Cistanche: Echinacoside потиска клетъчния растеж на аденокарцинома на панкреаса чрез индуциране на апоптоза чрез пътя на митоген-активираната протеин киназа

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG и XINFENG LI

Резюме.

Клиничното приложение на естествени продукти, извлечени от традиционната китайска медицина, привлече вниманието при химиотерапията на рака.Ехинакозид(ECH), един от фенилетаноидите, изолиран от стъблата наЦистанче(китайско билково лекарство) има тъканопротективен и антиапоптотичен ефект върху централната нервна система. Въпреки това остава до голяма степен неуловимо дали ECH притежава тумор-супресивна активност. В настоящото изследване беше демонстрирано, че ECH може значително да инхибира пролиферацията на клетки от аденокарцином на панкреаса чрез индуциране на производството на реактивни кислородни видове и смущението на потенциала на митохондриалната мембрана и по този начин задейства апоптоза. Освен това беше изяснено, че ECH(Ехинакозид)потиска растежа на туморните клетки чрез модулиране на MAPK активността. В заключение, това проучване разкрива нова функция на ECH (Ехинакозид) за предотвратяване на развитието на рак и предполага, че използването на ECH може да бъде потенциална химиотерапевтична стратегия за рак.

Въведение

Пътят на p53 туморния супресор чрез индуцирането на туморния супресор, ARF смекчава онкогенната Е3-лигаза миша двойна минута (MDM)2-медиирана деградация на p53 (3). Това е авторегулиран, самозащитен механизъм, който предпазва клетките от злокачествена трансформация. Трябва да се отбележи, че p53 може да потисне Myc активността чрез транскрипционно активиране, например, miR-145, който е насоченMycиРНК за заглушаване на транслацията (4, 5), като по този начин се образува регулаторна верига с отрицателна обратна връзка.

Най-простата и ефективна стратегия за лечение на рак е убиването на раковите клетки. Доказано е, че често използваните противоракови лекарства, като цисплатин (6), актиномицин D (7) и адриамицин (8), инхибират туморния растеж чрез насърчаване на апоптозата. Напоследък все повече доказателства показват, че редица природни продукти и производни от растения, особено от лечебни растения, използвани в традиционната китайска медицина (TCM), проявяват тумор-супресивна функция чрез индуциране на апоптоза на ракови клетки и имат потенциал за клинично приложение при лечение на рак (9). Например, естественият антрахинон емодин се изолира от множество видове ракови клетки (10,11). Камптотецин, произлизащ от китайското „щастливо дърво“,Камптотека заострен, е ценен естествен продукт, който инхибира лигирането на ДНК след топо I-медиирани прекъсвания на вериги (12). В друго ретроспективно популационно кохортно проучване на общо 729 пациенти с напреднал рак на гърдата се предполага, че TCM терапията може да допринесе за лечението на рак. От тази кохорта 115 пациенти са били потребители на TCM, докато 614 пациенти не са използвали TCM. Многовариантният анализ показа, че в сравнение с неупотребяващите, употребата на TCM е свързана със значително намален риск от смъртност по всякаква причина (13). Всички гореспоменати констатации показват, че TCM е важна допълнителна и алтернативна медицина, която може да се използва при лечението на рак.

мишки с остро белодробно увреждане (16,17). Също така, ECH(Ехинакозид)е доказано, че има защитни ефекти върху нервната тъкан и подобрява поведенческите разстройства при миши модели на болестта на Паркинсон (18). Трябва да се отбележи, че е установено, че ECH насърчава клетъчната пролиферация и инхибира апоптозата в миши чревни епителни MODE-K клетки (19). Досега обаче се обръща по-малко внимание на потенциалната роля на ECH в превенцията на рака.

В това проучване беше проучено дали лечението с ECH засяга растежа и пролиферацията на туморни клетки и дали ECH(Ехинакозид)индуцира апоптоза, повишава производството на реактивни кислородни видове (ROS) и намалява потенциала на митохондриалната мембрана (MMP) и следователно потиска растежа на туморните клетки. Освен това, настоящото изследване имаше за цел да идентифицира молекулярните механизми, отговорни за ECH-медиираното инхибиране на клетъчния растеж.

Материали и методи

клетка линия, реактив, и антитела.SW1990 панкреатични аденокарциномни клетки (ATCC, Манасас, Вирджиния, САЩ) се култивират в модифицирана на Dulbecco среда Eagle, допълнена с 10 процента фетален говежди серум, 50 U/ml пеницилин и 0,1 mg/ml стрептомицин при 37˚C в 5 процента CO2 овлажнена атмосфера. ECH(Ехинакозид)е закупен от Jrdun Biotechnology Corp. (Шанхай, Китай). Антитела срещу AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 и GAPDH бяха закупени от Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); анти-Bax и анти-Bcl-2 са закупени от Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA); и anti-Caspase-3 е закупен от Abcam (Шанхай, Китай).

клетка жизнеспособностанализ. За да се оцени скоростта на растеж на туморни клетки, беше използван комплект за броене на клетки{{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Клетъчните суспензии се посяват при 5 000 клетки на ямка с ECH третиране за 0, 12, 24, 48 или 72 часа в 96 -плаки за култура на ямки. Инхибирането на клетъчния растеж се определя чрез добавяне на реагент WST-8 от комплекта CCK-8 при крайна концентрация от 10 процента към всяка ямка и абсорбцията на пробите се измерва при 450 nm с помощта на четец на микроплаки (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, САЩ).

Hoechst 33342 оцветяване.Клетките (60 процента сливане) бяха третирани с Hoechst 33342 (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Китай) при крайна концентрация от 1µg/ml, инкубират се в инкубатор при 37˚C за 15 минути, промиват се с фосфатно буфериран физиологичен разтвор два пъти, фиксират се в 4 процента параформалдехид за 30 минути при стайна температура и се монтират върху предметни стъкла. Морфологичните промени на клетъчните ядра се наблюдават под флуоресцентен микроскоп (Olympus BX51, Melville, NY, USA). Нормалните ядра бяха кръгли и оцветени в светло синьо, докато апоптотичните ядра бяха свити и оцветени в ярко синьо.

Активирана флуоресценция клетка сортиране (FACS) анализи.За оценка на апоптозата се използва флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-Анексин V комплект за откриване на апоптоза (BD Biosciences, Шанхай, Китай) съгласно инструкциите на производителя. Накратко, 5x104 клетки се промиват с ледено студен PBS, ресуспендират се в 0,1 ml свързващ буфер (Beyotime Institute of Biotechnology) и се оцветяват с 10 ml FITC-конюгиран Анексин V (10 mg/ml) и 10 ml пропидиев йодид (PI) (50 mg/ml). След инкубиране в продължение на 15 минути при стайна температура на тъмно и добавяне на 400 ml свързващ буфер, клетките се анализират с поточен цитометър (C6; BD Biosciences, Шанхай, Китай).

Измерване на реактивен кислород видове (ROS).За да се оцени производството на ROS, беше използван комплектът за анализ на реактивни кислородни видове (Vigorous Biotechnology, Пекин, Китай) съгласно инструкциите на производителя. Накратко, клетки (80 процента сливане) бяха събрани и промити с PBS преди оцветяване с разтвор на дихидроетидий (DHE) (Beyotime Institute of Biotechnology). След това клетките се анализират чрез поточен цитометричен анализ.

Измерване на митохондриална мембрана потенциал (ММР).

Тетраметилродамин метил естер (TMRM) Комплект за анализ (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, САЩ) беше използван за откриване на промените в ММР. Накратко, клетките (80 процента сливане) се събират, промиват се с PBS и се оцветяват с TMRM за 15-20 минути в инкубатор при 37°C. След това клетките се промиват веднъж с PBS и се подлагат на поточни цитометрични анализи.

Имуноблотинганализи. Клетките (80 процента сливане) бяха събрани и лизирани в RIPA буфер (Jrdun Biotechnology), състоящ се от 50 mM Tris-HCl, рН 7.4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 процент NP‑40, 1 процент натриева дезоксихолова киселина и 0,1 процента SDS и прясно добавени протеазомни инхибитори. Равни количества прозрачен клетъчен лизат бяха използвани за имуноблотинг анализ, както е описано по-горе (20).

Статистически анализ.Количествените данни са изразени като средна стойност ± стандартно отклонение. Статистическите разлики бяха оценени чрез несдвоен t-тест на Student с помощта на статистически софтуер SPSS 15.0. П<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Резултати

ECH (Ехинакозид)потиска тумор клеткарастеж. Въпреки че се съобщава, че ECH(Ехинакозид)проявява защитна роля чрез инхибиране на апоптоза и възпалителни сигнали в соматични клетки, като невронни и чревни епителни клетки (16-19), остава неуловимо дали ECH контролира растежа и пролиферацията на ракови клетки. За да се тества това, беше проведен тест за клетъчно оцеляване чрез третиране на SW1990 клетки, получени от степен II на панкреатичен аденокарцином, с титрирани дози ECH, както е показано на Фиг. 1. По-специално, беше демонстрирано, че ECH значително забавя пролиферацията на туморни клетки в доза -зависим начин по време на 5-дневен период на култивиране (фиг. 1).ECH задействаапоптоза. Тъй като загубата на апоптоза е един от основните причинни механизми, лежащи в основата на неконтролираната пролиферация на ракови клетки на панкреаса (21), настоящото проучване извърши набор от експерименти, за да определи дали ECH предизвиква апоптоза. Първо, чрез оцветяване на ядрата на туморните клетки с Hoechst 33342, беше демонстрирано, че ECH води до апоптоза по дозозависим начин (фиг. 2A). Освен това, FACS анализите бяха проведени с помощта на оцветяване с Анексин V/PI за по-нататъшно потвърждаване на апоптотичния ефект на ty ECH (Фигура 2В). Средният процент на апоптотичните клетки беше 1,1 процента при нормални условия на култура, докато този процент значително се увеличи до 10,6, 21,4 и 51,3 процента в отговор на лечението с ECH по дозозависим начин (фиг. 2C). Тези резултати, заедно с анализа на клетъчната жизнеспособност, показан на Фиг. 1, показват, че лечението с ECH потиска пролиферацията на туморни клетки чрез задействане на апоптоза.

генерира етидий, който се интеркалира с ДНК, е използван в това проучване за оценка на производството на ROS. Установено е, че подобно на други противоракови лекарства, ECH също стимулира производството на ROS по дозозависим начин, както се вижда от повишения интензитет на флуоресценция при лечение с ECH (фиг. 3).

ECH (Ехинакозид)намалява MMP.Доказано е, че митохондриалната дисфункция е замесена в индуцирането на апоптоза. Доказано е, че отварянето на преходните пори на митохондриалната пропускливост предизвиква деполяризация на трансмембранния потенциал и освобождаване на проапоптотични фактори (23). Следователно беше тествано дали ECH може да индуцира загуба на ММР в туморни клетки чрез извършване на TMRM анализ, който е добре установен подход, тъй като интензитетът на TMRM флуоресценцията е пропорционален на мембранния потенциал. Беше демонстрирано, че лечението с ECH значително намалява ММР в зависимост от дозата (фиг. 4).ECH контроли тумор клетка растеж чрез митоген-активиран протеинмолекулярната основа на ECH-медиирана смърт на туморни клетки, беше изследвана активността на няколко жизненоважни сигнални пътища, като MAPK и AKT (24, 25), които контролират клетъчното оцеляване и смърт. MAPKs са еволюционно запазени, пролин-насочени Ser/Thr протеин кинази, включително извънклетъчни сигнално-регулирани кинази (ERKs), c-Jun NH2-терминална киназа (JNKs) и членове на семейството p38, които се активират чрез три- сигнални каскади на ниво киназа (26,27). В това проучване беше оценена експресията на MAPKs и AKT, както и техните активирани фосфорилирани форми и беше разкрито, че ECH значително потиска активността на JNK и ERK1/2, но повишава активността на р38 (фиг. 5). Трябва да се отбележи, че беше доказано, че активността на AKT, която също е критично важна за клетъчната пролиферация, не се влияе от лечението с ECH (фиг. 5). Освен това беше показано, че лечението с ECH повишава експресията на Bax и Caspase-3, като същевременно намалява експресията на Bcl-2 (Фиг. 5), което е в съответствие с Фиг. 2. По този начин резултатите показват, че ECH предизвиква апоптоза на туморни клетки чрез MAPK пътя.

Дискусия

Доколкото ни е известно, това е първото проучване, което показва, че ECH има тумор-супресивна функция чрез задействане на апоптоза (фиг. 2), насърчаване на производството на ROS (фиг. 3) и индуциране на деполяризация на потенциала на митохондриалната мембрана (фиг. 4) , което впоследствие води до инхибиране на растежа на туморни клетки (фиг. 1). Освен това е показано, че молекулярната основа на ECH-медиираната смърт на туморни клетки възниква чрез регулиране на MAPK сигналните пътища (фиг. 5). Тези открития демонстрират нова функция на ECH за предотвратяване на туморогенезата и по този начин предполагат, че той може да бъде кандидат агент за терапия на рак.

Повечето противоракови лекарства могат да индуцират апоптоза на туморни клетки, стареене и/или спиране на клетъчния цикъл, което води до инхибиране на растежа и пролиферацията на туморни клетки. Спирането на клетъчния цикъл е клетъчен отговор на леки стрес сигнали, които позволяват на клетките да възстановят увредената ДНК преди започване на репликативна ДНК синтеза или митоза, докато апоптозата и стареенето (постоянно спиране на клетъчния цикъл) възникват в отговор на стрес сигнали, които елиминират непоправими или злокачествени клетки ( 28,29). Следователно, само апоптотичният ефект на ECH върху туморните клетки беше оценен в това проучване, тъй като убиването на ракови клетки е основен критерий за оценка на ефикасността на противораково средство. Трябва да се отбележи, че беше доказано, че ECH индуцира експресията наБакс(Фиг. 5), проапоптотичен ген, транскрипционно активиран от туморния супресор p53 (30). Следователно, струва си да се тества дали ECH може да активира сигналния път на p53. Ако е така, ECH може също да бъде в състояние да предизвика p53-зависимо спиране на клетъчния цикъл, стареене, апоптоза или автофагия. В това проучване беше изяснена тумор-супресивната функция на ECH в клетъчната линия на аденокарцином на панкреаса SW1990. Необходими са обаче допълнителни проучвания, наблюдаващи повече клетъчни линии на рак на панкреаса. Доказано е, че мутациите в онкогенния протеин RAS и туморния супресор p53 са свързани с развитието на рак на панкреаса (31); въпреки това, клетъчната линия SW1990 не съдържа никаква p53 мутация, според базата данни на IARC p53 (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Следователно е важно да се проучи дали ECH може да повлияе на растежа и пролиферацията на други клетъчни линии на рак на панкреаса с различни мутации на p53. Освен това би било интересно да се определи дали ECH е в състояние да насърчи апоптозата и да инхибира растежа на други видове тумори.

Повишаването на ROS и намаляването на MMP, които са причинени от лечението с ECH, са показали, че са от съществено значение за индуцирането на апоптоза (22). В допълнение, установено е, че ROS може да индуцира окисляването на митохондриалните пори, допринасяйки за освобождаването на цитохромc, междинен продукт в апоптозата, поради разрушаване на ММР (22). По този начин остава да се определи дали ECH разрушава ММР индиректно чрез индукция на ROS. Освен това е доказано, че предизвиканият от ROS оксидативен стрес участва в модулирането на безброй сигнали за контролиране на клетъчния растеж, включително p53, NF-κB, HIFs и PI3K (32). Остава да се определи дали и, ако е така, как ECH регулира тези важни сигнални пътища. Трябва да се отбележи, че оксидативният стрес причинява различни невродегенеративни заболявания поради високата консумация на кислород, слабите антиоксидантни системи и характеристиките на терминална диференциация на централната нервна система (33). Въпреки това, няколко проучвания показват, че ECH има защитни и антиапоптотични ефекти върху нервната тъкан. В това отношение е разумно да се предположи, че ECH може да намали производството на ROS в крайно-диференцираните невронни клетки. Следователно, също остава да се определи дали регулирането на производството на ROS от ECH зависи от състоянието на клетъчна диференциация. Следователно, настоящите резултати заедно с други проучвания разкриват, че ECH, широко използваният TCM, може да бъде важна химиотерапевтична стратегия не само за лечение на невродегенеративни заболявания, но също и на злокачествени карциноми.

Напоследък използването на ТКМ в терапията на рака привлича все повече внимание. Потенциалът на естествените продукти от лечебни растения, използвани в TCM, е признат от научната общност дори в западния свят (9). Необходими са усилия за изясняване на основните механизми на действие на тези природни продукти, което в крайна сметка може да доведе до разработването на ефективни и безопасни лекарства за лечение на рак.

В заключение, настоящото проучване демонстрира туморната инхибиторна функция на ECH и също така разработва молекулярната основа на ECH-медиираната туморна супресия, като по този начин предполага потенциалното клинично приложение на ECH в терапията на рак.

Благодарности

Това проучване е финансирано и подкрепено от Ключовата програма за научни изследвания на FMU (грант № 09ZD014). Авторите биха искали да благодарят на Biomedworld (Шанхай, Китай) за помощ при редактирането на ръкописа.

Препратки

1. Hanahan D и Weinberg RA: Белези на рака: следващото поколение. Клетка 144: 646-674, 2011 г.

2. Alderton GK: Транскрипция: транскрипционните ефекти на MYC. Nat Rev Cancer 14: 513, 2014 г.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ и Roussel MF: Myc сигнализиране чрез ARF туморен супресор регулира p53-зависимата апоптоза и обезсмъртяване. Genes Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K и Mo YY: p53 потиска c-Myc чрез индукция на туморния супресор miR-145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X и ​​Lu H: Нови прозрения за функциите на p53 чрез неговите целеви микроРНК. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014 г.

6. Zamble DB и Lippard SJ: Цисплатин и възстановяване на ДНК при химиотерапия на рак. Trends Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H и Korc M: Actinomycin D индуцира апоптоза и инхибира растежа на раковите клетки на панкреаса. Int J Cancer 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P и Dass CR: Doxorubicin: Актуализация на противораковото молекулярно действие, токсичността и новите системи за доставяне на лекарства. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013 г.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS и Kaina B: От традиционната китайска медицина до рационалната терапия на рака. Тенденции Mol Med 13: 353-361, 2007 г.