Подобряване на биосинтезата на фенилетаноидни гликозиди в клетъчни култури на Cistanche Deserticola чрез осмотичен стрес

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Чун-Джао Лю. Си-Ю Ченг

РезюмеЕфектът на осмотичния стрес върху клетъчния растеж и биосинтезата на фенилетаноидни гликозиди (PeGs) е изследван в клетъчни суспензионни култури наCistanche deserticolaYC Ma, пустинно лечебно растение, отглеждано в западния регион на Китай. Различните първоначални концентрации на захароза повлияха значително клетъчния растеж и биосинтезата на PeGs в суспензионните култури, а най-високото сухо тегло и натрупването на PeGs достигнаха съответно 15,9 gl–1-DW и 20,7 mg g–1-DW при първоначалния осмотичен стрес от 300 mOsm kg–1, където концентрацията на захароза е 175,3 mM. Стехиометричният анализ с различни комбинации от захароза и неметаболитна захар (манитол) или незахарни осмотични агенти (PEG и NaCl) разкри, че самият осмотичен стрес е важен фактор за повишаване на биосинтезата на PeGs в клетъчни суспензионни култури наCistanche deserticola. Максималните съдържания на PeGs от 26,9 и 23,8 mg g–1-DW бяха получени след 21 дни при комбинации от 87,6 mM захароза със 164,7 mM манитол (303 mOsm kg–1) или съответно 20 mM PEG, което беше по-високо от тази на клетъчни култури на C. deserticola, отглеждани при първоначална концентрация на захароза от 175,3 тМ след 30 дни. Стимулираното натрупване на PeGs в културите на клетъчна суспензия е свързано с повишаване на активността на фенилаланин амониева лиаза (PAL), предизвикана от осмотичен стрес.

Ключови думи Cistanche deserticola, Пустинно лечебно растение, Фенилетаноидни гликозиди, Осмотичен стрес, Фенилаланин амонячна лиаза

Цистанчеtubulosaима много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

Въведение

Cistanche deserticolaYC Ma, скъпоценна китайска билка, паразитира в корените на Haloxylon ammodendrun и расте в пустинните райони на Западен Китай. Фенилетаноидните гликозиди (PeGs), основните биоактивни компоненти, изолирани от C. deserticola, имат подчертана активност в изчистването на свободните радикали, повишаване на имунитета, подобряване на сексуалната функция и т.н. (Zong et al. 1996; Lu 1998; Wang et al. 2001). Поради неконтролирана експлоатация и използване наCistanche deserticola, природният ресурс наCistanche deserticoла беше на ръба на изтощението. С оглед на тези проблеми производството на PeGs чрез клетъчни суспензионни култури на C. deserticola се счита за обещаваща алтернатива за решаване на недостига наCistanche deserticolaрастителни материали (Lu and Mei 2003; Ouyang et al. 2003; Cheng et al. 2005a).

Осмотичният стрес е важен фактор, влияещ върху растежа, развитието, морфогенезата и образуването на вторични метаболити на растенията. Засилено производство на вторични метаболити от in vitro тъканни култури при оптимален осмотичен стрес е докладвано при няколко вида лечебни растения (Kim et al. 2001; Wang et al. 1999; Wu et al. 2005). Захарозата е обичаен агент за осмотичен стрес, използван в тези случаи, и също така служи като жизненоважен източник на въглерод и енергия. Следователно е много трудно да се раздели ефектът на осмотичния стрес и хранителната роля на захарите като източници на въглерод. Увеличаването на началния осмотичен стрес с неметаболитен манитол, сорбитол и PEG също подобрява натрупването на паклитаксел в клетъчни култури на Taxus Chinensis, натрупването на сапонин и полизахарид в клетъчните култури на Panax notoginseng и натрупването на елеутерозиди в ембриогенните култури на Eleutherococcus sessiliflorus (Zhang et al. 1995; Kim и др., 2001 г.; Shohael и др., 2006 г.). Техните резултати показват, че ефектите от концентрацията на въглехидрати и осмотичния стрес са различни в зависимост от видовете растения и вторичните метаболити.

Целта на настоящото изследване е фокусирана върху осмотичните ефекти на захарозата, манитола, PEG и NaCl върху клетъчния растеж и биосинтезата на PeGs вCistanche deserticolaклетъчни суспензионни култури. Активността на PAL в суспензионните култури е изследвана при различни комбинации от първоначални осмотични агенти и е обсъден възможният механизъм за подобрено натрупване на PeGs чрез увеличаване на осмотичния стрес.

Материали и методи

Растителни материали и индукция на калус

Семена отCistanche deserticolaYC Ma бяха събрани от пустинни райони в провинция Синдзян в Китай и съхранени в 4C преди употреба. Ботаническата идентичност беше потвърдена чрез сравнение с референтни стандарти в Института по ботаника, Китайската академия на науките, НР Китай. Семената се стерилизират повърхностно чрез потапяне в 70 процента етанол за 30 секунди, след което се потапят в 20 процента воден разтвор на 5, 4 процента натриев хипохлорит във вода за 20 минути, последвано от три изплаквания със стерилна дестилирана вода. Калусите са индуцирани от повърхностно стерилизираните семена наCistanche deserticolaна MS (Murashige и Skoog 1962) среда, допълнена с 1.0 mg l–1 нафталоцетна киселина (NAA), 2.0 mg l–1 6-бензиладенин ({{7} }BA), 0.25 mg l–1 2, 4-дихлорофеноксиоцетна киселина (2, 4-D), 6 gl–1 агар (PhytoTechnology LaboratoriesTM, ID на продукта: A181) и 30 gl–1 захароза за 60 дни в шкаф за растеж на тъмно при 25°C. Калусните култури, индуцирани от семенните експланти, впоследствие се субкултивират в горната твърда среда на интервал от 30 дни (Cheng et al. 2005a).

Създаване и поддържане на клетъчни суспензионни култури

Суспензионните калусни култури (3.0 g прясно тегло), които бяха филтрирани през 1,000 lm меша сито и задържани на 200 lm меша сито, бяха субкултивирани в 500-ml Ерленмайер колба, съдържаща 100 ml от горната течна среда на ротационен шейкър при 110 rpm при 25°С на тъмно при интервал на субкултивиране от 18 дни. Средното рН се коригира до 5.8 с 1 М NaOH или 1 М НС1 преди автоклавиране. Суспензионните култури от калус, субкултивирани след десет пъти, се използват като инокулум за следващата експериментална култура в колба. Всички експерименти с колби бяха проведени в 250 ml Ерленмайерови колби, съдържащи 50 ml течна среда с 30 gl–1 захароза и инокулирани с 1,5 g прясно тегло 18-дневни клетъчни суспензионни култури. Тези Ерленмайерови колби се инкубират на ротационен шейкър (110 rpm) при 25°С на тъмно.

Експеримент с осмотичен стрес

За изследване на ефекта от първоначалната концентрация на захароза върхуклетъчен растеж и натрупване на PeGs,Cistanche deserticolaсуспензионните култури се култивират в MS среда с 87.6,175.3 и 262.9 тМ захароза. За състояния на осмотичен стрес,Cistanche deserticolaсуспензионните култури се инкубират в MSсреда, съдържаща 87.6 mM захароза, комбинирана с164.7 тМ манитол. Други осмотични агенти (PEG 4, 000 иNaCl) се добавят в еквивалента на осмоларитета на87.6 тМ захароза. Осмотични еквивалентни концентрациина осмотични агенти бяха експериментално определени като PEG4, 000 от 20 mM и NaCl от 50 mM, съответно. Трикратни колби бяха използвани във всички експерименти и всички стойностибяха средните стойности на трикратни колби ± SD.

Анализ

Cistanche deserticolaкултивираните клетки под различен осмотичен стрес бяха наблюдавани от Nikon AFX-DX светлинен микроскоп (Nikon, Япония) при 400· увеличения. Осмоларността на културалната среда се измерва с осмометър за налягане на парите (Fiske One-Ten Osmometer, MA, USA). За определяне на прясно тегло (FW),Cistanche deserticolaклетките бяха внимателно притиснати върху филтърна хартия за отстраняване на излишната вода и претеглени. Впоследствие клетките се сушат в пещ при 60°С в продължение на 24 часа и се записва сухото тегло (DW). Концентрацията на остатъчната захар се определя чрез използване на фенол и концентрирана сярна киселина, като се използва глюкоза като стандарт (Dubois et al. 1956).

PeGs се екстрахират от изсушените клетки с метанол в продължение на 15 минути при 60°С в ултразвукова водна баня (KQ2200, Shanghai Cany Precision Instrument Co., Ltd, Китай) с честота 40 kHz и мощност 100 W. Филтратът се концентрира и остатъкът се разтваря в дестилирана вода и след това преминава през колона с макроретикулярна смола (AB-8, химически продукт на университета Нанкай, Тиендзин, Китай). Метанолният елуат се събира и общото съдържание на PeGs се анализира при 333 nm чрез използване на ехинакозид като стандарт (Du и Liu 1993a; Du et al. 1993b).

Клетъчната жизнеспособност се оценява чрез редукция на 2, 3, 5-трифенил тетразолиев хлорид (TTC) (Steponkus and Lanphear 1967). Индексът на жизнеспособност се определя като абсорбцията, измерена на грам свежа тъкан. Определянето на активността на PAL се основава на метода на Koukol и Conn (1961). Една единица от активността на PAL (U) се определя като количеството на вариацията на абсорбцията на 0.01.

Резултати и дискусия

Ефект на първоначалната концентрация на захароза върху клетъчния растеж и биосинтезата на PeGs в клетъчни суспензионни култури наCistanche deserticola.Отговорът наCistanche deserticolaклетъчни суспензионни култури до начална концентрация на захароза между 87.6 и 262.9 mM бяха тествани. Както е показано на Фиг. 1, клетките растат и натрупват PeGs бързо при ниска първоначална концентрация на захароза от 87.6 mm и клетъчният растеж и натрупването на PeGs се потискат очевидно при висока начална концентрация на захароза от 262.9 mM. Съотношението прясно тегло към сухо тегло намалява, когато първоначалната концентрация на захароза се повишава от 87,6 от 262,9 тМ (данните не са показани). Максималното сухо тегло от 15,9 gl–1 и съдържание на PeGs от 20,7 mg g–1-DW са получени на 30-ия ден при първоначална концентрация на захароза от 175,3 mM, на която осмоларността е около 300 mOsm kg–1. При микроскопско наблюдение клетъчните стени се отделят от тяхната цитоплазма при най-високия осмотичен стрес от 388 mOsm kg–1, където първоначалната концентрация на захароза е 262,9 mM (фиг. 2), а най-високият осмотичен стрес може да наруши метаболизма на клетките и да доведе до силно потискане на растежа и намаляване на биосинтезата на PeGs. Подобен феномен се наблюдава и при суспензионни култури на суспензионни клетъчни култури на T. Chinensis и оптималната концентрация на захароза за производството на паклитаксел е 175,3 mM (Kim et al. 2001). Въпреки това, първоначална концентрация на захароза от 204,5 mM е благоприятна за растежа на клетъчните култури на E. sessiliflorus. По-висока концентрация на захароза от 262,9 mM засилва биосинтезата на елеутерозиди, фенол и флавоноиди в културите на Eleutherococcus (Shohael et al. 2006). Ясно е, че първоначалната концентрация на захароза е важна за растежа и натрупването на вторични метаболити на растителни клетъчни култури и нейният ефект е свързан със специфична клетъчна линия.

Ефект на различни осмотични агенти върху клетъчния растеж и биосинтеза на PeGs в клетъчни суспензионни култури на C. deserticola

Да се ​​разбере осмотичната роля на метаболитната захароза и други неметаболитни химични субстрати върху биосинтезата на PeGs в клетъчни суспензионни култури наCistanche deserticolaбяха проведени серия от експерименти с използване на захароза, комбинирана с неметаболитни осмотични агенти (манитол, PEG и NaCl). В тези експерименти 164,7 mM манитол, 20 mM PEG и 50 mM NaCl бяха добавени към средата, съдържаща 87,6 mM захароза и направиха първоначалния осмоларитет около 300 mOsm kg–1, което беше еквивалентно осмотично състояние, сравнимо със средата със 175,3 mM захароза.

Както е показано на Фиг. 3a, b, добавянето на манитол (неметаболитен захарен осмотичен агент) и PEG (непропусклив осмотичен агент) леко инхибира скоростта на клетъчния растеж, но значително повишава биосинтезата на PeGs вCistanche deserticolaклетъчни суспензионни култури. Максималните съдържания на PeGs от 26,9 и 23,8 mg g–1-DW бяха получени съответно на 21-ия ден, когато клетките бяха отгледани в комбинации от 87,6 mM захароза с 164,7 mM манитол (303 mOsm kg–1) или 20 mM PEG (299 mOsm kg–1). Сумите на PeGs бяха по-високи от тези наCistanche deserticolaклетъчни култури, отглеждани в MS течна среда с начална концентрация на захароза от 175,3 mM на ден 30. Захарта се консумира постепенно в хода наCistanche deserticolaклетъчна култура и след това осмотичният стрес, предизвикан от захарта, спадна съответно (фиг. 3c, d). Осмотичният стрес на течната среда с първоначална концентрация на захароза от 175,3 mM спадна от 280 на 110 mOsm kg–1, когато PeGs в клетъчните култури започнаха да се натрупват на ден 9 и достигнаха своя максимум на ден 30 (данните не са показани). Неметаболитни осмотични агенти (манитол и PEG) не се консумират в хода на клетъчната култура, което позволява осмотичният стрес на течната среда да се поддържа между 200 и 280 mOsm kg–1, осмотично налягане, благоприятно за биосинтеза на PeGs. Тези резултати показват, че самият осмотичен стрес играе важна роля в усилването на биосинтезата на PeGs вCistanche deserticolaклетъчни култури.

Съобщава се, че добавянето на NaCl подобрява биосинтезата на индолови алкалоиди и сапонин съответно в клетъчни култури от Catharanthus roseus и Panax ginseng (Smith et al. 1987; Wu et al. 2005), но третирането с NaCl потиска клетъчния растеж на T. Chinensis докато не показва разлика в биосинтезата на палитаксел (Kim et al. 2001). Следователно е необходимо подробно проучване за всеки случай. Добавянето на осмотичен еквивалент от 50 mM NaCl потиска клетъчния растеж и биосинтезата на PeGs. Този резултат може да се дължи на пропускливата природа на NaCl, която не е от полза за клетъчните култури на този пустинен растителен вид, който може да понася много добре стреса от суша.

Фиг. 3 Ефект на комбинациите от захароза и други неметаболитни осмотични агенти върху клетъчния растеж (a), натрупването на PeGs (b), консумацията на захар (c) и промяната на осмотичния стрес (d) в хода на клетката на C. deserticola култура. Стойностите са средни за три колби ± SD

Ефект на различни осмотични агенти върху клетъчната жизнеспособност и активността на PAL в клетъчни суспензионни култури на Cistanche deserticola

В нашите предишни проучвания (Cheng et al. 2005b, 2006), добавянето на елиситор драстично стимулира биосинтезата на PeGs вCistanche deserticolaклетъчни култури и стимулацията е свързана с повишена активност на PAL, първият ключов ензим в биосинтезата на PeGs (Hahlbrock and Grisebach 1979). Както е показано на Фиг. 4, добавянето на неметаболитен 164.7 mM манитол или 20 mM PEG в MS течна среда, съдържаща 87.6 mM захароза, леко намалява клетъчната жизнеспособност, но значително повишава активността на PAL, която е по-висока от тази, предизвикана от първоначална концентрация на захароза от 175.3 тМ. Засиленото натрупване на PeGs вCistanche deserticolaклетъчни суспензионни култури е свързано с повишаването на PAL активността, стимулирана от самия осмотичен стрес. Първоначална концентрация на захароза от 175,3 тМ в MS течна среда причинява намаляване на клетъчната жизнеспособност за 15 дни и инхибира PAL активността за 21 дни. След период на консумация на захар от нарастващитеCistanche deserticolaклетъчни култури, както клетъчната жизнеспособност, така и PAL активността на култивираните клетки се увеличават и достигат своите максимуми съответно на 24 и 30 ден. Наблюдава се също така, че повишената активност на PAL чрез осмотичен стрес подобрява биосинтезата на сапонин в клетъчни култури на P. ginseng и натрупването на алкалоиди в култивирани клетки на C. roseus (Godoy-Hernandez et al. 2000; Wu et al. 2005). Въпреки това, добавянето на пропусклив NaCl в MS течна среда, съдържаща 87,6 mM захароза, намалява жизнеспособността на клетките и инхибира активността на PAL по време на целия период на култивиране. В резултат както клетъчният растеж, така и биосинтезата на PeGs бяха очевидно потиснати.

Фиг. 4 Вариация на клетъчната жизнеспособност (a) и активността на PAL (b) в клетъчни култури на C. deserticola при различен осмотичен стрес в хода наCistanche deserticolaклетъчна култура. Стойностите са средни за три колби ± SD

Cistanche deserticolaе пустинен вид и изследването на пустинен вид in vitro клетъчни култури представи нови предизвикателства и възможности за разбиране на физиологията на растенията и екологичните адаптации. В това проучване ние разработихме система с потенциал за изследване на път на биосинтеза на сигнална трансдукция, медииран от осмотичен стрес, и системата предостави основата за широкомащабно производство на PeGs, използвайкиCistanche deserticolaклетъчни култури чрез нова стратегия, регулирана от осмотичен стрес.

Благодарности

Авторите признават финансовата подкрепа от Програмата за изследване на иновациите на Китайската академия на науките.

От: „Подобряване на биосинтезата на фенилетаноидни гликозиди в клетъчни култури от Cistanche deserticola чрез осмотичен стрес“ от Chun-Zhao Liu. Си-Ю Ченг

---Представител на растителни клетки (2008) 27:357–362 DOI 10.1007/s00299-007-0443-3

Препратки

Cheng XY, Wei T, Guo B, Ni W, Liu CZ (2005a)Cistanche deserticolaклетъчни суспензионни култури: биосинтеза на фенилетаноидни гликозиди и антиоксидантна активност. Process Biochem 40:3119–3124
Cheng XY, Guo B, Zhou HY, Ni W, Liu CZ (2005b) Повтарящото се предизвикване повишава натрупването на фенилетаноидни гликозиди в клетъчни суспензионни култури наCistanche deserticola. Biochem Eng J 24: 203–207
Cheng XY, Zhou HY, Cui X, Ni W, Liu CZ (2006) Подобряване на биосинтезата на фенилетаноидни гликозиди в клетъчни суспензионни култури на Cistanche deserticola чрез хитозанов елиситор. J Biotech 121: 253-260
Du NS, Liu JL (1993a) Определяне на фенилетаноидни гликозиди вCistanche deserticolaчрез спектрофотометрия на макроретикуларна смола. Nat Prod Res Dev 5:30–33
Du NS, Wang H, Yi YH (1993b) Изолиране и идентифициране на фенилетаноидни гликозиди отCistanche deserticola. Nat Prod Res Dev 5:5–8
Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK (1956) Колориметрични методи за определяне на захар и свързани вещества. Anal Chem 28: 350-357

Godoy-Hernandez GC, Vazquez-Flota FA, Loyola-Vargas VM (2000) Излагането на транс-канелена киселина на осмотично стресирани клетки на Catharanthus roseus, култивирани в 14-l биореактор, увеличава натрупването на алкалоиди. Biotechnol Lett 22:921–925
Hahlbrock K, Grisebach H (1979) Ензимни контроли в биосинтезата на лигин и флавоноиди. Ann Rev Plant Physiol 30: 105–130
Kim SI, Choi HK, Kim JH (2001) Ефект на осмотичното налягане върху производството на паклитаксел в суспензионни клетъчни култури на Taxus Chinensis. Enzyme Microb Tech 28: 202–209
Koukol J, Conn EE (1961) Метаболизмът на ароматните и свойствата на фенилаланин деаминазата на Hordeum vulgare. J Biol Chem 236: 2692–2698
Lu MC (1998) Проучвания върху седативния ефект наCistanche deserticola.J Ethnopharmacol 59: 161-165

Lu CT, Mei XG (2003) Подобряване на производството на фенилетаноидни гликозиди чрез гъбичен елиситор в клетъчна суспензионна култура наCistanche deserticola. Biotechnol Lett 25:1437–1439
Murashige T, Skoog F (1962) Ревизирана среда за бърз растеж и биотестове с тъканни култури от тютюн. Физиология на растенията 15: 473–497
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Yuan XF, Wang YC (2003) Ефект на редкоземни елементи върху растежа наCistanche deserticolaклетки и производството на фенилетаноидни гликозиди. J Biotechnol 102: 129-134
Shohael AM, Hakrabarty D, Ali MB, Yu KW, Hahn EJ, Lee HL, Paek KY (2006) Повишаване на производството на елеутерозиди в ембриогенни култури на Eleutherococcus sessiliflorus в отговор на индуциран от захароза осмотичен стрес. Process Biochem 41: 512–518
Smith JL, Smart NJ, Kurd WGW, Misawa M (1987) Използването на органични и неорганични съединения за увеличаване на натрупването на индолови алкалоиди в клетъчни суспензионни култури на Catharanthus roseus (L.) Don. J Exp Bot 38: 1507–1511
Steponkus PL, Lanphear FO (1967) Усъвършенстване на метода на трифенил тетразолиев хлорид за определяне на нараняване от студ. Plant Physiol 42:1423–1426 Wang HQ, Wu JT, Zhong JJ (1999) Значително подобрение на производството на таксани в суспензионни култури на Taxus Chinensis чрез стратегия за хранене със захароза. Process Biochem 35: 479–483
Wang XW, Jiang XY, Wu LY, Wang XF (2001) Почистващ ефект на гликозидите наCistanche deserticolaвърху свободните радикали и неговата защита срещу OH-индуцирано увреждане на ДНК in vitro. Chin Pharm J 36:29–31
Wu JY, Wong K, Ho KP, Zhou LG (2005) Подобряване на производството на сапонин в клетъчна култура на Panax ginseng чрез осмотичен стрес и хранене с хранителни вещества. Ензим Microb Technol 36: 133–138
Zhang YH, Zhong JJ, Yu JT (1995) Ефект на осмотичното налягане върху клетъчния растеж и производството на женшен сапонин и полизахарид в суспензионни култури на Panax Notoginseng. Biotechnol Lett 17:1347–1350
Zong GZ, He W, Wu GL, Chen LH (1996) Сравнения междуCistanche deserticolaYC Ma и Cistanche tubulosa (Scheak) Wight някои фармакологични дейности. Tradit Chin Med J 21: 436–438