Ехинакозидът обръща ремоделирането на миокарда и подобрява сърдечната функция

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Яджуан Ни1|Jie Deng1|Xin Liu1|Цин Ли1|Хуанли Джан1|Хонгюан Бай1|Дзинвен Джан 2

Резюме

Миокардното ремоделиране е важна патологична основа на HF, митохондриалният оксидативен стрес е промотор на миокардна хипертрофия, фиброза и апоптоза. ECH е основният активен компонент на традиционната китайска медицина Cistanches Herba, много изследвания показват, че притежава силен антиоксидантен капацитет в нервните клетки и тумори, инхибира митохондриалния оксидативен стрес, защитава митохондриалната функция, но специфичният механизъм е неясен. SIRT1/FOXO3a/MnSOD е важна антиоксидантна ос, проучване установява, че ECH се свързва ковалентно със SIRT1 като лиганд и регулира нагоре експресията на SIRT1 в мозъчните клетки. Ние предполагаме, че ECH може да обърне ремоделирането на миокарда и да подобри сърдечната функция на СН чрез регулиране на сигналната ос SIRT1/FOXO3a/MnSOD и инхибиране на митохондриалния оксидативен стрес в кардиомиоцитите. Тук първо индуцираме клетъчен модел на оксидативен стрес чрез ISO с AC-16 клетки и предварително третиране с ECH, нивото на митохондриална ROS, mtDNA окислително увреждане, MMP, карбонилиран протеин, липидна пероксидация, вътреклетъчна ROS и се откриват апоптоза, потвърждават ефекта на ECH върху митохондриалния оксидативен стрес и функционират in vitro. След това установяваме HF модел на плъх, индуциран от ISO и предварително третиран с ECH. Измерват се индекси на сърдечна функция, ремоделиране на миокарда, митохондриален оксидативен стрес и функция, експресия на сигналната ос SIRT1/FOXO3a/MnSOD, данните показват, че ECH подобрява сърдечната функция, инхибира хипертрофията на миокарда, фиброзата и апоптозата повишава експресията на SIRT1/FOXO3a/ MnSOD сигнализираща ос, намалява митохондриалните окислителни увреждания, защитава митохондриалната функция. Ние заключаваме, че ECH обръща ремоделирането на миокарда и подобрява сърдечната функция чрез регулиране нагоре на оста SIRT1/FOXO3a/MnSOD и инхибиране на митохондриалния оксидативен стрес при HF плъхове.

КЛЮЧОВА ДУМА сехинакозид, сърдечна недостатъчност, митохондриален оксидативен стрес, миокардно ремоделиране

пресни билки цистанчеда семитохондриален оксидативен стрес

1|ВЪВЕДЕНИЕ

Сърдечната недостатъчност (СН) е крайният резултат от повечето сърдечно-съдови заболявания с високо разпространение и лоша прогноза и с утежняващата се тенденция на застаряване на населението, хоспитализацията и смъртността, дължащи се на хронична сърдечна недостатъчност (ХСН), се увеличиха рязко в целия свят.1 През последните 20 години лекарственото лечение на СН постигна голям напредък, но ефектът е много ограничен, така че спешно са необходими нови лекарства. Миокардното ремоделиране е важна патологична основа на HF и се характеризира с миокардна хипертрофия, апоптоза, интерстициална фиброза, миокардните клетки са дезорганизирани и водят до намаляване на фракцията на изтласкване (LVEF), увеличаване на левокамерните крайни диастолни и систолни размери (LVIDd и LVIDs) и намаляване на фракционното скъсяване на лявата камера (LVFS).2 Но лежащите в основата механизми все още не са напълно разбрани. През последните години множество проучвания потвърдиха, че оксидативният стрес е важен промотор на миокардното ремоделиране.3-7

Оксидативният стрес е състояние, при което реактивните кислородни видове (ROS) или свободните радикали се генерират прекомерно и водят до окислително увреждане на клетъчните компоненти, което от своя страна причинява клетъчна дисфункция. 8 Митохондриите са основният източник на вътреклетъчни ROS, в резултат на изтичане от респираторната електротранспортна верига, а митохондриите са най-чувствителната позиция към ROS ефектите.9 Проучванията при HF идентифицират повишено генериране на ROS от комплекс I на дихателната верига.8 Повишеното производство на ROS атакува първо митохондриалните компоненти и води до прекомерен оксидативен стрес , се проявява като карбонилиране на протеини, липидна пероксидация и увреждане на ДНК,10 и дисфункция на митохондриите, което впоследствие води до прекомерно образуване на ROS,8 образува порочен кръг. Доказано е, че продължителният оксидативен стрес може да причини миокардна хипертрофия и миокардна фиброза 11-13 и да причини апоптоза на миокардни клетки чрез активиране на зависима от митохондриите апоптоза в резултат на карбонилиране на протеини на митохондриалната мембрана и загуба на потенциал на митохондриалната мембрана.14 Така че , се счита, че инхибирането на митохондриалния оксидативен стрес може да бъде нова стратегия за предотвратяване на ремоделиране на миокарда и дори сърдечна недостатъчност.15-17

Echinacoside (ECH), естествен фенилетаноиден гликозид, е основният активен компонент на Cistanches Herba, която е традиционна китайска медицина. През последните години ECH е изследван задълбочено в нервната система и туморите и се съобщава, че притежава различни фармакологични ефекти, като антиоксидантни, противовъзпалителни, антиапоптозни и антитуморни свойства.18,19In нервните клетки, ECH значително повишава антиоксидантния капацитет, намалява производството на ROS, подобрява потенциала на митохондриалната мембрана (ММР) и повишава жизнеспособността на клетките,20 проявява защитни ефекти върху митохондриалната функция и инхибира митохондриалния оксидативен стрес, предпазва от оксидативно увреждане и подобрява паметта, в крайна сметка предотвратява невродегенерация.21,22 ECH също повишава активността на SOD и играе защитна роля в мозъчната тъкан и тъканта на ретината,19,23 но специфичният механизъм за неговия антиоксидантен ефект е неясен.

SIRT1 е тясно свързан с оксидативния стрес, а сигнализиращата ос SIRT1/FOXO3a/MnSOD е най-важната антиоксидантна ос и е отговорна за потискането на митохондриалния оксидативен стрес, MnSOD се разпространява широко в митохондриите и е отговорен основно за изчистването на митохондриалните ROS, като по този начин инхибиране на оксидативния стрес, съединения, които активират тази антиоксидантна ос, могат да инхибират оксидативния стрес.24,25 Последните проучвания показват, че ECH упражнява своите фармакологични ефекти чрез регулиране на множество сигнални пътища, като p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-бета 1/Smads , и SIRT1 сигнален път.26-29 ново проучване установява, че ECH се свързва ковалентно със SIRT1 като лиганд и регулира нагоре експресията на SIRT1 в мозъчните клетки. 26 Това предполага, че ECH може да инхибира митохондриалния оксидативен стрес в кардиомиоцитите и да обърне миокарда ремоделиране. Въпреки това, изследванията върху ефектите на ECH са фокусирани върху нервната система или тумора, ефектите и механизмите на ECH върху митохондриалния оксидативен стрес в кардиомиоцитите и миокардното ремоделиране остават неизвестни. Тук първо индуцираме клетъчен модел на оксидативен стрес от ISO и потвърждаваме ефекта на ECH върху митохондриалния оксидативен стрес и функция in vitro. След това установяваме HF модел на плъх, индуциран от ISO, и демонстрираме, че ECH обръща миокардното ремоделиране и подобрява сърдечната функция чрез регулиране нагоре на сигналната ос SIRT1/FOXO3a/MnSOD и инхибиране на митохондриалния оксидативен стрес при HF плъхове. Резултатите имат за цел да предоставят експериментални доказателства за разработването на нови лекарства за предотвратяване на сърдечна недостатъчност.

2|МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

2.1|Клетъчна култура и лечение

AC16 клетките са закупени от Bena Culture Collection. Клетките се поддържат в модифицирана среда на Eagle с високо съдържание на глюкоза на Dulbecco (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, САЩ) с добавка от 10 процента фетален говежди серум (10 процента FBS; Gibco) в T-75 колби (Corning Glassworks, Corning, Ню Йорк, САЩ). Условията се поддържат при 37 градуса във влажна атмосфера, съдържаща 5 процента CO2. След като клетките достигнат 70 процента -80 процента сливане, клетките от групата ISO (Sigma, САЩ) се инкубират със среда, съдържаща 10uM ISO (Sigma, САЩ) за 24 часа, клетките от групата ECH се третират предварително с 50uM ECH (MCE , САЩ) за 30 минути преди излагане на ISO. Контролните клетки (Ctrl) не се третират нищо.

продавам цистанчеекстракт

2.2|Откриване на митохондриално ROS ниво с помощта на хемилуминесценция на луминол

Митохондриите се изолират и пречистват от AC-16 клетки с помощта на комплект за изолиране на митохондрии (Sigma, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Концентрациите на протеин се определят от комплекта за анализ на протеин BCA (Biotech). Нивото на ROS в митохондриите се открива чрез луминал (3-аминофталов хидразид 5-амино-2,3-дихидро-1,4-фталазиндион) с помощта на комплект Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, САЩ), той реагира с ROS и предизвиква излъчване на фотони, което е лентов спектър с пик при около 460 nm, а относителната светлинна единица (RLU) се открива от инструмент за измерване на хемилуминесценция и се преобразува в RLU/ug митохондриален протеин.

2.3|8-OHdG се използва за оценка на окислителното увреждане на митохондриалната ДНК

Окислителното увреждане на митохондриалната ДНК се оценява чрез откриване на съдържанието на 8-хидрокси-2-деоксигуанозин (8-OHG). Пречистените митохондрии в клетките се изолират с помощта на комплект за изолиране на митохондрии, както по-горе (Sigma). Концентрациите на протеин се определят от комплекта за анализ на протеин BCA (Biotech). След това те се дисоциират, за да се определи нивото на 8-OHdG с помощта на комплект Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Абсорбцията на промяната на цвета се измерва в спектрофотометър при дължина на вълната 450 nm. След това концентрацията на 8-OHdG в пробите се определя чрез сравняване на OD на пробите със стандартната крива и се преобразува в ng/ml.

2.4|Измерване на MMP чрез JC-1

Митохондриите се изолират и пречистват от AC-16 и протеиновата концентрация се определя, както е споменато по-горе. След това митохондриите се ресуспендират при концентрация от 1 mg/ml, ММР се измерва с помощта на JC-1 комплект за анализ съгласно инструкциите на производителя. Интензитетът на флуоресценция се измерва при дължина на вълната на възбуждане: 490 nm, процеп 5 nm, дължина на вълната на излъчване: 590 nm, процеп 5 nm със спектрофотометър,30 резултатите са представени като FLU/ugP.

2,5|Откриване на апоптотични клетки чрез поточна цитометрия в AC-16 клетки

Поточната цитометрия се използва за оценка на клетъчната апоптоза. Използва се комплект за откриване на апоптоза Annexin V-FITC/PI (CWBIO, Китай) за откриване на апоптотични и некротични клетки съгласно инструкциите на доставчика. Апоптоза в ранен стадий, апоптоза или некроза в късен стадий, клетъчни остатъци и жизнеспособни клетки се идентифицират като анексин V (плюс)/PI (−), анексин V (плюс)/PI (плюс), анексин V (−)/PI ( плюс ) и анексин V (-)/PI (-), съответно. Интензитетите на флуоресценция се анализират с помощта на поточен цитометър (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ). Всеки експеримент се повтаря 3 пъти.

2.6|Оценява се вътреклетъчната ROS чрез поточен цитометър

След третиране клетките се трипсинизират, промиват се два пъти с PBS. След това клетките се ресуспендират в PBS, оцветяват се с DCFH-DA (Beyotime, Китай) при крайна концентрация от 1 μM и се инкубират за 1 час при 37 градуса в инкубатор с CO2 и след това се тестват в поточен цитометър при 488 nm възбуждане . Интензитетът на флуоресценция представлява нивото на вътреклетъчната ROS.

2.7|Тествайте съдържанието на карбонилни протеини в митохондриите на AC-16 клетки

След третиране пречистените митохондрии се изолират и се обработват с ултразвук върху лед и се третират с 1 процент стрептомицин сулфат за утаяване на митохондриални нуклеинови киселини, определя се концентрацията на протеин. Съдържанието на карбонилни протеини се тества с помощта на комплект Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, САЩ) на базата на дериватизация на карбонилната група с динитрофенилхидразин (DNPH), съгласно инструкциите на комплекта, OD се измерва с четец на микроплаки и се превръща в nmol/ mg протеин чрез сравняване със стандартната крива.

2.8|Определяне нивото на липидна пероксидация в митохондриите на AC-16 клетки

След третиране клетките се събират и лизират, митохондриите се изолират и пречистват и се разбиват с ултразвук, протеиновата концентрация се определя от BCA протеиновия тестов комплект (Biotech), липидната пероксидация се определя от нивото на малондиалдехид (MDA) чрез TBARS анализ , като се използва комплект (Nan jing Jian cheng, Китай) и нивото на MDA се измерва в съответствие с протокола на производителя. OD се открива при 586 nm от четец на микроплаки и се преобразува в μmol/g протеин чрез сравняване със стандартната крива.

2.9|Животни и лечение

Млади мъжки плъхове Sprague-Dawley с тегло 120-140g са придобити от Xi'an Jiao tong University Laboratorial Animal Center (Shaanxi, Китай). Изследването е в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, публикувано от Националния институт по здравеопазване на САЩ (публикация на NIH №.85-23, преработена през 1996 г.), а експерименталните протоколи са одобрени от местните власти ( Комитет по биомедицинска етика към медицинския отдел на университета Xi 'a Jiao tong). Моделът на HF при плъхове е установен, както е описано по-рано от нас.31 Накратко, изопротеренол (10 mg/kg) се прилага веднъж дневно чрез интраперитонеална инжекция в продължение на 2 седмици (дефинирана като HF група), ECH се прилага с 20 ug/g веднъж дневно чрез интраперитонеална инжекция 30 минути преди лечението с ISO (дефинирано като ECH група) и прилагането продължава 2 седмици. Контролните животни се администрират с 0,9 процента NaCl (дефинирани като Ctrl група). Ехокардиографските измервания се извършват за оценка на сърдечната функция.

2.10|Ехокардиографски измервания

Животните се анестезират чрез интраперитонеално инжектиране на 300 mg/kg хлоралхидрат. За извършване на ехокардиографски изследвания се използва ултразвуковата система SONOS-2500 с ултразвуков трансдюсер 7,5 MHz (HP, USA). Фракция на изтласкване на лявата камера (LVEF), фракционно скъсяване на лявата камера (LVFS), крайни диастолни размери на лявата камера (LVIDd), крайни систолни размери на лявата камера (LVIDs), сърдечна честота (HR), дебелина на междукамерната преграда в диастола (IVSTd) ), дебелината на задната стена на лявата камера в диастола (LVPWTd) се измерват, както е описано по-рано от нас.32

ФИГУРА 1 50μmol ECH ефективно инхибира митохондриалния оксидативен стрес на AC-16 клетки, индуциран от 10 μmol/L ISO, и защитава митохондриалната функция и намалява апоптозата.

2.11|Измерва се съотношението между теглото на сърцето и телесното тегло (ТТ/ТТ).

Плъхът се претегля преди анестезията, прясното сърце се изолира и измива кръвта с 0.1mol/L PBS, отрязват се съдове и друга излишна тъкан и сърцето се претегля, след което се измерва HW/BW (mg/100g). изчислено.

2.12|Хистологично оцветяване

Сърцата на плъхове се разрязват и фиксират в 4 процента параформалдехид, вградени в парафин и се нарязват на резени с дебелина 5 μm. Оцветяването с хематоксилин-еозин (HE) се използва за наблюдение на патологичните промени и трихромът на Masson се използва за оценка на колагенови влакна на миокардна тъкан на плъхове. Обемната фракция на сърдечния колаген (CVF) и площта на напречното сечение на кардиомиоцитите се измерват с Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA).

2.13|TUNEL оцветяване

Миокардна тъкан от лявата камера се събира и TUNEL анализът се извършва, както е описано по-рано от нас32

2.14|Трансмисионен електронен микроскоп

Прясната сърдечна тъкан се фиксира в 2,5 процента глутаралдехид при 4 градуса, след това тъканта се нарязва на 1 mm3 по обем и отново се фиксира в 2,5 процента глутаралдехид при 4 градуса за 2 часа, след което се промива с 0.1mol/L PBS, фиксиран в 1% осминова киселина, дехидратирана с ацетон, вградена в епоксидна смола, се правят ултратънки срезове, които изтъняват около 800nm, оцветяват се с уранил ацетат и оловен цитрат и след това се наблюдават под трансмисионен електронен микроскоп (H{ {13}}, Hitachi Limited, Япония). За количествено определяне на защитния ефект на ECH в митохондриалната морфология, средната митохондриална обиколка, средната площ на напречното сечение на митохондриите, процентът на дегенерация и процентът на вакуолизация в митохондриите се анализират статистически с Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, САЩ).

2.15|Количествен PCR

Общата РНК се приготвя от левокамерна тъкан с реагент Trizol (Invitrogen, Carlsbad, USA). cDNA се синтезира с помощта на TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan). Специфичните праймерни последователности на колаген, които използвах за PCR в реално време, са както следва: напред: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′, назад: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH напред 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', обратен 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. Количествен PCR в реално време (qPCR) се извършва със SYBRPremix Ex Taq (Перфектно реално време) (Takara, Япония). Относителното ниво на иРНК се изчислява чрез нормализиране към GAPDH, съгласно 2-ΔΔCT метода.

2.16|Western blot анализ на SIRT1, FOXO3a, MnSOD протеинова експресия

Общият протеин на тъканта на лявата камера се екстрахира върху лед, като се използва студен RIPA буфер (BioRad, САЩ) с коктейл от протеазен инхибитор (Sigma-Aldrich). Концентрацията се определя по метода BCA. Процедурите на Western blot са описани по-рано.33 Накратко, протеиновата проба се фракционира върху 15% натриев додецилсулфат-полиакриламидни гелове, прехвърля се върху PVDF мембрани (BioRad, САЩ), блокира се с 5% обезмаслено мляко и се инкубира с MYH антитяло от мишка (разреден 1:200, Санта Круз, САЩ). След това се инкубира с антитяло на коза мишка, конюгирано с пероксидаза от хрян (разредено 1:2, 000, Санта Круз, САЩ). Относителното ниво на протеин се изчислява чрез нормализиране на средната стойност на лъча към -актин. Протеиновите ленти се откриват чрез хемилуминесцентна система (ChemiDoc XRS, BioRad).

2.17|Измерване на митохондриален оксидативен стрес в миокарда на плъх

Пречистените митохондрии от миокарда на плъх се изолират с помощта на комплект за изолиране на митохондрии (Sigma, САЩ) съгласно инструкциите на производителя, митохондриална ROS, MMP, окислително увреждане на mtDNA, съдържание на карбонилиран протеин и ниво на липидна пероксидация в митохондриите се откриват с помощта на същите методи като клетъчни експерименти, описани по-горе. Трябва да се отбележи, че ROS в миокардната тъкан се открива с DCFH-DA флуоресцентни сонди, интензитетът на флуоресценция се открива с измервателния уред за маркиране на ензими, резултатите се представят като RLU/ug митохондриален протеин.

2.18|Статистически анализ

Всички данни са представени като средни стойности ± SEM. Еднопосочният ANOVA се използва за сравняване на разликите между множество групи, последван от post hoc теста на Tukey за значимост. Всички статистики се определят с помощта на софтуер SPSS15.0 (SPSS Inc, IL, САЩ). Стойност на вероятност от P <.05 се="" счита="" за="">

3|РЕЗУЛТАТИ

3.1|50 μM ECH ефективно инхибира митохондриалното окислително увреждане и апоптозата в AC-16 клетки

Необработените клетки се задават като група Ctrl. Първо, както показва Фигура 1А, ECH инхибира митохондриалната ROS, индуцирана от ISO. Третираните с ISO клетки показват значително увеличение на митохондриалната ROS в сравнение с Ctrl и това увеличение е значително отслабено чрез предварително третиране с 50 μM ECH. Второ, ECH може да инхибира окислителното увреждане на mtDNA, индуцирано от ISO. 8-Смята се, че OHdG е една от най-разпространените ДНК лезии в резултат на оксидативен стрес и е биомаркер за оксидативно увреждане и възстановяване на ДНК. Както показва Фигура 1B, съдържанието на 8-OHdG в пречистени митохондрии от AC-16 клетки се открива, резултатите показват, че нивото на 8-OHdG в митохондриите от ISO третирани клетки драматично се е увеличило, но промяната беше обърната с 50 μM ECH. Трето, ECH е ефективен за защита на MMP, който е нарушен от ISO. Интензитетът на флуоресценция е значително намален в клетките, третирани с ISO, в сравнение с Ctrl клетките, докато предварителната обработка с 50 μM ECH забележително намалява намаляването на MMP, както показва Фигура 1C. Четвърто, ECH предпазва от окислително увреждане на митохондриалния протеин в AC-16 клетки. Както показва фигура 1D, съдържанието на карбонилни протеини в митохондриите на клетките за третиране с ISO е значително увеличено и ECH отслабва ефекта. Пето, ECH също така инхибира митохондриалната липидна пероксидация в AC-16 клетки, индуцирана от ISO. Както показва Фигура 1E, нивото на липидните пероксиди в митохондриите на ISO клетки е очевидно по-високо от това в Ctrl клетките, докато това увеличение е значително намалено от 50 μM ECH предварителна обработка. В крайна сметка, ECH инхибира натрупването на вътреклетъчни ROS. Както показва фигура 1F, нивото на вътреклетъчната ROS в ISO клетките е значително повишено и е значително намалено в ECH предварително третирани клетки. Фигура 1G показва, че скоростта на апоптоза на AC-16 клетки е значително повишена след 24-часови инкубации с 10 μM ISO, в сравнение с Ctrl клетките, докато клетките преди третиране с 50 μM ECH значително намалява ISO-индуцираната апоптоза.

ФИГУРА 2 Сърдечна хипертрофия на HF плъхове, предизвикана от ISO, се облекчава и сърдечната функция се подобрява значително чрез лечение с ECH.

3.2|ECH обръща ремоделирането на миокарда и подобрява сърдечната функция на ISO-индуцирани HF плъхове

Както е показано на Фигура 2А, сърцата при HF плъхове са с очевидна хипертрофия и се обръщат чрез лечение с ECH. Както показват фигури 2B-D и L, ECH намалява HW/BW. Резултатите от ехокардиографията показват, че LVEF и LVFS са значително намалени в групата със СН, LVIDd, LVIDs и IVSTd са значително повишени в групата със СН. Въпреки това, ECH значително намалява LVIDd, LVIDs, IVSTd и подобрява LVEF и LVFS, няма значителна разлика в HR между трите групи, LVPWTd е увеличен при HF, но няма разлика между ECH и Ctrl или между ECH и HF, всички като Фигура 2E-K показва. Резултатите от оцветяването с HE показват, че миокардната хипертрофия, подреденото разстройство или дегенеративната некроза, възпалителната клетъчна инфилтрация и интерстициалната хиперемия и оток при HF плъхове, и ECH значително облекчава тези увреждания, миокардната хипертрофия и подреденото разстройство се облекчават, дегенеративната некроза и възпалителният инфилтрат са намалени, както е показано на Фигура 3А. Площта на напречното сечение на кардиомиоцита се измерва, тя е значително увеличена след ISO и е намалена в групата, третирана с ECH, както показва Фигура 3E. Оценките на отлагането на колаген чрез оцветяване по Masson разкриват, че съдържанието на колаген в лявата камера при HF плъхове се увеличава очевидно и очевидно намалява след лечение с ECH, което очевидно намалява CVF. PCR анализът в реално време разкрива, че транскриптите на проколаген тип Ⅰ са регулирани нагоре при ISO плъхове и понижени при ECH плъхове, тези резултати са в съответствие един с друг, както показват фигури 3B и FG, данните показват, че ECH ефективно намалява отлагането на колаген . Броят на TUNEL-позитивните клетки в кардиомиоцитите е значително увеличен при HF плъхове в сравнение с Ctrl, ECH значително намалява апоптозата на миокардните клетки и Фигура 3C-D показва представителното изображение на TUNEL-позитивни клетки съответно в полета с ниска и висока мощност, и Фигура 3H показва степента на апоптоза на миокардните клетки. Тези резултати показват, че ECH ефективно обръща миокардната хипертрофия, миокардната интерстициална фиброза и апоптозата и подобрява сърдечната функция при HF плъхове, индуцирани от ISO.

ФИГУРА 3 Резултатите от хистологичното оцветяване показват, че ECH обръща ремоделирането на лявата камера на HF плъхове, индуцирано от ISO.

3.3|ECH предпазва ултраструктурата на миокарда при HF плъхове

Резултатите от трансмисионни електронни микрографии показват, че увреждането на ултраструктурата на миокарда може да бъде отслабено от ECH, както е показано на Фигура 4A-B. Миофибрилите са вертикално подредени, структурата на саркомера е очевидна, миофиламентите са подредени спретнато и линията Z е ясна. Митохондриите са спретнато подредени и структурата е ясна при Ctrl плъхове. Въпреки това, миофибрилите са дезорганизирани, разкъсани и разтворени, структурата на саркомерите е размита, липса на линията Z, зоната на миокардна контракция е видима, броят и обемът на митохондриите са увеличени, митохондриите са с различни форми и размери, подредени безредно, структурата е неясна, подуване и фрагментация на криста, колапс или струпване и разтваряне във вакуола при HF плъхове. ECH очевидно отслабва тези промени, по-голямата част от влакната на сърдечния мускул са спретнато подредени и миокардните нишки са чисти, има линия Z, въпреки че е очевидно известно разтваряне на нишките, структурата на саркомера е ясна, плътността на митохондриите е намалена, формите и размерите са облекчени, подредени по-спретнато, набъбването на митохондриите и фрагментацията на кристалите, колапсът или струпването и вакуолизацията са очевидно намалени от ECH в сравнение със HF. Подуването на митохондриите и фрагментацията на криста, колапс или струпване и частична вакуолизация се идентифицират като митохондриална дегенерация. Резултатите показват, че ECH ефективно защитава ултраструктурата на миокарда и особено защитава митохондриалната морфология при HF плъхове, както показва Фигура 4C-F.

ФИГУРА 4 ECH защитава ултраструктурата на кардиомиоцитите и митохондриалната морфология на HF плъхове, индуцирани от ISO.

3.4|ECH регулира нагоре протеиновата експресия на SIRT1, FOXO3a и MnSOD

Анализът Western Blot показва, че нивото на протеинова експресия на SIRT1, FOXO3a и MnSOD е значително понижено при HF плъхове, но ECH очевидно регулира нагоре намалената протеинова експресия. Представителните протеинови ленти на резултатите от имуноблотинг и статистически анализ са показани на Фигура 5. Част от данните показва, че ECH повишава протеиновата експресия на SIRT1, FOXO3a и MnSOD.

3.5|ECH инхибира митохондриалния оксидативен стрес в миокардната тъкан на лявата камера

В тази част се измерват митохондриалните ROS, MMP, окислителното увреждане на митохондриалната ДНК, съдържанието на карбонилни протеини и нивото на липидна пероксидация в митохондриите в левокамерна миокардна тъкан на плъхове и резултатите са в съответствие с клетъчни експерименти, т.е. ECH намалява митохондриалната ROS, защитава MMP, облекчава степента на увреждане на mtDNA, намалява съдържанието на карбонилни протеини и липидната пероксидация в митохондриите, както е показано на Фигура 6.

ФИГУРА 5 ECH регулира нагоре нивото на протеинова експресия на SIRT1, FOXO3a и MnSOD, което се регулира надолу при HF плъхове.

4|ДИСКУСИЯ

Това проучване демонстрира, че ECH упражнява ефективна роля в превенцията на ремоделиране на миокарда и подобряване на сърдечната функция чрез регулиране нагоре на сигналната ос SIRT1/FOXO3a/MnSOD и инхибиране на митохондриалния оксидативен стрес.

Митохондриите са основното място за генериране на ROS като страничен продукт на окислителното фосфорилиране, поради тяхната близост до ROS, митохондриалните протеини, липидите и mtDNA се смятат за първични цели на окислително увреждане след прекомерно излъчване на митохондриални ROS,34,35 това увреждане стимулира по-нататъшното производство на ROS, порочният кръг продължава, ROS и оксидативният стрес могат да доведат до хипертрофия на миокарда, апоптоза, интерстициална фиброза и HF чрез активиране на множество сигнални пътища. стресът е ефективен за предотвратяване на ремоделиране на миокарда. ECH е естествен фенилетаноиден гликозид, компонент на традиционната китайска билка Cistanche tubulosa. той е широко проучен и е доказано, че притежава видове фармакологични дейности през последните години, като анти-тумор, анти-апоптоза, против стареене, невропротективно действие и т.н. Проучванията са доказали, че фармакологичните действия на ECH зависят главно от неговото свойство на антиоксидантна и противовъзпалителна активност, 18, 21 и ECH намалява митохондриалната ROS и защитава функцията на митохондриите срещу окислително увреждане в нервните клетки. 20, 22 Тук първо показахме, че ECH намалява митохондриалната ROS на кардиомиоцитите, следователно подобрява MMP, намалява окислителното увреждане на mtDNA, протеина и липидите, ефективно инхибира митохондриалното окислително увреждане и намалява апоптозата in vitro и in vivo, така че обръща миокардното ремоделиране и подобрява сърдечната функция. Това означава, че ECH е потенциално ново лекарство за превенция на миокардно ремоделиране и СН.

При нормални условия митохондриалната ROS се изчиства главно от MnSOD, който се разпределя в митохондриите и предпазва от митохондриално окислително увреждане. Ang II значително намалява експресията на MnSOD на кардиомиоцитите и индуцира миокардна хипертрофия, но ресвератролът може да увеличи експресията на MnSOD и да инхибира миокардната хипертрофия, индуцирана от Ang II.36 При СН активността на MnSOD е значително намалена и генерирането на митохондриална ROS е повишено .37,38 При сърдечно-специфични MnSOD генни нокаут мишки, митохондриалната ROS не може да бъде изчистена и ROS се увеличава в кардиомиоцитите, което води до митохондриална дисфункция и прогресивно сърдечно уголемяване, което в крайна сметка води до сърдечна недостатъчност.39 В настоящото проучване ние потвърждаваме че експресията на MnSOD е значително намалена, което се отслабва чрез ECH лечение и по този начин митохондриалната ROS се намалява и митохондриалният оксидативен стрес се инхибира. Това означава, че ECH предпазва кардиомиоцитите от окислително увреждане чрез регулиране нагоре на експресията на MnSOD, ние допълнително изследваме молекулярните механизми, лежащи в основата на тези ефекти.

Експресията на MnSOD се регулира от FOXO3a, който е транскрипционен фактор и се свързва в областта на генния промотор на MnSOD и води до насърчаване на генна транскрипция. 40 SIRT1 е молекула нагоре по веригата на FOXO3a и може да активира FOXO3a чрез деацетилиране. Сигналната ос SIRT1/FOXO3a/MnSOD играе централна роля в защитата срещу оксидативен стрес във видове клетъчни типове, активирането на сигналната ос от естрадиол инхибира оксидативния стрес и упражнява сърдечна защита24; Активирането на сигналната ос от ресвератрол инхибира индуцираната от оксидативен стрес клетъчна смърт40; В противен случай, ангиотензин II инхибира SIRT1/FoxO3a/MnSOD пътя и индуцира митохондриален оксидативен стрес, увреждане на mtDNA в остеобластите,41 тип 5 аденилил циклаза увеличава оксидативния стрес чрез инхибиране на експресията на MnSOD чрез Sirt1/FoxO3a пътя.42 Настоящото проучване установява, че експресията на SIRT1, FoxO3a и MnSOD са значително намалени при HF плъхове и митохондриалната ROS е повишена и оксидативният стрес е повишен, но промените се обръщат от ECH. Ново изследване показва, че ECH директно свързва SIRT1 като лиганд и образува комплекс с 9 ковалентни връзки и регулира нагоре експресията на SIRT1 в нервните клетки.26 В съответствие с това проучване, настоящото проучване показва, че ECH също така регулира нагоре експресията на SIRT1 в кардиомиоцитите, след това регулира нагоре генната експресия на MnSOD чрез FoxO3a и инхибира митохондриалната ROS и оксидативния стрес.

Дългосрочната хронична исхемия може да причини хибернация на миокарда, тези хиберниращи миокардни клетки обикновено показват загуба на контрактилни нишки, има излишък от гликогенови гранули в цитозола, саркоплазмения ретикулум и напречните тубули са загубени,43 също има аномалии в размера и формата на митохондриите , реактивна хипертрофия на миокарда и интерстициална фиброза, които са вторични от загубата на миоцити.44 Ние също наблюдавахме горните промени при HF плъхове в нашето проучване, докато ECH значително облекчава тези промени, тъй като последното проучване съобщава, че възстановяването на сърдечната функция след исхемичен стрес може да бъде характеристика на миокардна хибернация,45 нивото на миокарден гликоген също се измерва, резултатите показват, че няма значителна разлика между трите групи, както е показано на фигура 7J.

Предишното проучване също откри хибернация на миокарда в модел на прасе с неисхемична сърдечна недостатъчност чрез пейсиране на свободната стена на LV с висока честота,46 тъй като микроваскуларната обструкция играе важна роля в хибернацията на миокарда и произтичащата от това контрактилна дисфункция и това значително се подобрява, когато микроваскуларната обструкция се обръща от лекарство.47 Понастоящем някои проучвания стигат до заключението, че реваскуларизационната терапия е ефективна при хиберниране на миокарда,43 чрез използване на HE и Masson оцветяване, ние наблюдаваме, че миокардната капилярна и артериоларна плътност са намалени очевидно при HF плъхове и са значително облекчени от ECH, както е показано на фигура 7A-H. Предишни проучвания показват, че други естествени съединения, като бета-глюкан от ечемик, упражняват кардиопротективни ефекти чрез увеличаване на експресията на MnSOD, 48, 49, и повишаването на MnSOD е свързано с повишената капилярна плътност на миокарда и експресията на VEGF. Извършихме RT-PCR, за да открием експресията на VEGF, данните са в съответствие с находката от хистологично оцветяване, което означава, че ECH може да насърчи ангиогенезата и да увеличи миокардната капилярна плътност чрез регулиране на експресията на VEGF, както е показано на Фигура 7I. Настоящото проучване установява, че ECH може да защити и увеличи капилярите и артериолите на миокарда чрез регулиране нагоре SIRTI/FOXO3a/MnSOD пътя и експресията на VEGF, като по този начин потиска хиберниращия миокард и допринася за подобряване на сърдечната функция.

Cistanche допринасяда сеподобряване на работата на сърцето.

За повече информация, моля, щракнете тук.

Трябва да се отбележи, че апоптозата на кардиомиоцитите е добре известна като важна патологична промяна при сърдечна недостатъчност и настоящото проучване наистина потвърждава, че голямо количество апоптотични клетки при HF плъхове и ECH значително намалява апоптозата чрез регулиране на SIRTI/FOXO3a/MnSOD пътя и инхибиране на митохондриален оксидативен стрес, както е споменато по-горе.

Преди всичко, ECH обръща ремоделирането на миокарда и подобрява сърдечната функция чрез регулиране нагоре по сигналната ос SIRT1/FoxO3a/MnSOD, като по този начин инхибира митохондриалния оксидативен стрес и намалява миокарда в хибернация. По този начин се предполага, че ECH е потенциално лекарство за превенция или лечение на миокардно ремоделиране и HF.