Ефекти на перфлуорооктановата киселина върху чревната микробиота и микробните метаболити при C57BL/6J мишкиⅡ

2. Материали и методи

2.1. Животни

Четириседмични свободни от специфичен патоген C57BL/6J мъжки мишки бяха закупени от Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Мишките консумират питейна вода ad libitum. Съоръжението за животни в Университета на Джорджия се поддържа при 22 ◦C и 40−70% влажност, при цикъл 12:12 часа светлина: тъмно. Преди експеримента с експозиция на PFOA, пет мишки бяха настанени в една клетка и мишките смениха клетките на случаен принцип веднъж седмично в продължение на четири седмици. Експозицията на PFOA започна, когато мишките бяха на осем седмици и периодът на експозиция продължи четири седмици. В началото на експеримента мишките бяха разпределени на случаен принцип в групата с експозиция на PFOA или контролната група (n=10 мишки във всяка група), с една мишка в една клетка. PFOA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) се прилага на мишки чрез питейна вода. Крайната концентрация на PFOA в питейната вода е 1 част на милион (ppm). Дозата е избрана въз основа на наше предишно проучване [24]. Контролните мишки консумират питейна вода без добавяне на PFOA. Протоколът за животните беше одобрен от Комитета за институционална грижа и използване на животните, Университет на Джорджия (код на протокола: A2014 10-014-Y2-A1).

КЛИКНЕТЕ ЗА домашни средства за запек

2.2. Екстракция на метаболит

Екстракцията на метаболитите се извършва, както е описано по-рано [25]. Накратко, 20 µL от всяка серумна проба се екстрахират с 225 µL метанол. Пробите се разбъркват за 10 секунди. След това, 750 µL метил терт-бутилов етер (MTBE) и 188 µL вода бяха добавени към горните проби, за да се предизвика разделяне на фазите. Пробите се разклащат при 4 ◦C за 6 минути, последвано от центрофугиране при 14,000× g за 2 минути. Екстракционният разтворител беше дегазиран и предварително охладен до -20 ◦C. Горната неполярна фаза (350 µL) се събира и изпарява до пълно изсушаване, като се използва Labconco Centrivap студен концентратор (Labconco, Kansas, MO, USA). За чернодробни и фекални проби, 225 µL метанол и 750 µLMTBE бяха добавени към 10 mg от всяка проба. Пробите се хомогенизират с помощта на aGenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ, USA) при скорост от 1500 rpm за 30 пясъка, след което се завихрят и разклащат при 4 ◦C в продължение на 6 минути. След това към пробите се добавят 188 µL вода, последвано от центрофугиране при 14,000× g за 2 минути. Горната неполярна фаза (350 uL) се събира и изпарява до пълна сухота. След това изсушените проби се ресуспендират в 60 µL 4:1 ацетонитрил и вода (v/v) с вътрешни стандарти. Пробите се разбъркват на вортекс, последвано от обработка с ултразвук за 5 минути и центрофугиране при 14,000× g за 2 минути. Супернатантата се събира за LC-MS анализ.

2.3. Ненасочено профилиране на метаболомиката

Нецелевото метаболомично профилиране беше извършено, както е описано по-рано [25]. Системата Vanquish UHPLC (Thermo Scientific, Waltham, Масачузетс, САЩ) беше използвана за разделяне на метаболити с колона Acquity UPLC BEH Amide (150 mm × 2,1 mm × 1,7 µm), която беше свързана към Acquity VanGuard BEH Amide предварително колона (5 mm × 2.1 mm × 1.7 µm, Waters, Milford, MA, САЩ). LC-MS-клас вода (100%) с 10 mM амониев формиат и 0.125% мравчена киселина (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , САЩ) се използва като мобилна фаза A. Междувременно, 95:5 ацетонитрил: вода (v/v), съдържащ 10 mM амониев формиат и 0,125% мравчена киселина, се използва като мобилна фаза B. Градиентът започва със 100% B при 0– 2 min, 70% Bat 7,7 min, 40% B на 9,5 min и 30% B на 10,25 min, последвано от 100% B на 12,75–16,75 min. Скоростта на потока се поддържа на 0,4 mL/min. Спектрите бяха събрани в положителен режим на електроспрей йонизация (ESI), използвайки Q-Exactive HF (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Диапазонът на масата беше зададен от m/z 60 до 900 със зависим от данните режим за получаване на MS/MS спектри. Нецелевите необработени метаболомични данни първо бяха преобразувани в ABF файлове с помощта на ABF конвертора (https://www.reifycs.com/AbfConverter/ (достъп на 6 юли 2022 г.)). MSDIAL версия 5.1.0.1 беше използвана за идентифициране и количествено определяне на метаболитите [26]. Оптимизаторът на списъка с масови спектрални характеристики (MS-FLO) беше използван за подобряване на качеството на списъците с характеристики чрез маркиране на функции за по-нататъшно управление на данните [27]. Време на задържане m/z библиотекии Fiehn HILIC MS/MS спектрални бази данни в MassBank на Северна Америка бяха използвани за идентифициране на метаболити.

2.4. 16S rRNA генно секвениране

Общата ДНК беше извлечена от фекални проби с помощта на PowerSoil® DNA isolationkit (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA), следвайки инструкциите на производителя. Праймерите 515F и 806R бяха използвани за амплификация на V4 региона на 16S rRNA гена, последвани чрез нормализиране и баркодиране. ДНК беше секвенирана на комплекта IlluminaMiSeq v2 с 500 цикъла. Данните за 16S rRNA генно секвениране бяха анализирани с помощта на Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) II [28]. Накратко, необработените данни за секвениране бяха обезшумени чрез DADA2, последвани от селекция на оперативна таксономична единица (OTU). SILVA (версия 138), обучена от scikit-learn Naive-Bayes-базиран класификатор, беше използвана като база данни.

2.5. Статистически анализ

Размерът на ефекта на линейния дискриминантен анализ (LEfSe) беше използван за определяне на бактериалните родове, които най-вероятно обясняват разликите между PFOA и контролните групи [29]. За сравнение на метаболитите беше използван тестът Mann-Whitney U за изчисляване на p-стойностите между PFOA и контролните групи. Степента на фалшиво откриване беше използвана за коригиране на множеството сравнения. Метаболити с p-стойност < 0.05 се считат за значими. Частичен дискриминантен анализ на най-малките квадрати (PLS-DA) и анализ на обогатяване на пътя бяха извършени с помощта на MetaboAnalyst 5.0 [30]. MixOmics беше използван за интегративен анализ на чревна микробиота и фекални метаболити - това е интегративна рамка за многовариантен анализ на omics данни [31].

Естествено билково лекарство за облекчаване на запек - Cistanche

Cistanche е род паразитни растения, който принадлежи към семейство Orobanchaceae. Тези растения са известни със своите лечебни свойства и се използват в традиционната китайска медицина (ТКМ) от векове. Видовете Cistanche се срещат предимно в сухи и пустинни райони на Китай, Монголия и други части на Централна Азия. Растенията Cistanche се характеризират със своите месести, жълтеникави стъбла и са високо ценени заради потенциалните си ползи за здравето. В TCM се смята, че Cistanche има тонизиращи свойства и обикновено се използва за подхранване на бъбреците, повишаване на жизнеността и поддържане на сексуалната функция. Използва се и за справяне с проблеми, свързани със стареенето, умората и цялостното благосъстояние. Въпреки че Cistanche има дълга история на употреба в традиционната медицина, научните изследвания за неговата ефикасност и безопасност продължават и са ограничени. Известно е обаче, че съдържа различни биоактивни съединения като фенилетаноидни гликозиди, иридоиди, лигнани и полизахариди, които могат да допринесат за лечебните му ефекти.

на Wecistanche'sцистанче на прах, цистанче таблетки, цистанче капсули, и други продукти са разработени с помощта напустиненцистанчекато суровини, всички те имат добър ефект за облекчаване на запек. Специфичният механизъм е следният: Смята се, че Cistanche има потенциални ползи за облекчаване на запек въз основа на традиционната му употреба и някои съединения, които съдържа. Докато научните изследвания конкретно върху ефекта на Cistanche върху запека са ограничени, се смята, че има множество механизми, които могат да допринесат за потенциала му за облекчаване на запек. Слабителен ефект:Цистанчеотдавна се използва в традиционната китайска медицина като средство за лечение на запек. Смята се, че има лек слабителен ефект, който може да помогне за насърчаване на движенията на червата и да предизвика запек. Този ефект може да се дължи на различни съединения в Cistanche, като фенилетаноидни гликозиди и полизахариди. Овлажняване на червата: Въз основа на традиционната употреба се счита, че Cistanche има овлажняващи свойства, специално насочени към червата. Насърчаването на хидратацията и смазването на червата може да помогне за омекотяване на инструментите и да улесни по-лесното преминаване, като по този начин облекчава запека. Противовъзпалителен ефект: Запекът понякога може да бъде свързан с възпаление в храносмилателния тракт. Cistanche съдържа определени съединения, включително фенилетаноидни гликозиди и лигнани, за които се смята, че имат противовъзпалителни свойства. Чрез намаляване на възпалението в червата може да помогне за подобряване на редовността на движението на червата и облекчаване на запека.