генерират, както е споменато по-горе в анализа за растеж на кристали, но с по-голям обем в 50- ml конична епруветка (Corning Inc.) и след това се събират чрез центрофугиране при 2000 g за 5 минути. Супернатантата се изхвърля, докато COM кристалите се промиват три пъти с метанол. След друго центрофугиране при 2000 g за 5 минути, метанолът се изхвърля и кристалите се сушат на въздух за една нощ при 25 ◦C. COM кристали (1000 µg сухо тегло) бяха ресуспендирани в 1 ml кристализационен буфер във всяка ямка на 6-плаката с ямки (Corning Inc.). Равен обем (4 ul) кристализационен буфер (празна контрола), DMSO (отрицателна контрола) илидиосмин(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 или 160 nM) се добавя към кристалната суспензия на COM във всяка ямка. Плаката се разклаща непрекъснато в разклащащ се инкубатор (Zhicheng; Шанхай, Китай) при 150 rpm и 25 ◦C в продължение на 1 час. След това образуването на COM кристален агрегат (дефиниран като „съвкупност от три или повече отделни COM кристала, които са плътно свързани заедно“ [32]) беше изследвано и изобразено под светлинен микроскоп Nikon Eclipse Ti-S с обърнат фазов контраст. Броят на COM кристалните агрегати се преброява от най-малко 15 произволни HPF на ямка.
2.6. COM тест за адхезия на кристални клетки
Анализът на адхезията на кристални клетки се извършва, както е описано по-рано [34,35]. Накратко, кристалите COM се генерират, както е споменато по-горе, в 50- ml конична епруветка и след това се събират чрез центрофугиране при 2000 g за 5 минути. Супернатантата се изхвърля, докато COM кристалите се промиват три пъти с метанол. След друго центрофугиране при 2000 g за 5 минути, метанолът се изхвърля и кристалите се сушат на въздух за една нощ при 25 ◦C. Кристалите бяха обеззаразени чрез UV светлинно лъчение за 30 минути преди интервенция с клетките.
MDCK клетки (при плътност от 2 × 105 клетки/ямка) се посяват и отглеждат във всяка ямка на 6-плаката с ямки (Corning Inc.) в продължение на 48 часа, за да се получи конфлуентен монослой. След това културалната среда беше освежена преди добавяне на COM кристали (100 ug кристали със сухо тегло на ml културална среда). Равен обем (4 ul) кристализационен буфер (празна контрола), DMSO (отрицателна контрола) илидиосмин(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 или 160 nM) се добавя във всяка ямка. Клетките бяха допълнително инкубирани в овлажнен инкубатор с 5 процента CO2 при 37 °C в продължение на 1 час. След това клетките бяха енергично промити с PBS пет пъти и изобразени под Nikon Eclipse Ti-S светлинен микроскоп с обърнат фазов контраст. Броят на останалите COM кристали, прилепнали върху повърхността на бъбречните тубулни клетки, се преброява от най-малко 15 произволни полета на ямка.
Цистанче за бъбречната функция
2.7. Анализ на COM кристална интернализация
Белязаните с флуоресценция COM кристали се генерират, както е описано по-рано [36,37]. Съставите/концентрациите на химикалите, използвани за кристализация, са същите като споменатите по-горе за обикновените (небелязани) кристали, но 0.1 µg/ml флуоресцеин изотиоцианат (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) беше добавен към разтвор на CaCl2⋅2H2O преди смесване с Na2C2O4. Следващите стъпки (кристализация и събиране) се извършват, както е споменато по-горе, но на тъмно.
За да се оцени кристалната интернализация в бъбречните тубулни епителни клетки, MDCK клетки (при плътност от 2 × 105 клетки/ямка) се посяват и отглеждат във всяка ямка на 6-плаката с ямки (Corning Inc.) в продължение на 48 часа, за да се получи сливащ се монослой. Клетъчният монослой се инкубира с маркирани с FITC COM кристали (1 000 µg кристал/ml среда) в овлажнен инкубатор с 5 процента CO2 при 37 °C за 1 час. След това клетките се промиват с PBS и се инкубират с разтвор на трипсин-EDTA за елиминиране на неинтернализирани (както прилепнали, така и неприлепнали) кристали. Процентът на клетките с интернализирани кристали беше количествено определен от общо 10 000 придобити събития с помощта на поточен цитометър (BD Accuri C6) (BD Biosciences; Сан Хосе, Калифорния). Клетките, инкубирани с обикновени (небелязани) COM кристали, се използват за предварително задаване на шума и прага за положителния флуоресцентен сигнал. След това клетките с положителни флуоресцентни сигнали бяха преброени и използвани за такова процентно изчисляване.
2.8. COM кристална инвазия чрез ECM анализ
COM кристалите се приготвят, както е описано по-горе за анализи на кристална агрегация и адхезия на кристални клетки. Анализът за кристална инвазия се извършва съгласно протокол, установен по-рано [38,39]. Накратко, общо 20 µg COM кристали, покрити с кристализационен буфер (празна контрола), DMSO (отрицателна контрола), албумин (Sigma-Aldrich) (положителна контрола) илидиосмин(2.5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 или 160 nM) бяха добавени в 200 ul MEM. Впоследствие, 200 ul от 0.3 pM Lys-плазминоген (Fitzgerald Industries international; Acton, MA) в PBS се смесва и се инкубира с кристално-протеиновия комплекс при 37 °C за 1 час. Несвързаният плазминоген се изхвърля чрез центрофугиране при 2000 g за 5 минути и пелетата се промива с PBS веднъж. След това 100 ul от 0.15 рМ урокиназа плазминогенен активатор (uPA) (Fitzgerald Industries International) в PBS се смесва с комплекса кристал-протеин-плазминоген/плазмин. След това сместа се добавя върху матриксния гел вътре в камерата за миграция на ECM и се инкубира при 37 ◦C. След 24-h инкубация разтворът, останал в горната част на миграционната камера, се отстранява с помощта на марля или тишу. Нахлулите COM кристали вътре в матричния гел след това бяха изобразени с помощта на светлинен микроскоп с диференциален интерферентен контраст (DIC) режим (Nikon H600L). Разстоянието на кристална инвазия беше измерено и осреднено от най-малко 15 полета с ниска мощност (LPFs) в рамките на една и съща камера с помощта на NIS Element D софтуер версия 4.11 (Nikon).
2.9. Статистически анализ
Всички горни експерименти бяха проведени в три екземпляра (три независими експеримента) и количествените данни се докладваха като средна стойност ± SEM. Множество сравнения бяха извършени с помощта на еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) с post-hoc теста на Tukey. Беше извършен корелационен тест на Pearson, за да се определи връзката между променливите. Всички статистически анализи бяха направени с помощта на софтуер SPSS (версия 18) (IBM SPSS; Armonk, NY). P стойност по-малка от 0.05 се счита за статистически значима.
3. Резултати
3.1. Ефект на диосмин върху кристализацията на COM
Кристализацията е една от основните ранни стъпки набъбрекпроцеси на образуване на камъни от всички видове. След 1-h кристализация със или бездиосминпри различни концентрации (2.5, 5, 10, 20, 40, 80 или 160 nM), размерът и броят на COM кристалите бяха измерени и кристалната маса беше изчислена. Буферът за кристализация и разредителят DMSO служат съответно като празна и отрицателна контрола. Данните показват, че всички дози (2,5–160 nM) дизомин значително намаляват размера на кристалите, но увеличават броя на кристалите по дозозависим начин в сравнение с празни и отрицателни контроли (фиг. 1A–1C). В съответствие с броя на кристалите, кристалната маса се увеличава в зависимост от дозата (фиг. 1D). Като цяло тези данни показват, че диосминът насърчава кристализацията на COM (неокристали).
3.2. Ефект на диосмин върху растежа на COM кристали
Модулиращият ефект надиосминвърху растежа на кристалите COM беше оценен чрез измерване на промяната в размера на кристала (Δ размер на кристала) след 60- минути допълнителна инкубация след завършване на началния етап на кристализация, когато липсваха неокристали. Резултатите показват, че всички дози (2,5–160 nM) дизомин значително намаляват Δ размера на кристалите по дозозависим начин в сравнение с празните и отрицателните контроли (фиг. 2). Тези открития показват, че диосминът инхибира растежа на COM кристалите.
3.3. Ефект на диосмин върху кристалната агрегация на COM
В допълнение към растежа на кристалите, агрегирането на отделни кристали, които се придържат плътно един към друг, е друга важна стъпка по времебъбреккаменна патогенеза. Високата степен на кристална агрегация може в крайна сметка да доведе до уголемяване на камъните и запушване на малкия бъбречен тубулен лумен. Сравнявайки с празни и отрицателни контроли,диосминпри 10–160 nM дозозависимо повишен брой на COM кристалните агрегати (фиг. 3). Тези резултати показват, че диосминът насърчава COM кристалната агрегация.
Цистанче за бъбречната функция
3.4. Ефект на диосмин върху адхезията на COM кристални клетки
Задържането на причиняващите кристали е една от решаващите стъпки забъбрекобразуване на камъни и може да бъде предизвикано от адхезия на кристални клетки, която предотвратява изхвърлянето на кристалите заедно с изтичането на урина. По този начин ние оценихме модулиращата активност надиосминвърху COM кристално-клетъчна адхезия. Данните показват, че диосмин при 5–160 nM значително намалява адхезивната способност на COM кристалите върху бъбречните тубулни клетки по дозозависим начин в сравнение с празните и отрицателните контроли (фиг. 4). Тези данни показват, че диосминът инхибира адхезията на COM кристални клетки.
3.5. Ефект на диосмин върху интернализацията на COM кристали в бъбречните тубулни клетки
След адхезия, някои COM кристали могат да бъдат интернализирани в бъбречните тубулни клетки и да причинят няколко последващи клетъчни реакции [37,40]. Интернализацията на кристалите беше оценена чрез използване на маркирани с FITC COM кристали и количествено определена чрез поточна цитометрия. Обикновени COM кристали (без етикетиране) бяха използвани за изваждане на техническия шум и за да се гарантира, че интензитетът на флуоресценция е от FITC сигнала. В сравнение с празни и отрицателни контроли, процентът на клетките с интернализирани кристали е значително намален сдиосминпри 10–160 nM по дозозависим начин (фиг. 5). Констатациите показват, че дизоминът инхибира интернализацията на COM кристали в клетките на бъбречните тубули.
3.6. Ефект на диосмин върху COM кристална инвазия чрез ECM
Кристалната инвазия чрез ECM е патогенен/разрушителен процес по време набъбреккаменна патогенеза, която може да предизвика различни възпалителни реакции и каскади, като по този начин влоши механизмите на заболяването. Ние изследвахме това явление, като използвахме установен протокол, базиран на активността на плазминоген-плазмин на комплекса кристал-протеин [38,39]. Резултатите показват, че всички дози дизомин (2,5–160 nM) значително повишават инвазията на COM кристал през ЕСМ по дозозависим начин (фиг. 6). интересно,диосминпри 160 nM може да насърчи COM кристалната инвазия, сравнима с албумина, който е известният мощен промотор за COM кристална инвазия [41] (фиг. 6). Тези резултати показват, че диосминът силно насърчава инвазията на COM кристали през ECM.
Фиг. 1. Ефект надиосминна COM кристализация. Анализът на кристализация се извършва с равен обем (4 ul) кристализационен буфер (празна контрола), DMSO (отрицателна контрола) или диосмин (2,5–160 nM). (A): Кристална морфология при всяко състояние след 1-h кристализация. Първоначалното увеличение беше 400 × за всички панели. (B): Размер на кристала. (C): Число на кристал. (D): Кристалната маса (виж Формула 1 в "Материали и методи") се анализира от поне 100 кристала в 15 HPFs. Всяка лента представлява средно ±SEM на данните, получени от 3 независими експеримента. *=стр< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
Фиг. 2. Ефект надиосминвърху растежа на COM кристали. Анализът на растежа на кристалите се извършва след завършване на кристализацията (за предотвратяване на неокристализация) с равен обем (4 ul) кристализационен буфер (празна контрола), DMSO (отрицателна контрола) или диосмин (2,5–160nM). (A): Кристална морфология при всяко състояние при T0 и T60. Първоначалното увеличение беше 400 × за всички панели. (B)-(J): Хистограми на размерите на кристалите, измерени от отделни кристали при T0 и T60 във всяка група. (K): Δ Размерът на кристала (виж Формула 2 в "Материали и методи") беше анализиран от поне 100 кристала в 15 HPFs. Всяка лента представлява средна стойност ± SEM на данните, получени от 3 независими експеримента. *= p < 0,05="" спрямо="" празна="" контрола;="" #="p">< 0.05="" спрямо="">
Фиг. 3. Ефект надиосминна COM кристално агрегиране. Анализът на кристалната агрегация се извършва с равен обем (4 ul) кристализационен буфер (празна контрола), DMSO (отрицателна контрола) или диосмин (2,5–160 nM). (A): Микрографии на агрегираните COM кристали (обозначени с пунктирани кръгове). Първоначалното увеличение беше 400 × за всички панели. (B): Броят на кристалните агрегати се преброява от най-малко 15 произволни HPF във всяка ямка. Всяка лента представлява средна стойност ± SEM на данните, получени от 3 независими експеримента. *=стр< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
Фиг. 4. Ефект надиосминвърху COM кристално-клетъчна адхезия. Анализът на адхезията на кристалните клетки се извършва с равен обем (4 ul) кристализационен буфер (празна контрола), DMSO (отрицателна контрола) или диосмин (2,5–160 nM). (A): Микрографии на останалите кристали, които са плътно прилепнали към клетъчния монослой след отстраняване на несвързаните кристали чрез енергични промивания с PBS. Първоначалното увеличение беше 200 × за всички панели. (B): Броят на залепналите кристали се преброява от най-малко 15 произволни полета във всяка ямка. Всяка лента представлява средно ±SEM на данните, получени от 3 независими експеримента. *{{8 стр<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
Фиг. 5. Ефект надиосминвърху интернализацията на COM кристал в клетките на бъбречните тубули. Анализът на кристална интернализация беше извършен с помощта на маркирани с FITC COM кристали (FITC-COM), докато обикновените (небелязани) COM кристали бяха използвани за изваждане на фон/шум. Анализът се извършва с равен обем (4 ul) кристализационен буфер (празна контрола), DMSO (отрицателна контрола) или диосмин (2,5–160nM). (A): Поточен цитометричен точков анализ на размера (y-ос) и интензитета на FITC-флуоресценция (x-ос) на клетките след отстраняване на неинтернализирани кристали с 0,1 процента трипсин/2,5 mM EDTA. (B): Процент на клетките с интернализирани FITC-маркирани COM кристали. Всяка лента представлява средна стойност ± SEM на данните, получени от 3 независими експеримента. *= стр<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
Фиг. 6. Ефект надиосминпри инвазия на COM кристал през ECM. Кристална инвазия чрез ЕСМ анализ се извършва с помощта на COM кристали, покрити с кристализационен буфер (празна контрола), DMSO (отрицателна контрола), албумин (положителна контрола) или диосмин (2,5–160 nM). (A): Микрографии на COM кристалите, нахлули или мигриращи през ECM миграционната камера. Първоначалното увеличение беше 100 × за всички панели. (B): Разстоянието на кристална инвазия е измерено от най-малко 15 произволни LPF във всяка камера. Всяка лента представлява средно ±SEM на данните, получени от 3 независими експеримента. *= стр<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. Обсъждане
Бъбречнокаменната болест се причинява от образуването на камъни вътре вбъбреки тазовата система. Обичайните процеси на образуване на камъни в бъбреците включват кристализация на COM, растеж, агрегация, задържане чрез адхезия на кристални клетки и инвазия през бъбречния интерстициум, богат на ECM [21,22]. Има няколко опита за предотвратяване на това заболяване с помощта на различни лекарства и/или хранителни добавки. Много скорошни доказателства показват, че флавоноидите, флавоновите гликозиди и други съединения, извлечени от цитрусови плодове, могат да имат превантивен ефект върху бъбречно-каменната болест и други разстройства [23–25]. Сред тези,диосмин, естествен флавонов гликозид и производно на хесперидин, намиращ се главно в цитрусовите плодове [1,2], се предполага, че играе превантивна роля срещу нараняване и увреждане набъбректъкан [13,42]. Нещо повече, неговата роля срещу уролитиазата е докладвана в няколко предишни проучвания, използващи животински модели [26,27]. Независимо от това, благоприятните ефекти и основните механизми на диосмин за предотвратяване на камъни в бъбреците остават неясни. По този начин ние изследвахме модулиращата активност на диосмин върху COM кристали. Систематичните анализи са извършени на различни етапи от COMбъбрекобразуване на камъни, включително кристализация, растеж на кристали, агрегация, адхезия на кристални клетки, интернализация в бъбречните тубулни клетки и инвазия чрез ECM.
След перорален прием надиосмин, плазменото му ниво при хора варира от {{0}}.5 до 200 ng/ml (или 0,8–300 nM) [43,44]. Максималната плазмена концентрация (Cmax) е приблизително 50 ng/ml (или 85 nM) [43,44]. Следователно дозите на диосмин, използвани в настоящото ни проучване (2,5–160 nM), са във фармакологично приложимия диапазон за неговата фармакокинетика. Тъй като DMSO беше използван като разредител за пълно разтваряне на диосмин според препоръката, DMSO беше използван като отрицателна контрола в това проучване в допълнение към празната контрола, за да се гарантира, че няма ефекти от самия разредител, които биха могли да попречат на интерпретацията на данните. При всички анализи данните показват, че няма наблюдавани значителни ефекти от DMSO и всички количествени данни, получени от отрицателната контрола, са сравними с тези от празната контрола.
COM кристализационният анализ разкри, че всички концентрации надиосмин(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 и 160nM) може да намали размера на COM кристала, но от друга страна, увеличи броя на кристалите. Тъй като кристалната маса е крайният продукт както на размера, така и на броя на кристалите и е по-подходяща за отразяване на степента на кристализация на COM, след това оценихме дали диосминът е повлиял на този кристален индекс. Данните показват, че всички концентрации на диосмин имат стимулиращ ефект върху кристалната маса на COM, в съответствие с данните за броя на кристалите. След кристализация, COM кристалите могат допълнително да растат до по-голям размер за следващата стъпкабъбрекобразуване на камъни.
За разлика от кристализацията, диосминът при всички концентрации проявява инхибиторен ефект върху растежа на COM кристалите по дозозависим начин. Някои предишни проучвания съобщават, че разтворимостта на кристалите CaOx може да се увеличи чрез производни на хидроксиантрахинони с гликозилиране [45]. В допълнение, наличието на захари в такива биоактивни съединения може да се свърже със свободен калциев йон, вероятно поради хидроксилните групи в молекулната структура, като по този начин инхибира образуването на CaOx кристали [45,46]. Диосминът може също да повлияе на прехода на разтворените калциеви и оксалатни йони в кристалните частици COM в бъбречната тубулна течност в процеса на кристализация на COM въз основа на този механизъм.
Независимо от това, агрегацията на COM кристали беше насърчавана от 10–160 nMдиосмин, което предполага способността на диосмин да действа като линкер или адхезивна молекула за набиране на отделни кристали, за да се свържат заедно, за да образуват кристалните агрегати. Това свързване също води до прогресиране на адхезивни мостове между отделните кристали и може да предизвика образуването на голяма структура на COM кристали, които лесно допринасят за отлагането на каменни нидуси вътре вбъбрек[32].
Задържането на COM кристали чрез адхезия на кристали върху повърхностите на бъбречните тубулни клетки е установено като друга важна стъпка за образуване на камъни в бъбреците [47]. Нашите данни разкриват, че диосминът може да намали адхезивната способност на COM кристалите да се свързват с апикалните повърхности на MDCK бъбречни тубулни клетки. Някои предишни проучвания показват, че гликозаминогликани (полизахаридни съединения), покрити върху CaOx кристали или експресирани върху бъбречни тубулни клетки, могат да повлияят на адхезивната способност на CaOx кристалите върху бъбречните тубулни клетки [48]. Освен това, експресията на кристални рецептори върху бъбречните тубулни клетки е един от решаващите механизми, определящи адхезията на кристалните клетки [21]. Докато кристалите CaOx индуцират нараняване на апикалните мембрани, особено на микровилите, някои полифеноли като епигалокатехин галат (EGCG) могат да предотвратят адхезията на кристалните клетки и клетъчното увреждане [49]. Освен това, по-рано се съобщава, че флавоноидното вещество в различни растителни екстракти повишава нивото на pH на урината, което води до инхибиране на адхезията на кристалните клетки [50,51]. може би,диосминможе също така да намали такова клетъчно увреждане, предизвикано от COM, като по този начин намали адхезията на кристалните клетки.
Доказано е, че интернализацията на COM кристал се появява главно чрез ендоцитоза чрез пътя на макропиноцитоза, медииран от актиновия цитоскелет [40]. Съобщава се, че флавоноиди като кверцетин влияят на актиновия цитоскелет, необходим за макропиноцитоза [52, 53]. Нашите открития показаха, че диосминът значително намалява способността на MDCK клетките да интернализират COM кристали. Такъв инхибиторен ефект на диосмин може да бъде свързан със сглобяването или организацията на актиновия цитоскелет вътре в клетките, който пряко засяга пътя на макропиноцитозата [54,55].
След интернализация, COM кристалите се разграждат от ендолизозоми, което води до увеличаване на свободните калциеви и оксалатни йони в бъбречния интерстициум [37]. Такива увеличения на калциеви и оксалатни йони могат да доведат до неокристализация на COM в бъбречния интерстициум [56,57]. В допълнение, наличието на интерстициални COM кристали може да е от дефекти на плътно свързване и парацелуларни адхезионни бариери, което води до повишена парацелуларна пропускливост и кристална транслокация [58–60]. След това тези кристали могат да нахлуят в бъбречния интерстициум през ECM и впоследствие да предизвикат няколко възпалителни реакции и увреждане на тъканите [58–60]. В това проучване ние наблюдавахме, че инвазията на COM кристали през ECM миграционната камера е предизвикана от всички концентрации на диосмин. Диосминът може да се свърже с кристалните повърхности на COM и да взаимодейства с плазминоген-плазминовата система, която стимулира миграцията на кристалите в миграционната камера на ECM [38,39].
Цистанче за бъбреци
защотодиосмининдуцирани както инхибиращи, така и насърчаващи ефекти върху различни различни процеси на образуване на COM камъни, затова ние определихме тяхната връзка с помощта на корелационния тест на Pearson. Корелационният анализ разкри, че броят на кристалите обратно корелира както с размера на кристала, така и с растежа на кристала (Δ размер на кристала) (Фиг. 7A и B). Размерът на кристала силно корелира с растежа на кристала (фиг. 7C), но обратно корелира с кристалната маса (фиг. 7D). И накрая, кристалната маса силно корелира както с броя на кристалите, така и с кристалната агрегация (фиг. 7E и F). От корелационния анализ, данните показват, че броят на кристалите и кристалната маса са по-подходящи за отразяване на кристализацията, отколкото размера на кристала (фиг. 7A, D и E). В допълнение, размерът на неокристалите по време на кристализацията е свързан с растежа на предварително образуваните кристали (Фиг. 7C), докато степента на кристализация (отразена от броя на кристалите и кристалната маса) е тясно свързана със степента на кристална агрегация (Фиг. 7E и Е). Въпреки това, тези корелации най-вероятно са специфични за ефектите на диосмин, докато ефектите от други модулатори могат или не могат да имат същите корелации. Например, фибронектинът намалява кристалната маса и инхибира растежа на кристалите, но насърчава кристалната агрегация [31]. В допълнение, интактната жизнеспособна Escherichia coli увеличава размера и масата на кристалите, но няма ефект върху броя на кристалите [33]. Тези данни показват, че корелациите между различните COM кристални анализи не са универсални за всички модулатори.
И накрая, ние обобщихме резултатите, получени от различни анализи и ги интегрирахме с патогенните механизми набъбреккаменна болест (вижте схемите на фиг. 8). От корелационния анализ диосминът насърчава кристализацията (фиг. 8А). Между кристализацията и растежа на кристалите,диосминподдържа добре баланс, като насърчава кристализацията, но, от друга страна, инхибира растежа на кристалите (фиг. 8B). Що се отнася до всички ефекти върху COM кристалите самостоятелно (без да се вземат предвид клетките и ECM, които също се намесват), стимулиращата активност на диосмин е по-видна от неговата инхибираща активност върху COM кристалите, тъй като той насърчава както кристализацията, така и кристалната агрегация, но инхибира само растежа на кристалите ( Фиг. 8C). Въпреки че кристализацията се увеличава, размерът на кристалите намалява и се свързва с инхибирането на растежа (фиг. 7C). Тези данни са в съответствие с резултатите, докладвани от Kavanagh et al. [61–63], демонстрирайки, че увеличаването на кристализацията води до намаляване на свръхнасищането на калциеви и оксалатни йони в разтвора, като по този начин намалява растежа. Растежът на кристалите обаче не е единственият фактор, определящбъбреккаменна патогенеза [64], особено когато кристалната маса надвишава и е свързана с увеличаването на кристалната агрегация (фиг. 7F), което може да увеличи шанса кристалните материали да се забият в малки тръбни сегменти (в интратубуларната хипотеза), като по този начин увеличават възможността за образуване на камъни. Освен това, предишно проучване показа данните в съответствие с нашите открития, което показва, че увеличаването на броя на кристалите е свързано с увеличаването на кристалната агрегация и уголемяването на камъка [63].
Фиг. 7. Корелационен анализ. (A) – (F): Корелациите между броя на кристалите COM, размера на кристала, Δ размера на кристала, кристалната маса и редица кристални агрегати бяха анализирани чрез корелационен тест на Pearson.
Фиг. 8. Схеми, обобщаващи модулаторните ефекти надиосминна COMбъбрекпроцеси на образуване на камъни. (A): Ефекти на диосмин върху кристализацията на COM. (B): Ефекти на диосмин върху кристализацията на COM и растежа на кристалите. (C): Ефекти на диосмин върху COM кристализация, растеж и агрегация. (D): Ефекти на диосмин върху процесите на образуване на камъни в бъбреците като цяло.
Когато се вземат предвид взаимодействията с бъбречните тубулни клетки и ECM, глобалната картина на двойните ефекти надиосминна COM образуването на камъни в бъбреците става много по-ясно (фиг. 8D). Диосминът инхибира адхезията на кристалните клетки, като по този начин намалява интернализацията на кристалите в клетките. Това може да се обясни, че по-малкият размер на COM кристалите има по-малка адхезивна способност да свързва бъбречните тубулни клетки в сравнение с по-големите, както се съобщава в нашето скорошно проучване [34] и предишно проучване от друга група [65]. По-малката адхезивна способност на по-малките COM кристали се дължи на тяхната по-малка адхезивна сила към клетъчната повърхност и по-малък брой COM кристални рецептори, свързани с тях, както е определено чрез атомно-силова микроскопия и съответно анализ на протеоми [34]. Диосминът също инхибира интернализацията на кристалите. Имайте предвид, че процесът на интернализация е нож с две остриета, който се нуждае от внимателно тълкуване. Интернализацията или ендоцитозата в един от защитните механизми, които клетките използват за елиминиране на кристали от ендолизозоми. Въпреки това, разграждането на непокътнатите кристали генерира свободни калциеви и оксалатни йони, които могат да се преместят от вътреклетъчното отделение към бъбречния интерстициум, където могат да генерират неокристали [56,57]. От друга страна, диосминът насърчава кристалната инвазия през ЕСМ, което е един от механизмите, важни за патогенезата на бъбречните камъни (особено в модела на плака на Рандал) [58–60]. Като цяло Фиг. 8D обобщава всички двойни модулиращи ефекти на диосмин върху COMбъбрекпроцеси на образуване на камъни. Трябва да се отбележи, че балансът на тези стимулиращи и инхибиращи ефекти не може да бъде точно изчислен (за разлика от математическото уравнение). Освен това има няколко други ендогенни и екзогенни фактора, които също могат да се намесят в процесите на образуване на камъни. И накрая, диосминът проявява и няколко косвени ефекта върху образуването на камъни в бъбреците, включително неговите антиоксидантни и противовъзпалителни свойства [5,6], които трябва да бъдат взети под внимание. Следователно, крайният резултат от тези двойни модулиращи ефекти надиосминна COMбъбрекобразуването на камъни се нуждае от по-нататъшно изследване in vivo и проспективно проучване с голяма кохорта.
5. Изводи
В обобщение, тук докладваме двойните ефекти на диосмин върху кристалната модулация на COM по дозозависим начин. Въпреки че инхибира растежа на COM кристалите, адхезията на кристалните клетки и интернализацията в клетките на бъбречните тубули,диосминнасърчава COM кристализацията, агрегацията и инвазията през ECM. Поради това неговата антиуролитиазна роля е съмнителна и трябва да се внимава при употребата му при бъбречно-каменна болест.
Декларация за авторски принос на CrediT
Supaporn Khamchun: Концептуализация, методология, софтуер, валидиране, формален анализ, разследване, обработка на данни, писане – оригинална чернова, визуализация, Sunisa Yoodee: концептуализация, методология, софтуер, валидиране, формален анализ, разследване, обработка на данни, писане – оригинална чернова, Визуализация, Посетете Thongboonkerd: Концептуализация, Методология, Софтуер, Валидиране, Ресурси, Писане – преглед и редактиране, Надзор, Администриране на проекти, Придобиване на финансиране.
Изявление за конфликт на интереси
Авторите декларират, че НЯМА конфликт на интереси.
Благодарности
Благодарни сме за техническата помощ на Kittiya Suwannakud. Тази работа беше подкрепена от Службата на Националния съвет за научни изследвания и иновационна политика в областта на висшето образование (NXPO) чрез PMU-B и Тайландския изследователски фонд (IRN60W0004). VT също се подкрепя от безвъзмездната помощ „Chalermphrakiat“, болница Siriraj на Факултета по медицина.
Препратки
[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,Диосмин– техники за изолиране, определяне в растителен материал и фармацевтични състави и клинична употреба, Nat. произв. Общ. 8 (2013) 545–550.
[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, Метаболизъм и фармакологична активност на естественото здравословно съединение диосмин, Food Funct. 11 (2020) 8472–8492.
[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton срещу Daflon: оценка на ефектите върху качеството на живот при хронична венозна недостатъчност, Angiology 57 (2006) 131–138.
[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Микронизирана пречистена флавоноидна фракция: преглед на употребата й при хронична венозна недостатъчност, венозни язви и хемороиди, лекарства 63 (2003) 71–100.
[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Противовъзпалителна, антиоксидантна и антиапоптозна активност на диосмин при индуциран от оцетна киселина улцерозен колит, Hum. Exp. Токсикол. 37 (2018) 78–86.
[6] M. Berkoz, Diosmin потиска провъзпалителните медиатори в липополизахарид-индуцирани RAW264.7 макрофаги чрез NF-kappaB и MAPKs сигнални пътища, Gen. Physiol. Biophys. 38 (2019) 315–324.
[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin индуцира апоптоза чрез модулиране на STAT-3 сигнализиране в 7,12 диметилбенз(а)антрацен индуцирана карциногенеза на букалната торбичка, Biomed. Pharm. 83 (2016) 1064–1070.
[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, индуцирано от диосмин стареене, апоптоза и аутофагия в клетки от рак на гърдата с различен p53 статус и ERK активност, Toxicol. Лет. 265 (2017) 117–130.
[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, Комбинация от повторно предназначено лекарство диосмин с амоксицилин-клавуланова киселина причинява синергично инхибиране на микобактериалния растеж, Sci. Доп. 9 (2019) 6800.
[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, Антихипергликемичното действие на диосмин, цитрусов флавоноид, се индуцира чрез ендогенен бета-ендорфин при плъхове с диабет тип I, Clin. Exp. Pharm. Physiol. 44 (2017) 549–555.
[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,Диосминпредварителната обработка подобрява сърдечната функция и потиска оксидативния стрес в сърцето на плъх след исхемия/реперфузия, Eur. J. Pharm. 736 (2014) 131–137.
[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin предпазва ретината на плъх от исхемия/реперфузионно увреждане, J. Ocul. Pharm. Там. 28 (2012) 459–466.
[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Защитни ефекти на хесперидин и диосмин срещу индуциран от акриламид черен дроб, бъбреци, и окислително увреждане на мозъка при плъхове, Environ. Sci. замърсяване. Рез. Вътр. 26 (2019) 35151–35162.
[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, AD Rule, Определяне на истинската тежест набъбреккаменна болест, Nat. Нефрол. 16 (2020) 736–746.
[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Нефролитиаза, Prim. Грижа 47 (2020) 661–671.
[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Бъбречни камъни, Ann. Clin. Biochem 56 (2019) 15–27.
[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, Състав на камъните и съдови калцификации при пациенти с нефролитиаза, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.
[18] Г. Шуберт, Анализ на камъни, Urol. Рез. 34 (2006) 146–150.
[19] A. Vinaiphat, S. Aluksanasuwan, J. Manissorn, S. Sutthimethakorn, V. Thongboonkerd, Отговор на бъбречни тубулни клетки към диференциални типове и дози кристали на калциев оксалат: интегративен анализ на протеомна мрежа и функционални изследвания, Proteomics 17 (2017) ), 1700192.
[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Анализ на протеинова мрежа и функционални изследвания на индуцирана от кристали на калциев оксалат цитотоксичност в бъбречни тубулни епителни клетки, Proteomics 18 (2018), 1800008.
[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Нефролитиаза: молекулярен механизъм на образуване на бъбречни камъни и критичната роля на модулаторите, Biomed. Рез. Вътр. 2013 (2013), 292953.
[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Механизми на образуване на камъни, Clin. Преподобният копач на кости. Metab. 9 (2011) 187–197.
[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, Защитни роли на флавоноиди и богати на флавоноиди растителни екстракти срещу уролитиаза: преглед, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 59 (2019) 2125–2135.
[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, Диетични растения за превенция и управление набъбреккамъни: предклинични и клинични доказателства и молекулярни механизми, Int. J. Mol. Sci. 19 (2018) 765.
[25] С. Ахмед, М. М. Хасан, Х. Хан, З. А. Махмуд, С. Пател, Механистичното прозрение на полифенолите в смекчаването на уролитиазата с калциев оксалат, Biomed. Pharm. 106 (2018) 1292–1299.
[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, Оценка на защитните ефекти на диосмин (цитрусов флавоноид) при химично индуцирана уролитиаза при експериментални плъхове, Pharm. Biol. 54 (2016) 1513–1521.
[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,Диосминнамалява отлагането на калциев оксалат и тъканната дегенерация при нефролитиаза при плъхове: стереологично изследване, Korean J. Urol. 54 (2013) 252–257.
[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, Фактори, определящи видовете и морфологиите на кристалите на калциев оксалат: моларни концентрации, буфериране, pH, разбъркване и температура, Clin. Чим. Acta 367 (2006) 120–131.
[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Протеомен анализ на индуцирана от кристали цитотоксичност на калциев оксалат монохидрат в дисталните бъбречни тубулни клетки, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.
[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, фактор на удължаване Tu върху Escherichia coli изолиран от урината на пациенти с камъни в бъбреците, насърчава растежа и агрегацията на кристали на калциев оксалат, Sci. Rep. 7 (2017) 2953.
[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Модулаторни ефекти на фибронектин върху кристализация на калциев оксалат, растеж, агрегация, адхезия върху бъбречни тубулни клетки и инвазия през извънклетъчния матрикс, J. Biol. Inorg. Chem. 24 (2019) 235–246.
[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Дефиниране и систематични анализи на индекси на агрегация за оценка на степента на агрегация на кристали на калциев оксалат, Front. Chem. 5 (2017) 113.
[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum е отговорен за насърчаването на ефектите на жизнеспособна Escherichia coli върху кристализацията на калциев оксалат, растежа на кристалите и агрегацията на кристали, отпред. Microbiol 10 (2019) 2507.
[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Диференциално свързани протеини и адхезивни способности на кристали на калциев оксалат монохидрат с различни размери, Int. J. Biol. Macromol. 163 (2020) 2210–2223.
[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, Surface heat shock protein 90 служи като потенциален рецептор за калциев оксалатен кристал върху апикалната мембрана на бъбречните тубулни епителни клетки, J. Biol. Inorg. Chem. 21 (2016) 463–474.
[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, Нерадиоактивно маркиране на кристали на калциев оксалат за изследвания на взаимодействие и интернализация на кристални клетки, Anal. Методи 2 (2010) 1536–1541.
[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, Кристалите на калциевия оксалат монохидрат, интернализирани в бъбречните тубулни клетки, се разграждат и разтварят от ендолизозоми, Chem. Biol. Взаимодействайте. 246 (2016) 30–35.
[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Нов анализ за оценка на стимулиращите ефекти на протеините върху кристалната инвазия на калциев оксалат през извънклетъчната матрица на базата на плазминоген/плазминова активност, Talanta 101 (2012) 240–245.
[39] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Кристалите на калциевия оксалат повишават секрецията на енолаза-1 от бъбречните тубулни клетки, което впоследствие засилва инвазията на кристали и моноцити през бъбречния интерстициум, Sci. Доп. 6 (2016) 24064.
[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Макропиноцитозата е основният механизъм за ендоцитоза на кристали на калциев оксалат в клетки на бъбречните тубули, Cell Biochem. Biophys. 67 (2013) 1171–1179.
[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod: база данни забъбреккамък модулиращи протеини с експериментални доказателства, Sci. Доп. 10 (2020) 15109.
[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, Ефектите на диосмин върху индуцирано от афлатоксин увреждане на черния дроб и бъбреците, Environ. Sci. замърсяване. Рез. Вътр. 24 (2017) 27931–27941.
[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, Сравнителна бионаличност на двадиосминсъстави след перорално приложение на здрави доброволци, Molecules 23 (2018) 2174.
[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Фармакокинетика на флаванонови гликозиди след поглъщане на единични дози прясно изцеден портокалов сок спрямо търговски преработен портокалов сок при здрави хора, J. Agric . Food Chem. 62 (2014) 12576–12584.
[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Синтез на гликозидни производни на хидроксиантрахинон със способност да разтварят и инхибират образуването на кристали от калциев оксалат. Потенциални съединения в терапията с камъни в бъбреците, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 1001–1007.
[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Изследване на крем на базата на мио-инозитол хексафосфат за предотвратяване на дистрофична калциноза на кожата, Br. J. Dermatol. 152 (2005) 1022–1025.
[47] V. Thongboonkerd, Протеомика на взаимодействията между кристални клетки: модел за изследване на камъни в бъбреците, Клетки 8 (2019) 1076.
[48] CF Verkoelen, Задържане на кристали при бъбречнокаменна болест: решаваща роля за гликозаминогликан хиалуронан? J. Am. Soc. Нефрол. 17 (2006) 1673–1687.
[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Увреждане на микровилари в епителни клетки на бъбречните тубули, индуцирано от кристал на калциев оксалат и защитната роля на епигалокатехин-3-галат, FASEB J. 31 (2017) 120 –131.
[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, Общите флавоноиди на Desmodium styracifolium намаляват образуването на хидрокси- Индуцирана от L-пролин калциево-оксалатна уролитиаза при плъхове, Уролитиаза 46 (2018) 231–241.
[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Систематична оценка за ефектите на рН на урината върху кристализацията на калциев оксалат, адхезията на кристалните клетки и интернализацията в клетките на бъбречните тубули, Sci. Rep. 7 (2017) 1798.
[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Инхибиращ ефект върху фагоцитозата на Candida albicans, индуцирана от предварително третиране с кверцетин чрез намеса в актиновия цитоскелет, J. Tradit. Брадичка. Med. 33 (2013) 804–809.
[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, Кверцетинът инхибира индуцираната от LPS миграция на макрофаги чрез потискане на пътя iNOS/FAK/paxillin и модулиране на цитоскелета, Cell Adhes . Мигр. 13 (2019) 1–12.
[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, Рециклирането на мембраната, медиирано от макропиноцитоза, задвижва миграцията на нервния гребен чрез доставяне на F- актин към ламелиподиума, Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 117 (2020) 27400–27411.
[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, F-актин-свързващият RapGEF GflB е необходим за ефективна макропиноцитоза в Dictyostelium, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.
[56] A. Khan, Разпространение, патофизиологични механизми и фактори, засягащи уролитиазата, Int. Урол. Нефрол. 50 (2018) 799–806.
[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, Механизми на образуване на човешки камъни в бъбреците, Уролитиаза 43 (Suppl 1) (2015) 19–32.
[58] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Митохондриална дисфункция ибъбреккаменна болест, Front. Physiol. 11 (2020), 566506.
[59] SR Khan, Хистологични аспекти на модела на "фиксираните частици" на образуване на камъни: изследвания върху животни, Уролитиаза 45 (2017) 75–87.
[60] VY Bird, SR Khan, Как се образуват камъните? Възможно ли е обединяване на теориите за образуването на камъни? арх. Esp. Урол. 70 (2017) 12–27.
[61] JP Kavanagh, Методи за изследване на кристализацията на калциев оксалат и тяхното приложение при изследване на уролитиаза, Scanning Microsc. 6 (1992) 685–704, дискусия 704-5.
[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, Кинетика на кристализация на калциев оксалат при различни концентрации на човешка и изкуствена урина, с постоянно съотношение калций към оксалат, Urol. Рез. 27 (1999) 231–237.
[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, кристалурия и агрегация: ключови съставки за уголемяване на камъни, Urol. Рез. 36 (2008) 11–15.
[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Обратно инженерство на бъбрека: моделиране на кристализацията на калциев оксалат монохидрат в нефрона, Med. Biol. инж. Изчисл. 48 (2010) 649–659.
[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, Ефектът на интракристален и повърхностно свързан остеопонтин върху прикрепването на кристалите на калциев оксалат дихидрат към клетките на кучешкия бъбрек Madin-Darby (MDCK) в ултрафилтрирана човешка урина, BJU Int. 109 (2012) 1100–1109.
