Ефект на екстракти от Cistanche Tubulosa върху мъжката репродуктивна функция при индуцирани от стрептозотоцин-никотинамид диабетни плъхове

Ключови думи:диабет; безплодие;Cistanche tubulosaекстракт(CTE);ехинакозид(ECH);противовъзпалителнодейност;антиоксидантдейност;стероидогенезаефекти

За повече информация относно предимствата на прахообразния екстракт от цистанче

1. Въведение

Захарният диабет (ЗД) е състояние, при което има повишени нива на глюкоза в кръвта порадидо неефективността на панкреаса да произвежда достатъчно инсулин или неспособността на тялото да го използваефективно. Според СЗО броят на хората с диабет е нараснал от 108 милиона през 1980 гдо 422 милиона през 2014 г. [1]. Има четири основни категории: преддиабет (етап преди диабет), тип 1(при което панкреасът не успява да произвежда инсулин), тип 2 (тялото не успява да използва инсулин) и гестационендиабет (който се появява по време на бременност). Оксидативният стрес възниква поради дисбаланса междупроизводство на реактивни кислородни видове (ROS) и антиоксиданти [2] накрая води до диабетно състояние.Усложненията на диабета включват бъбречна недостатъчност, увреждане на нервите, слепота, инсулт, сърдеченатака, смърт на плода и безплодие. [1]. Проучванията показват, че ядрата на спермата, дезоксирибонуклеиновата киселина (ДНК),и митохондриите са значително увредени при мъже с диабет [3]. Оксидативен стрес по време натранспортирането на сперма ще промени процеса на мъжката репродуктивна система [4,5]. 

Процесът на сперматогенеза се контролира от хипоталамус-хипофиза-гонада (HPG)ос. Гонадотропин-освобождаващият хормон (GnRH), произвеждан от хипоталамуса, стимулирапроизводство на лутеинизиращ хормон (LH) и фоликулостимулиращ хормон (FSH). Откриват се клетки на Лайдигв съседство със семенните тубули и произвеждат тестостерон под контрола на LH. FSH задействапроизводството на антиген-свързващ протеин (ABP), който помага за преминаването на мъжкия хормон. Следователно, безплодиеи други проблеми възникват главно поради смущенията, които възникват в HPG оста. Администрация накомбинацията от стрептозотоцин-никотинамид предизвиква диабет при опитни плъхове. Стрептозотоцине химично съединение, токсично за производството на инсулин клетки в панкреаса и никотинамидът е aводоразтворим витамин, който защитава на клетки от пълно увреждане [6]. Cistanche tubulosaе пустинен вид растение, известен също като "Rou Cong-Rong" [7]. Това енехлорофилно паразитно растение, което расте главно върху корена наCalotropis proceraдърво и ешироко разпространен в сухите земи на Гансу, Цинхай, Синцзян, Монголия, Иран и Индия. Общотоиме наCistanche tubulosaе "Пустинен хиацинт". Той е широко приет в китайската традиционна медицинаи му е дадено името „Женшенът на пустинята“. Той се използва широко в областта на медицината залечение на болестна левкорея, профузна метрорагия, хронични бъбречни заболявания, запек, импотентност ибезплодие. Химични съставки наCistanche tubulosaсе състои от нелетливи фенилетаноидни гликозиди(PHG), иридоиди, лигнани, летливи масла, алдитоли, олигозахариди и полизахариди [8]. Проучванияпоказват, че ехинакозидът от тази билка защитава увредените фибробласти чрез регулиране на нивата на ROS [9]. Това съединение произвежда антиоксидантни, вазорелаксиращи и противовъзпалителни дейности заедно сневропротекция и превенция на остеопороза [10,11]. Това проучване имаше за цел да проучи ефекта отCistanche tubulosaекстрактсъдържащи ECH нарепродуктивна дисфункция на индуциран от стрептозотоцин-никотинамид диабетен плъх.

2. Материали и методи

2.1. Материали

ECH и CTE бяха закупени от Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Тайван). Разширенокрайните продукти на гликиране (AGE) са закупени от Biovision (Сан Франциско, Калифорния, САЩ). LC-540и ТМЗ клетъчни линии са закупени от Института за изследване и развитие на хранителната промишленост(Хсинчу, Тайван). Петседмични мъжки плъхове Sprague-Dawley (SD) бяха закупени отНационален център за лабораторни животни (Тайпе, Тайван). Диета на фуражната лаборатория® е закупен от PMINutrition International, Inc. (Тайпе, Тайван). Получен е 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH)от Сигма (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Метанол и 4-(2-хидроксиетил)-1-пиперазинетансулфоновакиселина (HEPES) също са закупени от Sigma. Модифицираната среда на Dulbecco Eagle/F12 итрипсин-EDTA са получени от GIBCO (Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ). 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT), дихлоро-дихидро-флуоресцеин диацетат (DCFH-DA), диметилсулфоксид (DMSO) и нитросин тетразолий (NBT) са закупени от Sigma. Ензимна глюкозакомплекти са получени от Kyokutoseiyaku, Токио, Япония. Закупени са инсулинови ELISA комплектиот Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Упсала, Швеция). T-PER Екстракция на тъканен протеинРеагентът е получен от Thermo Scientifific (Чикаго, Илинойс, САЩ). Анти-човешко/мише/плъхово ядренофактор-капа B NF-κВ поликлоналните антитела са закупени от Santa Cruz Biotechnology, SantaКруз, Калифорния, САЩ. Рецептор против мишка/плъх за напреднали крайни продукти на гликиране (RAGE) поликлоналенантитела, анти-човешки/миши/плъхови StAR поликлонални антитела и анти-човешки/мишки/плъховиМоноклоналните антитела на цитохром P450 17A1 бяха закупени от Gene Tex (Ървайн, Калифорния, САЩ).Анти-човешки/миши/плъхови CYP11A1 поликлонални антитела са получени от клетъчно сигнализиранеТехнология (Бевърли, Пенсилвания, САЩ). Easy-Blue реагентът е закупен от Invitrogen, Thermo FisherScientific (Карлсбад, Калифорния, САЩ). Агароза и ДНК маркер 100 bp бяха получени от Promega,Corporation (Медисън, Уисконсин, САЩ). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit е закупен от QIAGEN,Хилден, Германия.

5 процента CO2 инкубатор (CO2 инкубатор, Napco 5410, Тайван). Клетъчната линия TM3 се култивира в Dulbecco'sмодифицирана среда на Eagle (DMEM), допълнена с глюкоза (4,5 g/L), натриев пируват (0.5 mM),L-глутамин (2,5 mM), натриев бикарбонат (1,2 g/L), 4-(2-хидроксиетил)-1-пиперазинетансулфоновакиселина (HEPES, 15 mM) и фетален телешки серум (FCS, 10 процента) или конски серум (5 процента) при 37◦C в 5 процентаCO2 инкубатор.

Определяне на клетъчната жизнеспособност на ехинакозид (ECH): 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-реагент дифенилтетразолиев бромид (МТТ) беше използван за анализ на клетъчната жизнеспособност. Клетъчната концентрациябеше коригирано на 2× 105клетки/ml в 96-ямкова плака. След това, 20µL ECH (разреден в 2 процента от средата)се добавя и се инкубира в продължение на 24 часа при 37°С◦C в 5 процента CO2 инкубатор. По-късно, 100µL от МТТ реагента бешедобавени и инкубирани в продължение на 4 часа при 37°С◦C при тъмни условия. Абсорбцията се измерва при 570 nm(ELISA четец, Dynatech MR5000, Kloten, Швейцария).Относителна клетъчна жизнеспособност (проценти)=[(Aпроба при 570 nm− Aпразно при 570 nm)]/[(Aконтрол на 570− Aпразно на 570)] × 100.

Анализ на съдържанието на реактивни кислородни видове (ROS):

Номерът на клетката беше коригиран2 × 105клетки/mLв 12-ямкова плака, съдържаща 2 процента FBS. След това, 50µL/mL ECH, RES и AGEsсе добавят към плаката и се инкубират при 37°С◦C за 24 часа. След 24 часа, 20 ,70 -дихлорофлуоресцеин-диацетат(DCFH-DA) се добавя и се инкубира при 37°С◦C за 30 минути. След центрофугиране (400× g, 5 минути),

и AGEs бяха добавени и инкубирани при 37◦C в 5 процента CO2 инкубатор за 24 часа. След 400µL от T-PERбяха добавени, изстъргани от клетките и центрофугирани при 125,000× g за 20 минути (4◦° С). Супернатантатае събрана и съхранявана в−80 ◦C (−80 ◦C фризер, Nuaire, Plymouth, MN, САЩ) за допълнителен анализ.

За количествено определяне на протеини беше използван комплект бицинхонинова киселина (BCA). След това, 10µL стандартен клетъчен разтвори 200µL BCA реагент бяха добавени към 8-ямковите плаки и инкубирани при 37°С◦C в 5 процента CO2 инкубаторза 30 мин. Абсорбцията се измерва при 562 nm. Извършен е анализ за идентифициране на протеиничрез електрофореза с натриев додецилсулфат (SDS)-полиакриламиден гел (SDS-PAGE). Пробите бяхаприготвен чрез добавяне на протеинов лизат към буфер за зареждане с протеин и беше извършен Western blot анализза откриване на специфични протеини.

2.2.2. In vivo анализ

Дизайн на животински модел: Шестдесет 4-седмични мъжки плъхове Sprague–Dawley (SD) бяха закупени отНационален център за лабораторни животни (Тайпе, Тайван). Всеки плъх се поставя индивидуално в дезинфектантклетки от неръждаема стомана при контролирана температура (23± 1 ◦C) и влажност (40–60 процента) с 12 часацикъл светлина/12 часа тъмно. Храна и вода бяха осигурени ad libitum. Всеки плъх е опитомен в първияседмица и дадена лабораторна диета за гризачи 5001 като основна диета. Всички процедури следваха стандартана Институционалния комитет за грижа и използване на животните (Одобрение на IACUC № 101026) на НационалнияТайвански океански университет, Тайван. След опитомяването плъховете са разделени на две групи: контролнатагрупа (Con), която е била хранена с лабораторна диета 5001, и групата с диабет, която е била хранена с диета с високо съдържание на мазнини(HFD, 40 процента) за целия експеримент. След хранене с HFD в продължение на 4 седмици, групата с диабетплъхове бяха инжектирани със стрептозотоцин (65 mg/kg) (STZ), за да предизвикат захарен диабет (DM). В рамките наСлед 15 минути инжектиране на STZ беше инжектиран никотинамид (230 mg/Kg телесно тегло). Седмица след инжектирането,беше проведен орален тест за глюкозен толеранс (OGTT), за да се определи успешното предизвикване на диабетМелитус (DM). След това животните бяха разделени на шест групи: контрола (хранени с лабораторна диета5001); DM група (DM плюс 45 процента HFD); DMR група (DM плюс розиглитазон: 0,571 mg/kg BW) плюс 45 процента HFD;DME1 група (DM плюс CTE: 80 mg/kg BW) плюс 45 процента HFD; DME2 група (DM плюс CTE: 160 mg/kg BW)плюс 45 процента HFD; и DME4 група (DM плюс CTE: 320 mg/kg BW) плюс 45 процента HFD. Розиглитазон (RSG) бешевзети като положителна контрола. Използвани са три дози CTE (80, 160 и 320 mg/kg) споредпрепоръката на Тайванската администрация по храните и лекарствата (TFDA) функционална здравословна хрананасоки за оценка. Третирането се извършва до края на експеримента. Всички опитни плъховебяха умъртвени след 6 седмици. Кръвта се събира от плъхове и се центрофугира при 3000 rpm за15 минути в 4◦C. Супернатантът се изследва за следния анализ:Обща глюкоза, триглицериди и холестерол

Решителност:

Определянето на глюкозата бешеизвършва се от глюкозни ензимни комплекти. След това, 20µL проби от кръвна плазма бяха добавени къмреагенти и се поддържа при 37◦C за 5 минути. Общите триглицериди и концентрацията на общ холестерол бяхаопределен чрез използване на ензимни комплекти за триглицериди и холестерол. След това, 10µL кръвна плазма бяхасе добавя към реагентите и експериментът се провежда съгласно инструкциите на производителя.Абсорбцията се измерва при 510 nm.Обща плазмена глюкоза/триглицериди/холестерол (mg/dL)=(Aпроба− AПразно)/(Aстандартен− AПразно) × 200. Проба: Абсорбция на кръвни проби, AПразно: Стойност на абсорбция на комплекти без проба, стандарт: Стойност на абсорбция на стандартния реагент, 200: стандартни реагенти при концентрация от200 mg/dL.Оценка на инсулин, лептин и хомеостатичен модел – определяне на инсулинова резистентност (HOMA-IR):Нивото на инсулин се определя с инсулинови ELISA комплекти. Тук, 25µL кръвна плазма бяха добавени къмреактиви и абсорбцията се измерва при 450 nm. Общото съдържание на лептин се определя чрез използване накомплект за имунометричен ензимен лептин. След това, 100µL от плазмата бяха анализирани и абсорбциятасе измерва при 450 nm с помощта на ELISA четец. Целият експеримент е проведен съгласноинструкциите на производителя. Стойността на HOMA-IR се определя от модела на хомеостазатауравнение за оценка=Плазмена концентрация на инсулин на гладно (mU/mL)× плазмена глюкоза на гладноконцентрации (mmol/L)/22,5.Плазмена липидна пероксидация: Тук 0.5 ml кръвна плазма се смесват с 1 ml реагент (15 процента,w/v трихлороцетна киселина в {{0}}.25 N солна киселина (HCl) и 0,375 процента,w/v тиобарбитурова киселина в0.25 N HCl) и се поставя във водна баня (Water Bath, BUCHI 461, Цюрих, Швейцария) при 100◦C за15 мин. След охлаждане се добавя 1 mL n-бутанол, разклаща се енергично и се центрофугира при 1500× g за 10 мин. Супернатантата се събира и абсорбцията се измерва при 532 nm [12]. Концентрация на малондиалдехид (MDA) (nM/mL)=[(Пробапри 532 nm− Aпразно при 532 nm)/ (Стандартенпри 532 nm− Aпразно при 532 nm)] × 5. Определяне на плазмените нива на тестостерон и лутеинизиращ хормон (LH): ТестостеронътИзползван е комплект ELISA за измерване на нивото на тестостерон в кръвната плазма. Използван е комплект RIAопределяне на концентрацията на LH. След това, 50µБяха добавени L плазма и изчисленията бяха базиранивърху концентрацията на хормона LH-RP-3 (стандарт). По-нататъшните стъпки бяха извършени споредкъм инструкциите на производителя.Определяне на тумор некрозис фактор (TNF)- и концентрация на интерлевкин-6 (IL-6):Уловеното антитяло се разрежда 250 пъти в покриващ буфер, добавя се към 96-ямкова плака (100µл/кладенец),и се поддържа на 4◦C за една нощ. Супернатантата се аспирира и се промива петнадесет пъти с промиванебуфер (1 път PBS, 0.05 процента Tween 20). След инкубиране (1 h) с 200µg разредител за анализ, клетките бяхапромива се 5 пъти с промивен буфер и 100µL TNF- стандартен разтвор или пробни пробидобавен към всяка ямка и инкубиран за 2 часа. След измиване 100µДобавени са L от IL-6 открити антителаи се инкубират за 1 час при стайна температура. Супернатантата се аспирира и се промива 5 пъти. Тогава,480 µL от ензима авидин-пероксидаза от хрян (HRP) се добавят и се инкубират за 30 минути при стайна температуратемпература. Супернатантата се аспирира и се промива пет пъти с промивен буфер. След това, 100µL от субстратния разтвор се добавят и се инкубират за 15 минути при стайна температура. По-късно, 50µL от стопразтвор (1М фосфорна киселина) се добавят към всяка ямка и абсорбцията се измерва при 450 nm.Анализ на параметрите на спермата и тестиситеВземане на сперматозоидни проби: Вземането на сперматозоидни проби се извършва съгласнометод, докладван по-рано в [13]. Спермата се събира от супернатанта и се използва задопълнителен анализ.Броят на сперматозоидите, подвижността на сперматозоидите и необичайните сперматозоиди: Броят на сперматозоидите бешеизчислено с помощта на хемоцитометър и разтвор на трипаново синьо. След това, 100µL сперматозоидна течност бяхасмесени с разтвор на трипаново синьо и броят на сперматозоидите, подвижността и анормалните сперматозоиди бяхаизчислено с помощта на хемоцитометър и микроскоп [14]. Нитро синьо Tetrazolium NBT Редукция и липидна пероксидация на сперматозоиди и тестиси: липидитепероксидация и редукция на NBT бяха анализирани съгласно същата процедура на плазмен анализ.

Определяне на супероксид дисмутаза (SOD) и каталазна активност: супероксид дисмутаза(SOD) активността се анализира с помощта на комплекта RANSEL. Тук 0.05 mL тестикуларни хомогенатисе добавят към 1,7 mL реакционен разтвор (0.05 mM ксантин, 0,025 mM 2-(4-йодофенил)-{{0}}(4-нитрофенол)-5-фенилтетразолиев хлорид (INT)). След смесване, 0,25 mL ксантин оксидаза (80 U/L)се добавя и реагира при стайна температура в продължение на 30 s при стайна температура. Абсорбцията бешеизмерено при 505 nm. Концентрацията на протеин в тестикуларния хомогенат се определя отБеше изчислен комплект за анализ на протеин Bio-Rad DC и неговата специфична активност (U/mg протеин). Каталазата(CAT) активността се определя съгласно докладван по-рано метод [15]. H&E (хематоксилин и еозин) оцветяванеТестисът се накисва в 10 процента формалин за 24 часа и се съхранява при 4◦C. Наряза кърпичките намикро размер и прикрепен към слайда. След фиксиране (95 процента метанол плюс 5 процента оцетна киселина), предметните стъкла бяхапотопени в хематоксилин за 3 минути, измити с течаща вода за 5 минути и след това ги накиснати с50 процента, 70 процента и 90 процента алкохол за една минута. След това предметните стъкла се оцветяват с еозин в продължение на 10 s инакиснат в 100% алкохол за една минута, докато избледнее. Накрая предметното стъкло се накисва в ксилен за едноминута. По-късно слайдът беше изсушен на въздух и запечатан. Оцветената тръба беше поставена в обърнат фазов контрастмикроскоп (микроскоп с обърната фазова разлика, Olympus CK-2, Токио, Япония) за наблюдениеморфологията.Анализ на хипоталамусаМишият KISS1, G-протеин свързан рецептор (GPR) 54, супресор на цитокиново сигнализиране 3 (SOCS-3)и сиртуин 1 (SIRT1)генните последователности са идентифицирани от NCBI (Национален център за биотехнологииИнформация) генна база данни и специфичен праймер е проектиран с помощта на Primer 5.0 PREMIER Biosoft,Пало Алто, Калифорния, САЩ). Праймерите, използвани в експеримента, са изброени в таблицата1.

Екстракция на рибонуклеинова киселина (РНК) от хипоталамуса. Извличането на РНК отхипоталамуса на мозъка се извършва с помощта на RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. ПолученотоиРНК се измерват количествено чрез обратна транскрипция (RT) и полимеразна верижна реакция(PCR). Комплиментната ДНК, получена от RT анализ, се съхранява при−20 ◦C за по-късна употреба.Екстрахираната ДНК се подлага на анализ на полимеразна верижна реакция (PCR) с използване на Taq полимераза.След това 5~10µL от PCR продукта бяха взети и анализирани чрез електрофореза върху 1.5 процента агарколоиден. Изображението е направено в UVP BioDoc-It система за изображения. Комплементарно с обратна транскрипциябеше взета дезоксирибонуклеинова киселина (cDNA) и беше извършен PCR с помощта на IQ SYBR Green SupermixКомплект. По-късно той беше анализиран с iQTM 5 Optical System Software. Протеините се екстрахират с помощта на aреагент за екстракция на протеин (T-PER). След това към 400 се добавят 20 mg тестикуларен хомогенатµL от T-PER и се центрофугира (високоскоростна центрофуга, Hettich CR-12, Tuttlingen, Германия) при 4◦C (125,000× g) за 20 мин. Следващият метод е подобен на "идентификация и количествено определяне".анализ на протеин" в in vitro анализ.2.3. Статистически анализЕксперименталните резултати бяха изразени като средна стойност± стандартно отклонение (Ср± SD) иданните бяха анализирани с помощта на софтуера Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk,Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ. Разликите между групите бяха анализирани чрез еднопосочен анализ надисперсия (ANOVA). Множество сравнения на различни групи бяха анализирани чрез теста на Дънкан пристойност наp < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3. Резултати

3.1. Ин витро анализ

3.1.1. Сравнение на антиоксидантните активности на ECH, CTE и RES

Дългосрочният висок оксидативен стрес и хроничното възпаление са основните причини за диабетусложнения [16]. CTE съдържат различни фенилетаноидни гликозиди като ехинакозид(ECH) и актеозид, с потенциал за антиоксидантна активност [17]. DPPH отстраняване на радикалибеше проведен анализ за оценка на антиоксидантната активност на ECH. Тролокс и ресвератрол(3,5,4'-трихидроксистилбен, RES) бяха взети съответно като стандарт и положителна контрола. Както е показанона фигура1, ECH показа по-добра активност за отстраняване на радикали и активността беше значително по-високаотколкото тази на положителната контрола (RES).

3.1.2. Клетъчна жизнеспособност на ECH върху LC-540 и TM3 Leydig клеткиИзвършва се МТТ анализ за оценка на клетъчната жизнеспособност на различни концентрации на ECH.LC-540 клетки на Лайдиг и TM3 клетки на Лайдиг показаха повече от 80 процента жизнеспособност след третиране сECH (Фигура2). В сравнение с другите концентрации, 100-µM концентрация (разреждания от 100µM в 2 процента FBS) на ECH показва по-добра клетъчна жизнеспособност в TM3 Leydig клетки. Резултатът показа, чеповишената концентрация на ECH не допринася за значителна токсичност за клетките.

3.1.3. Ефект на ECH върху AGE-индуцираното производство на супероксид чрез NBT анализ в LC-540 и TM3Лайдигова клетка

AGE причиняват окислително увреждане в тялото поради окисляването на глюкозата и образуването насвободни радикали като О2-, хидроксилни радикали и карбонилни групи [18]. След като се стимулира с50 µg/mL AGEs, LC-540 (Фигура3а) и TM3 (Фигура3b) клетките бяха третирани с ECH и RES(5 µМ и 10µM всеки). Резултатите показват, че производството на супероксиден анион е повишенов контролната група (стимулирани AGEs), но производството на супероксиден анион е намалено след товалечение с ECH и RES. От фигура3, беше разбрано, че ECH и RES намаляват нивотона производството на супероксид и предпазва клетките от окислително увреждане. В случай на клетки LC-540,10 µM ECH показва почти сходна активност с нормалната група. Производството на супероксид и в дветеклетки е намален с повишаване на концентрацията както на ECH, така и на RES.3.1.4. Ефект на ECH върху H2O2 Производство в AGE-стимулирани LC-540 клетки на ЛайдигБеше извършен DCFH-DA анализ за откриване на наличието на окислителни видове. След влизане вклетките, FL флуоресцентното багрило DCFH-DA се окислява от вътреклетъчния H2O2 и образува дихлорофлуоресцеин(DCF). Както е показано на фигура4, има значително увеличение на вътреклетъчния H2O2 производство вAGE-стимулирана група (контрола), докато добавянето на 10µM ECH и RES значително намалениХ2O2 производство в клетките. Администрация на 10µM ECH води до само около 47,1 процента от H2O2 продукция, значително по-ниска от контролната група.

3.1.5. Ефект на ECH върху RAGE и NF-κНива на експресия на B протеин в стимулирана от AGE LC-540Клетки на Лайдиг

Извършен е Western blot анализ, за ​​да се потвърди наличието на RAGE в LC-540 Leydigклетки. Ефектът на ECH върху RAGE (Фигура5а) и NF-κB (Фигура5б) нива на протеинова експресияв AGEs-стимулирани клетки на Лайдиг са показани на фигура5. Резултатите показаха, че 50µg/mLконцентрацията на AGE индуцира по-висок RAGE и NF-κB експресия в LC-540 клетки на Лайдиг и10 µM концентрацията на ECH и RES е намалила значително експресията на RAGE и NF-κB. Експресията на NF-κB е значително по-нисък в RES и ECH, отколкото RAGE антагонистите. И така, резултатитепотвърди, че ECH намалява нивото на възпаление чрез намаляване на нивото на RAGE и NF-κB.

.1.6. Ефект на ECH върху пътя на синтеза на тестостерон в AGE-стимулирани LC-540 клетки на Лайдиг.

Процесът на сперматогенеза и мъжкото безплодие зависи от наличието на тестостерон.Както е показано на фигура6, изразите на StAR (Фигура6a), CYP11A1 (Фигура6b), CYP17A1 (Фигура6c), и HSD17 3 (Фигура6г) протеините са значително намалени в AGE-стимулираната LC-540 Leydigклетки (контролна група). Експресиите на StAR, CYP11A1, CYP17A1 и HSD17 3 белтъка бяхазначително се повишава, когато се добавят RAGE антагонист, RES и ECH. Повишенатаекспресия на протеини StAR и CYP11A1 се наблюдава както в ECH-, така и в RES-третираните групи.Нивото на експресия на CYP17A1 е почти сходно в групите RES и ECH. Изразите наHSD17 3 протеин в третирани с ECH клетки на Leydig бяха много по-високи от тези на RES и RAGEтретирани с антагонисти клетки. Повишена експресия на StAR, CYP11A1, CYP17A1 и HSD17 3 белтъкапоказва нормалното производство на тестостерон.

5клетки/mL и третиране с RES и ECH(10µM) се прилага в продължение на 24 часа. -актинът беше взет като вътрешен контрол. Нормалната група (Nor)беше третирана със среда, а контролната група (Con) беше третирана с AGEs (50µg/mL).

Резултатибяха показани като средни±SD (n = 3). Значителни разлики (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">анализирани чрез многообхватния тест на Дънкан.