Ефекти на различни извлечени части от Cistanche Deserticola върху хипогликемичните ефекти на Db / Db черни мишки Ⅱ

2 Експериментални методи

2.1 Приготвяне на преработени продукти от Cistanche deserticola Cistanche deserticola:

Вземете лекарствени материали от Cistanche deserticola, измийте примесите, запарете в съд при нормално налягане за 2 часа, нарежете на 6 mm и изсушете на 70 градуса. Cistanche deserticola: Вземете парченца отвара от Cistanche deserticola, добавете подходящото количество оризово вино, разбъркайте добре, навлажнете за 8 часа (жълто оризово вино: вода=1:1), запарете под високо налягане за 4 часа и изсушете при 70 градуса. (Използвайте 30 ml оризово вино за всеки 100 g Cistanche deserticola).

НАТУРАЛЕН ОРГАНИЧЕН ЕКСТРАКТ ОТ ЦИСТАНША

Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/телефон:+86 15292862950

Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

2.2 Обогатяване на различни извлечени части от Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

Вземете 30 g Cistanche deserticola/Tamarococcus deserticola на прах, добавете 10 пъти количеството вода, загрейте и кипете на обратен хладник за екстракция два пъти, 2 часа всеки път, смесете екстрактите, концентрирайте, добавете етанол, докато алкохолното съдържание достигне 60%, утаете при ниска температура за 12 часа и се филтрува чрез изсмукване. , утайката е суровата полизахаридна част. Концентрирайте супернатантата до подходяща концентрация, нанесете я върху D101 макропореста адсорбционна смола и я елуирайте с вода и етанол с различни концентрации последователно. Съберете водния елуат и концентрирайте при понижено налягане до гъста паста, която е общата олигозахаридна фракция; измийте с 40% етанол. Отстранете, концентрирайте и изсушете при понижено налягане, което е общата гликозидна фракция на Cistanche deserticola.

2.3 Определяне на съдържанието на различни извлечени части от Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.1 Определяне на общото съдържание на полизахариди в Cistanche deserticola/Cistanche deserticola.

Претеглете глюкозната проба 20. 00 mg в мерителна колба от 50 ml, за да се получи 0. За 4 mg·mL-1 стандартен разтвор на глюкоза, пипетирайте съответно 3, 4, 5, 6 и 7 ml в мерителна колба от 50 ml, разредете до обем с вода и пипетирайте 2,0 ml от всеки разтвор на глюкоза с градиент на концентрация в епруветка. Вземете друго равно количество дестилирана вода като празна проба, добавете 1 mL 5% фенол към всяка епруветка, разклатете добре, бързо добавете 5 mL концентрирана сярна киселина, оставете за 10 минути, поставете на 40-градусова водна баня за 15 минути, извадете го, бързо охладете до стайна температура и измерете стойността на абсорбцията при 490 nm, вземете абсорбцията (A) като ордината и концентрацията на глюкоза (C) като абциса, начертайте стандартна крива и вземете регресионно уравнение Y=8.37X-0.162 8 (R2=0.994 6). Претеглете точно 1,0 g от общия полизахарид на прах от суровини и продукти, поставете ги съответно в мерителни колби от 50 mL, добавете вода за разтваряне и регулирайте обема до марката, изтеглете точно 2,0 mL в епруветка и измерете в същата като метод за подготовка на стандартната крива. , това е.

2.3.2 Определяне на съдържанието на бетаин в Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.2.1 Приготвяне на референтния разтвор:

Претеглете точно 1,17 mg от референтния разтвор на бетаин, поставете го в мерителна колба от 5 ml, добавете 50% метанол, за да се разтвори и разредете до обем, и е готово.

2.3. 2． 2 Хроматографски условия

Хроматографската колона е Ecosil {{0}}AMINO хроматографска колона (4,6 mm×250 mm, 5 μm), подвижна фаза: ацетонитрил-вода (99,5 ∶ 0.5) , температура на колоната: 30 градуса, дължина на вълната на откриване: 194 nm, скорост на потока: 0,6 mL·min-1, инжекционен обем 10 μL, хроматограма, показана на Фигура 1. 2.3.2.3 Приготвяне на тестовия разтвор Прецизно претеглете праха от общата олигозахаридна фракция на сурови и крайни продукти 1,0 g, съответно поставени в мерителна колба от 5 ml, добавете дестилирана вода за разтваряне и разредете до обем, разклатете добре, прекарайте през 0,45 μL микропореста филтърна мембрана и е готово.

2.3.2.4 Определяне на съдържанието на примера

Прецизно абсорбирайте общия тестов разтвор на олигозахариди в суров и приготвен Cistanche deserticola, измерете го според условията в "2.3.2.2" и изчислете съдържанието на бетаин в пробата.

2.3.3 Определяне на съдържанието на ехинакозид, вербаскозид и хетероцимицифугарин в Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.3.1 Приготвяне на сравнителен разтвор

Претеглете точно 4,50 mg ехинакозид, 4,80 mg вербаскозид и 5,05 mg хетероложен комимицин в мерителни колби от 5 ml, добавете 50% метанол за разтваряне и разредете до марката и вземете всяка контрола Поставете 200 μL от разтвора на пробата в инжекцията флакон, добавете 400 μL 50% метанол и разбъркайте добре, за да направите смесен референтен разтвор, разклатете добре и е готово.

2.3.3.2 Хроматографски условия

Хроматографската колона е Ecosil C18 (4,6 mm×250 mm, 5 μm), метанолът е подвижната фаза A, 0.1% мравчена киселина е подвижната фаза B, градиентно елуиране, {{ 12}}~45 минути, 30% A→ 70% A, скоростта на потока е 1,0 mL·min-1, температурата на колоната е 30 градуса, дължината на вълната на откриване е 330 nm, инжекционният обем е 10 μL и хроматограмата е показана на фигура 2.

2.3.3.3 Приготвяне на разтвора за изпитване

Претеглете точно 1.0 g от общия гликозиден прах на суровините и продуктите, поставете ги в мерителни колби от 100 mL, добавете 50% метанол за разтваряне, регулирайте обема до марката и разклатете добре. Прецизно изтеглете 5 mL от всяка проба в мерителна колба от 10 mL, добавете 50% метанол, за да компенсирате обема, разклатете добре и преминете през 0,45 μm микропореста филтърна мембрана, за да получите.

2.3.3.4 Определяне на съдържанието на примера

Прецизно изтеглете пробата от общите гликозиди на Cistanche deserticola и я измерете според условията в "2.3.3.2". Изчислете съдържанието на ехинакозид, вербаскозид и хетероложен съучастник в пробата.

2.4 Групиране на животни, моделиране и прилагане на лекарства

Стаята за животни има 12 часа светлина и 12 часа тъмнина, относителна влажност от 50% до 70% и стайна температура от 18 до 22 градуса. db/db черни мишки и db/m черни мишки (нормална контролна група) бяха хранени нормално с обикновена храна и експериментът започна на 9-седмична възраст. С изключение на нормалната контролна група, останалите db/db черни мишки бяха избрани на случаен принцип според нивата на кръвната захар и телесното тегло. Разделени на 8 групи, а именно моделна група, положителна контролна група, обща група полизахариди на Cistanche deserticola, група на общи олигозахариди на Cistanche deserticola, група на общи глюкозиди на Cistanche deserticola, група на общи полизахариди на Tartschistanche deserticola, група на общи олигозахариди на Tarthouse deserticola, група на общи глюкозиди на Tartschistanche deserticola. С изключение на нормалния контрол

С изключение на моделната група и моделната група, на плъховете в другите групи е прилагано интрагастрално приложение в доза от 2 mL/100 g за 4 последователни седмици. Концентрацията на течността е 4,1 g·kg-1. Нормалната контролна група и моделната група бяха третирани по същия начин. Дайте определено количество физиологичен разтвор на стомаха.

2.5 Ефекти на различни извлечени части от Cistanche deserticola върху нивата на кръвната захар на db/db черни мишки

2.5.1 Орален тест за глюкозен толеранс (OGTT).

След 26 дни на приложение, те гладуват в продължение на 12 часа и 60 минути след приложението на следващия ден, на черните мишки във всяка група са дадени 2.0 g·kg-1 глюкоза на 0, {{10}}.5, 1.0 и 2 съответно. .0 h кръв от опашната вена е взета за измерване на стойността на кръвната захар. Със стойността на кръвната захар като ордината и времето като абциса беше направена диаграма на промяната на кръвната захар и площта под линията на кривата на кръвната захар на всяка експериментална група беше изчислена съгласно формулата (AUC, hmmoL·L{ {13}}) [19]. AUC=A × {{20}}.25 + B × 0.50 + C × 0.75 + D. Във формулата: A, B, C и D са стойностите на кръвната захар съответно на 0, 0,5, 1,0 и 2,0 часа.

2.5.2 Изчисляване на индекс на инсулинова резистентност и индекс на артериосклероза

Индексът на инсулинова резистентност се изчислява съгласно литературния метод [20]: HOMA-IR=Глюкоза × Инсулин / 22. 5. HOMA - =20 × Инсулин / (Глюкоза - 3.5) × 100%. IR е инсулинова резистентност и (%) е -клетъчна функция. Моларната единица глюкоза е mmoL·L-1

. Инсулинът се дава в mU·L-1. Броят на глюкозата и инсулина се измерва по време на гладуване. Индексът на артериосклероза (атерогенен индекс) се изчислява съгласно метода, описан от Zheng et al. [21]. Метод на изчисление: Атерогенен индекс=(TC-HDL-C) / HDL-C.

2.5.3 Ефекти на различни екстрахирани части от Cistanche deserticola/Cistanche deserticola върху серумен INS и HbA1c на db/db черни мишки

Вземете замразените серумни проби и ги доведете до стайна температура, преди да ги използвате за тестване с INS и HbA1c комплекти за ензимен имуноанализ. Следвайте стриктно методите и стъпките в инструкциите на комплекта.

2.6 Ефекти на различни извлечени части от Cistanche deserticola/Cistanche deserticola върху нивото на чернодробния оксидативен стрес на db/db черни мишки

Вземете замразените серумни проби и ги доведете до стайна температура, преди да ги използвате за тестване с комплекти за ензимен имуноанализ MDA и SOD. Следвайте стриктно методите и стъпките в инструкциите на комплекта.

2.7 Ефекти на различни извлечени части от Cistanche deserticola/Cistanche deserticola върху чернодробния метаболизъм на мазнините на db/db черни мишки

Нивата на TG, TC, HDL-C и LDL-C в серума на плъх се измерват с помощта на подходящи комплекти. За конкретни стъпки на измерване вижте инструкциите на комплекта.

2.8 Ефекти на различни екстрахирани части от камфор Cistanche deserticola/Ratiana върху UA, Cr и mALB в плазмата и урината на db/db черни мишки

Вземете проби от замразена плазма и урина и ги доведете до стайна температура, преди да ги използвате за тестване на UA, Cr и mALB комплекти за ензимно-свързан имуноанализ. Следвайте стриктно методите и стъпките в инструкциите на комплекта.

2.9 Наблюдение на патологични срезове на панкреаса и бъбреците чрез HE оцветяване

Тъканите на панкреаса и бъбреците, напоени с 10% параформалдехиден фиксатор за 24 часа, се отстраняват, промиват се с дестилирана вода и се съхраняват в 70% етанол. Тъканните проби бяха отстранени, дехидратирани с градуиран етанол, изчистени, поставени в парафин, нарязани и след това оцветени с хематоксилин и еозин (H&E оцветяване). След като лепилото за секции изсъхне, използвайте цифрова система за изображения с висока разделителна способност, за да наблюдавате и правите снимки на секциите.

2.10 Определяне на колаген тип IV в бъбречна тъкан чрез имунохистохимия

За експресия, бъбречните срезове се депарафинизират до вода и след това се подлагат на извличане на антиген. Те бяха блокирани с 10% кози серум и инкубирани с първичното антитяло при 4 градуса за една нощ. След промиване, вторичното антитяло се инкубира. Текущото решение беше DAB за проявяване на цветовете. Промиването, дехидратирането и запечатването се извършват под оптичен микроскоп. Наблюдавайте експресията на колаген тип IV в бъбречната тъкан.

2.11 Статистически методи

Използване на софтуер GraphPad Prism версия 5.01 (2007, GraphPad Software re inc) за анализ на данните и резултатите

Резултатът е средно±SEM Показва, че разликата между двете групи е еднопосочна

ＡＮＯＶＡ( ｏｌｌｏｅｄｅＢｏｎｅｒｒｎｎ′ един чифт колонен тест) метод, P<0.05 is a significant difference and has statistical significance.