Мембраната от яйчена черупка облекчава хиперурикемията чрез увеличаване на екскрецията на урати при плъхове, инжектирани с калиев оксонат
Mar 16, 2022
Резюме:Хиперурикемията е основната причина за подагрозен артрит и други метаболитни нарушения. Мембраната от яйчена черупка (EM) е ефективна и безопасна добавка за лечение на болка и скованост, свързани с остеоартрит. Ефектът на ЕМ върху хиперурикемията обаче е неясен. Това изследване определя ефектите на ЕМ върху хиперурикемия, инжектирана с калиев оксонат. Измерват се концентрациите на пикочна киселина, креатинин, азотна урея в кръвта в серума и ксантиноксидазната активност в черния дроб. Нивата на протеин набъбречна транспортер на урат 1 (URAT1), транспортер на органични аниони 1 (OAT1), транспортер на глюкоза 9 (GLUT9) и ATP-свързващ касетен транспортер G2 (ABCG2) вбъбрексе определят сбъбречнахистопатология. Резултатите показват, че ЕМ намалява серумните нива на пикочна киселина и повишава нивата на пикочна киселина в урината при хиперурикемични плъхове. Освен това ЕМ регулира надолубъбречнаЕкспресията на URAT1 протеин, регулира OAT1 и ABCG2, но не променя експресията на GLUT9. Освен това ЕМ не променя активността на ксантиноксидазата в черния дроб или серума. ЕМ също така намалява поглъщането на пикочна киселина в овоцитите, експресиращи hURAT1. И накрая, EM значително намалявабъбречнавъзпаление и серумни нива на интерлевкин-1. Тези открития предполагат, че ЕМ проявява антихиперурикемични ефекти чрез насърчаване бъбречнаотделянето и регулирането на уратитебъбречнауратни преносители. Следователно, ЕМ може да бъде полезен при превенцията и лечението на подагра и хиперурикемия.
Ключови думи:Бъбрек; бъбречна; подагра; преносител на урат 1; пикочна киселина; калиев оксонат
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ДИАЛИЗА
Мембраната на яйчената черупка (EM) е филмът, прикрепен към вътрешността на черупката на яйцето и е един от компонентите на яйцата, основна храна за човешкото здраве. Позволява проникването на кислород и блокира навлизането на микроорганизми. EM се състои от органичен материал (70 процента), неорганичен материал (10 процента) и вода (20 процента), като 80 процента от органичния материал се състои от протеини. В допълнение, той се състои от 2,3 процента мазнини и 3,4 процента въглехидрати [1,2]. Сред компонентите на яйцата яйчният жълтък и яйчният белтък се използват като суровини за храна, а черупките на яйцата са суровина за калциеви добавки за формиране и поддържане на зъби и кости [3]. EM обаче се класифицира като отпадък и не се използва често. Антиартритните ефекти на ЕМ са докладвани наскоро в индуциран от липополизахарид животински модел и в клинични проучвания при хора [4,5]. ЕМ също подобрява възпалението при плъхове с индуциран от колаген ревматоиден артрит [6]. В допълнение, ЕМ демонстрира антиартритна активност при остеоартритни плъхове, предизвикани от мононатриев йодоацетат [7]. Мононатриевият йодоацетат е индуктор на подагрозен артрит и натрупването на кристали мононатриев урат в ставите може да доведе до възпаление, водещо до подагрозен артрит. Хиперурикемията може да причини образуването на кристали на пикочна киселина (или урат), а отлагането на тези кристали в ставите причинява подагра, форма на артрит, която може да бъде много болезнена. ЕМ е източник на колаген, хондроитин сулфат, глюкозамин, хиалуронова киселина и калций, които са били обстойно изследвани за лечение на остеоартрит [8]. Резултатите от тези проучвания показват потенциалната полезност на ЕМ за предотвратяване и лечение на подагра и хиперурикемия.
Хиперурикемията е основен рисков фактор за развитието на инсулинова резистентност, диабет, затлъстяване, хипертония, атеросклероза и сърдечно-съдови заболявания, както и подагрозен артрит [9–11]. Подходящият контрол на хиперурикемията допринася за превенцията и лечението на тези заболявания. Хиперурикемията възниква при повишено производство на пикочна киселина или нарушена екскреция на пикочна киселина [12]. Чрез намаляване на производството и засилване на екскрецията на пикочна киселина, понижаващото уратите лечение може да играе решаваща роля в контрола на хиперурикемията и свързаните с хиперурикемия разстройства [13]. Често използвани лекарства за понижаване на уратите като алопуринол и фебуксостат, инхибитор на синтеза на пикочна киселина, се използват широко за лечение на подагра; обаче, тези инхибитори на ксантин оксидазата (XO) могат да имат тежки нежелани реакции, като синдром на свръхчувствителност към алопуринол [14–16]. Benzbromarone е урикозурично лекарство, което се използва за контрол на подагра през последните 30 години, но поради тежки хепатотоксични странични ефекти, беше изтеглено от европейския пазар [17]. По този начин има нужда от разработване на лекарства, получени от естествени продукти без токсичност, които са по-ефективни за превенция и дългосрочно лечение на нарушения, свързани с хиперурикемия. Следователно, това проучване изследва дали ЕМ предпазва от хиперурикемия. Това проучване оценява антихиперурикемичната активност на ЕМ при плъхове с хиперурикемия, индуцирана от калиев оксонат (PO). PO е селективен конкурентен инхибитор на уриказа, който се използва широко за инхибиране на ефекта на чернодробната уриказа, което води до хиперурикемия [18,19]. По този начин плъховете, третирани с PO, са практичен животински модел не само за изследване на патологията на хиперурикемия, но и за оценка на потенциални лекарства [20]. За изследване на активността и основните механизми на ЕМ при хиперурикемия, двойните механизми на ЕМ чрез инхибиране на производството на пикочна киселина и усилване на екскрецията на пикочна киселина са изследвани при животни с хиперурикемия.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА НЕДОСТАТЪЧНОСТ
2. Материали и методи
2.1. ЖивотниСедемседмични мъжки плъхове Sprague Dawley са закупени от Orient Bio (Seongnam, Корея). Те бяха адаптирани в климатизирана стая за животни при 22 ± 1 ◦C с 50 процента ± 10 процента влажност. На плъховете е даден достъп до стандартна диета и вода ad libitum. Изследванията върху животни бяха одобрени от Комитета за институционална грижа и използване на животните към Корейския институт по източна медицина и експериментите бяха проведени в съответствие с насоките на комитета (код за одобрение. 19-024).
2.2. Индукция на хиперурикемия и приложение на ЕМЕМ, използван в това проучване, е предоставен като изсушен прах от JU-HWAN BIO CELL Co., Ltd. (Cheonan, Корея). За да се предизвика хиперурикемия, 150 mg/kg PO (инхибитор на уриказа) се инжектира интраперитонеално в животните. Използвани са следните лекарства за положителна контрола: алопуринол (Sigma, St. Louis, MO, USA) и benzbromarone (TCI, Tokyo, Japan). Преди инжектиране РО се разтваря в 0.5 процента карбоксиметил целулоза (CMC, Sigma, САЩ) и 0.1 М натриев ацетат (Sigma, САЩ). За да се изследва антихиперурикемичната активност на ЕМ (Експеримент 1, предварително остро изследване), плъховете бяха разделени на пет групи (5 животни на група): нормална група; PO-инжектирана група хиперурикемия (PO); PO плюс 10 mg/kg алопуринол-администрирана група; PO плюс 100 mg/kg EM-администрирана група; и PO плюс 200 mg/kg EM-администрирана група. В експеримент 1 пробите се разтварят в CMC и се прилагат орално (еднократно) на плъхове 1 час след перорално инжектиране в продължение на 1 ден. За да се изследват зависимите от дозата дейности и молекулярните механизми на ЕМ (Експеримент 2), плъховете бяха разделени на 7 групи (n=5 всяка): нормална група (N); група с перорално инжектирана хиперурикемия; PO плюс 10 mg/kg алопуринол-администрирана група; РО плюс 50 mg/kg бензбромарон-администрирана група; PO плюс 50 mg/kg EM-администрирана група; PO плюс 100 mg/kg EM-администрирана група; и PO плюс 200 mg/kg EM-администрирана група. Пробите се разтварят в 0, 5% разтвор на CMC и се прилагат перорално (всеки ден) на плъховете 1 час след перорално инжектиране в продължение на 5 дни.
2.3. Вземане на проби от кръв, урина и тъканиКръвта се събира 2 часа след прилагане на лекарството и урината също се събира след 2 часа, като се използва метаболитна клетка след третиране с проба. След вземане на кръв и урина, тъкан(бъбреки черен дроб) пробите бяха внимателно разделени и запазени при 80 ◦C за по-нататъшни анализи. Серумът се отделя чрез центрофугиране (2000 × g, 15 минути, 4 ◦C). След това пробите от серум и урина се използват за биохимичен анализ.
2.4. Анализ на концентрациите на пикочна киселина в серума и уринатаКонцентрациите на пикочна киселина от серума и урината се определят с помощта на търговски комплект за анализ на пикочна киселина (Biovision, Milpitas, СА, САЩ) съгласно инструкциите, предоставени от производителя.
2.5. Измерване на нивата на проинфламаторни цитокини в серумаСерумните концентрации на интерлевкин (IL)-1 бяха измерени с помощта на комплект за ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) на плъши IL-1 (R&D Systems, Минеаполис, Минесота, САЩ).
2.6. In Vitro активност на ксантин оксидаза от черен дроб и серумАктивността на XO в чернодробната тъкан и серума се определя с помощта на комплекта за анализ на активността на XO съгласно протоколите на производителя (Sigma, САЩ). XO активността се измерва с четец на микроплаки Spectra Max M3 (Molecular Devices, Сан Хосе, Калифорния, САЩ), като се използват публикувани по-рано протоколи [21]. Ензимната реакция се инициира чрез добавяне на 0.5 тМ ксантин като субстрат и концентрацията на пикочна киселина се измерва всяка минута в продължение на 5 минути. XO инхибиторът алопуринол се използва като еталон. Чернодробната XO активност се нормализира от нивото на общия протеин.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНА/БЪБРЕЧНА ИНФЕКЦИЯ
2.7. Хистопатологично изследване на бъбрецитеБъбречните тъкани се отстраняват, незабавно се фиксират за 1 ден във формалин и след това се поставят в парафин. Всеки образец се нарязва с дебелина 6 µm и срезовете се оцветяват с хематоксилин и еозинов реагент. След това оцветените срезове се визуализират под микроскоп.
2.8. Уестърн блот анализБъбректъканите се хомогенизират в про-преп екстракционен разтвор (Intron, Сеул, Корея) и след това се центрофугират (13, 000 × g, 4 ◦C) за 15 минути. Супернатантът се използва за Western blotting анализ на целевите протеини. Общите протеинови нива се определят чрез DC протеинов анализ с говежди серумен албумин (Bio-Rad, Hercules, СА, САЩ). Първичните антитела включват -актин (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), глюкозен транспортер 9 (GLUT9, MyBioSource, Сан Диего, Калифорния, САЩ), уратен транспортер 1 (URAT1; MyBioSource, Сан Диего, Калифорния, САЩ) и органичен анионен транспортер 1 (OAT1; MyBioSource, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Лентите от мембраната се визуализират чрез реагент за откриване на ECL с помощта на ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Сеул, Корея). Плътността от получените изображения се определя с помощта на софтуера Image J1.49 на NIH (Bethesda, MD, USA). Визуализираните целеви нива на протеин бяха нормализирани до -актин. Експресиите на ATP-свързващ касетен транспортер G2 (ABCG2) бяха получени с помощта на комплект ELISA ABCG2 на плъх (MyBioSource) и нормализирани от общите протеинови нива.
2.9. Измерване на усвояването на урати с помощта на UART1-експресиращи яйцеклеткиОоцитите, експресиращи hURAT{{0}} от Xenopus, са конструирани, както е описано по-горе [20]. Инхибиторът на URAT1 бензбромарон (TCI, Токио, Япония) се третира като референтен. Ооцитите се инкубират в реакционен буфер с фосфатно буфериран физиологичен разтвор на Dulbecco (DPBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) и ND разтвор (pH 7,4; 5 mM 4-(2- Хидроксиетил)) пиперазин-1-етан-сулфонова киселина буфер, 2 mM KCl, 1 mM магнезиев хлорид, 1,8 mM калциев хлорид и 96 mM натриев хлорид), с 1 mM пиразинкарбоксилна киселина (Sigma-Aldrich, St. Louis , Мисури, САЩ) при 37 ◦C. Ооцитите бяха допълнително инкубирани в разтвор, съдържащ различни концентрации на ЕМ (1, 10 и 100 µg/mL) с 50 µM [14C] пикочна киселина (Moravek Biochemicals, Brea, СА, САЩ) при 37 ◦C. След 60 минути поемането на пикочна киселина беше спряно от добавка на студен DPBS. След спиране овоцитите се разтварят в разтвор от 0,1 N натриев хидроксид и 10 процента натриев додецил сулфат и радиоактивността се преброява чрез течна сцинтилация.
2.10. СтатистикаВсички данни бяха изразени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност. Значимите разлики бяха статистически оценени чрез еднопосочен анализ на дисперсията, последван от теста на Dunnett за post hoc анализ с помощта на софтуер GraphPad Prism 7.05. Разликата се счита за статистически значима, когато p-стойността е по-малка от 0,05.
3. Резултати
3.1. Ефекти на мембраната от яйчена черупка върху серумната секреция на пикочна киселина,Еднократна перорална инжекция за 1 ден значително повишава серумните нива на пикочна киселина при перорално инжектирани хиперурикемични плъхове в сравнение с тези при нормални плъхове (Фигура 1). Междувременно, ЕМ при 100 и 200 mg/kg и алопуринол (положителна контрола) ефективно намаляват серумната пикочна киселина при PO-инжектирани хиперурикемични плъхове. Следователно бяха проведени следващите проучвания за идентифициране на дозозависимите дейности и механизми на ЕМ.
3.2. Ефекти на мембраната от яйчени черупки върху нивата на пикочната киселина в серума и урината,Инжектирането на APO за 5 дни значително повиши серумните нива на пикочна киселина в PO групата в сравнение с тези в нормалната група (Фигура 2а). Лечението с ЕМ при 100 и 200 mg/kg, както и с алопуринол и бензбромарон, значително намалява серумните нива на пикочна киселина в PO групата. Освен това, за оценкабъбречна функция, бяха измерени концентрациите на креатинин и уреен азот в кръвта (BUN). Концентрациите на серумния креатинин не се различават между групите (Фигура 2b). Серумните концентрации на BUN са повишени в PO групата, но тези нива намаляват в групата с EM 200 mg/kg и групите с положителна контрола (алопуринол и бензбромарон) (Фигура 2с).
За да се оцени ефектът на ЕМ върху екскрецията на пикочна киселина, бяха изследвани нивата на пикочна киселина в урината. Групата PO има значително намалени нива на пикочна киселина в урината, които се повишават от прилагането на ЕМ (100 и 200 mg/kg) и бензбромарон (Фигура 2d). Тези данни показват, че ЕМ може да увеличи екстракцията на урат от бъбреците, за да намали серумните нива на пикочната киселина при хиперурикемични плъхове.
3.3. Ефекти на мембраната от черупки на яйца върху бъбречно възпалениеВбъбрекна PO-инжектирани хиперурикемични плъхове (Фигура 3а). Въпреки това, EM ефективно ги подобрибъбречнахистопатологични промени при хиперурикемични плъхове. Освен това, плъхове с хиперурикемия демонстрират повишени серумни нива на провъзпалителен цитокин IL-1 (Фигура 3b). ЕМ при всички концентрации забележително намалява серумните нива при хиперурикемични плъхове. Прилагането на бензбромарон повишава серумните нива на IL-1 повече от перорално инжектирани хиперурикемични плъхове, макар и не значително, и това вероятно е страничният ефект на това лекарство. Тези резултати предполагат, че EM ефективно се подобрявабъбреквъзпаление и функция при хиперурикемични плъхове.
3.34. Ефекти на мембраната от яйчена черупка върху XO активността
XO в черния дроб индуцира производството на пикочна киселина. По този начин, за да се определи механизмът на инхибиторния ефект на ЕМ върху хиперурикемия, беше оценена XO активността в серума и черния дроб, чернодробната XO активност беше значително повишена в PO групата (Фигура 4a, b). XO инхибиторът, алопуринол, значително намалява активността на XO в серума и черния дроб. Въпреки това, ЕМ при всички дози не променя активността на ХО. Тези данни показват, че ЕМ не инхибира активността на ХО и не намалява производството на пикочна киселина.
3.5. Ефекти на мембраната от яйчена черупка върху екскрецията на уратЗа да се оцени ефектът на ЕМ върху екскрецията на урат, експресията на няколкобъбречни транспортерибеше прегледан. ЕМ при 100 и 200 ug/mL и бенбромарон значително понижиха нивата на URAT1 протеин вбъбрек(Фигура 5a,b). Въпреки това, ЕМ не променя нивата на GLUT9 протеин (Фигура 5в). ЕМ при 200 ug/mL повишава нивата на OAT1 протеин, а прилагането на ЕМ при всички концентрации повишава нивата на ABCG2 (Фигура 5d, e).
3.6. Ефект на ЕМ върху In Vitro поглъщането на URAT1 в ооцититеВ допълнение, ефектът на ЕМ върху in vitro системата за усвояване на урат беше потвърден. Третирането с ЕМ при 1, 10 и 100 ug/mL показва мощно инхибиране на усвояването на пикочна киселина in vitro hURAT1-свръхекспресиращи ооцити (Фигура 6). Тези данни показват, че ЕМ регулира експресията на уратни транспортери, за да увеличи екскрецията на урат.
Дискусия
При хората бъбреците играят важна роля в хомеостазата на пикочната киселина, тъй като повече от 70 процента от екскрецията на урат ебъбречна,докато останалите 30 процента се екскретират в изпражненията от червата [22,23]. Екскрецията на урат обаче може да бъде нарушена отбъбречнанарушения, водещи до хиперурикемия. Екскрецията на пикочна киселина зависи от транспортните протеини в проксималните тубули набъбрекза контролиране на секрецията на пикочна киселина в кръвта и филтрата [24].Бъбречнауратни транспортери URAT1, разположени в луминалната мембрана, и GLUT9/ в апикалната мембрана набъбрекпроксималните тубули, представляват първичния път на реабсорбция на урат вбъбрек[25,26]. OAT1, разположен в базолатералната мембрана на проксималния тубул, и ABCG2, разположен в апикалната мембрана, са отговорни главно за секрецията на урат от кръвта към епителните клетки [27]. Регулирането на тези уратни транспортери се счита за основна терапевтична цел за хиперурикемия. В това проучване EM ефективно намалявабъбречнаНивата на URAT1 при PO-инжектирани хиперуремични плъхове, въпреки че експресиите на GLUT9 протеин не се променят. Освен това, експресиите на протеини OAT1 и ABCG2 бяха регулирани нагоре вбъбрекслед ЕМ лечението, като по този начин проявява урикозуричен ефект. Това проучване потвърди инхибиторната активност на ЕМ върху поглъщането на урат от URAT1 в URAT1-свръхекспресиращи ооцити и че този ефект е ефективен за обръщане на насърчаваното от URAT1 поглъщане на урат. Общо 90 процента от реабсорбцията на урат се получава чрезбъбречнаURAT1 [28]. Контролът на тезибъбрекуратни преносители от лечението с ЕМ могат да допринесат за насърчаване набъбречнаекскреция на пикочна киселина при плъхове с хиперурикемия. Креатининът и уреятният азот са биомаркери за абнормнибъбрекфункция, показваща способността набъбрекза отделяне на протеинови метаболити [24]. Резултатите показват, че PO повишава серумната концентрация на пикочна киселина и BUNбъбречнадисфункция. Въпреки това, 200 mg/kg EM обърна това увеличение с подобрениебъбречна функция. Ензимът XO катализира окислението на хипоксантин или ксантин до пикочна киселина [28]. Инхибиторите на XO, като алопуринол, намаляват серумните концентрации на пикочна киселина и свръхпроизводството на реактивни кислородни видове, свързани главно с свръхактивност на XO, което често генерира възпалително клетъчно увреждане на съдовия ендотел, допринасяйки за развитието на метаболитен синдром и сърдечно-съдови нарушения [29]. ]. Следователно, инхибирането на свръхактивирането на XO може да бъде терапевтична цел за контролиране на вредните ефекти от излишната пикочна киселина. Въпреки това, нашето проучване показа, че ЕМ не обръща серумната и чернодробната XO активност при плъхове с PO-индуцирана хиперурикемия.
Хиперурикемията може да бъде рисков елемент забъбрекдисфункция [23]. В настоящото изследване,бъбрекдисфункцията се характеризира с повишени нива на серумен BUN и възпалителен цитокин IL-1p ибъбречнавъзпаление при хиперурикемични плъхове. Тезибъбречнадисфункциите са отслабени от лечението с ЕМ, което предполага подобрение на бъбречното възпаление. Въпреки това, лекарството benzbromarone повишава серумните нива на IL-1p при плъхове с хиперурикемия, а бъбречното увреждане се съобщава като основен нежелан ефект на урикозуричните лекарства, включително benzbromarone и пробенецид [30]. ЕМ съдържа естествено срещащ се глюкозамин, хондроитин сулфат, хиалуронова киселина, колаген, пептиди и други съдържащи сяра аминокиселини [8]. Предишни проучвания съобщават, че глюкозаминът и хондроитинът са показали противовъзпалителни и антиостеоартритни ефекти [31,32]. Хиалуроновата киселина показва противовъзпалителни и антихиперурикемични ефекти при индуцирани от мононатриев урат кристални животински модели за остър подагрозен артрит и хиперурикемия [33]. Резултатите от тези проучвания показват потенциалната полезност на тези компоненти за предотвратяване и лечение на хиперурикемия. Въпреки това, нашето проучване не показа кои компоненти на ЕМ повишават екскрецията на пикочна киселина. Ефектите на биоактивните компоненти, получени от ЕМ, трябва да бъдат допълнително изследвани. В това проучване ние демонстрирахме, че PO-индуцираната хиперурикемия ивъзпаление на бъбрецитебеше инхибирано от ЕМ лечение. Следователно ЕМ може да бъде обещаващ антихиперурикемичен агент. Да предположим, че ефективната доза ЕМ при плъхове е 100 mg/kg (максимална доза; 200 mg/kg). Въз основа на телесната повърхност еквивалентната доза на ЕМ за хора е 16,2 mg/kg (972 mg/ден при възрастни). От тези in vivo проучвания препоръчителната дневна доза ЕМ при леки състояния е 486 mg или 972 mg дневно, а максималната доза е 1944 mg дневно при тежки състояния. Въпреки това, дозировката може да варира в зависимост от продължителността на лечението и възрастта. Въз основа на тези резултати в близко бъдеще ще продължи клинично изследване на ЕМ при хора.
