Подобряване на антиангиогенните ефекти на делфинидин, когато е капсулиран в малки извънклетъчни везикули, част 1

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:(1) Предистория: антоцианинът делфинидин проявява антиангиогенни свойства както в in vitro, така и в in vivo модели на ангиогенеза. Въпреки това, in vivo делфинидинът се абсорбира слабо, поради което неговата скромна бионаличност и стабилност намаляват неговите антиангиогенни ефекти. Настоящата работа се възползва от свойствата на малки извънклетъчни везикули (EV), за да подобри както стабилността, така и ефикасността на делфинидин. Когато е капсулиран в sEVs, делфинидинът инхибира различните етапи на ангиогенезата върху човешки аортни ендотелни клетки (HAoECs). (2) Методи: sEVs от незрели дендритни клетки са произведени и заредени с делфинидин. Приложен е метод, базиран на UHPLC-HRMS, за оценка на метаболитите на делфинидин в sEVs. Тестът за пролиферация, производството на азотен оксид (NO) и анализът на Matrigel бяха оценени в HAoECs. (3) Резултати: Делфинидин, 3-O- -рутинозид и пеонидин-3-галактозид бяха открити и в делфинидин и заредени с делфинидин sEVs.sEV-зареден делфинидин повишава силата на свободния делфинидин 2-кратно за ендотелна пролиферация,10-кратно за ендотелно производство на NO и 100-кратно за образуване, подобно на капиляри . По този начин, sEV-зареден делфинидин упражнява ефекти върху различните етапи на ангиогенезата. (4) Заключения: sEVs могат да се считат за обещаващ подход за доставяне на делфинидин за насочване към заболявания, свързани с ангиогенезата, включително рак и патологии, свързани с прекомерна васкуларизация.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Ключови думи: делфинидин; ендотелни клетки; ангиогенеза; малки извънклетъчни везикули; рак; сърдечно-съдови заболявания

1. Въведение

Полифенолите се намират главно в растителни храни и напитки и осигуряват вкуса и цвета на растителните храни. Освен това, епидемиологичните проучвания съобщават за по-голямо намаляване на сърдечно-съдовия риск и рак, свързани с диети, богати на полифеноли [1-3.

Делфинидин (2-(3,4,5-три-хидроксифенил)хроменилий-3,5,7-триол) е антоцианин, изобилно идентифициран в пигментирани зеленчуци и плодове, особено горски плодове и червено грозде. По-рано съобщихме, че делфинидинът притежава същия фармакологичен профил като общия екстракт от полифенолни съединения на червено вино, за да насърчи повишаването на вътреклетъчната концентрация на калций и активирането на тирозин киназите [3], което води до производство на ендотелен азотен оксид (NO) след естрогенния рецептор алфа (ERo)стимулация [4]. В допълнение, ние съобщихме, че делфинидин чрез ERo действа като имуномодулираща и противовъзпалителна молекула, която може да промени пролиферацията и диференциацията на Т лимфоцитите при пациенти със сърдечно-съдови рискови фактори [5].

И накрая, ние демонстрирахме, че делфинидинът проявява антиангиогенни свойства, както при in vitro, така и при in vivo модели на ангиогенеза, и намалява in vivo туморния растеж на меланома [6-10]. Наистина, делфинидинът инхибира пролиферацията на ендотелните клетки чрез участието на циклин D1- и А-зависимите пътища [6,7]. Ние също така докладвахме за възможна връзка между инхибирането на VEGF-индуцираната митохондриална биогенеза през Akt пътя от делфинидин и неговия антиангиогенен ефект [8]. Освен това, делфинидинът намалява туморния растеж на меланомните туморни клетки in vivo, като действа специфично върху пролиферацията на ендотелни клетки. Механизмът предполага връзка между инхибирането на VEGF-индуцираната пролиферация чрез VEGFR2 сигнализиране, MAPK, PI3K и на ниво транскрипция на CREB/ATF1 фактори и инхибирането на фосфодиестераза2 [9]. Най-интересното е, че високите дози делфинидин намаляват неоваскуларизацията в in vivo модел на ангиогенеза, предизвикана от исхемия, използвайки плъши модел на лигатура на феморална артерия [10]. Заедно тези данни показват, че делфинидинът е обещаващо съединение за предотвратяване на патологии, свързани със сърдечно-съдови заболявания и туморогенеза.

Въпреки това, делфинидинът е по-малко мощен за индуциране на тези благоприятни ефекти в сравнение с общите екстракти от полифеноли от червено вино, особено при индуциране на ендотел-зависима NO-медиирана вазодилатация [11]. Действително делфинидинът е чувствителен към светлина и стабилен само при рН<3; therefore,="" it="" degrades="" rapidly="" under="" physiological="" conditions.="" moreover,="" delphinidin="" is="" poorly="" absorbed,="" and="" thus="" its="" modest="" bioavailability="" and="" stability="" reduce="" its="" effects="" both="" in="" vitro="" and="" in="" vivo.="" the="" measurement="" of="" delphinidin="" and="" its="" conjugated="" metabolites="" in="" plasma="" indicates="" its="" low="" bioavailability="" [12].="" hence,="" it="" is="" important="" to="" find="" new="" strategies="" to="" enhance="" delphinidin="" bioavailability="" and="">

Една стратегия за преодоляване на такива проблеми е използването на извънклетъчни везикули (EVs) като система за доставяне на лекарства. Наскоро открихме, че EVs, включително големи и малки EVs (sEVs), са наноструктури, произхождащи от различни свойства на субклетъчните отделения, преодолявайки ограниченията на класическите наноформулировки. sEV намаляват нестабилността и имуногенността, подобряват бионаличността и целевата селективност [13]. Някои доклади подчертават защитните ефекти на EV, освободени от клетки, третирани с полифеноли. Наистина, sEVs, обогатени с miR-21 от клетки, третирани с куркумин, намаляват растежа на туморните клетки и ангиогенезата, коригират ендотелната пропускливост и намаляват клетъчната жизнеспособност на различни ракови клетъчни линии [14]. В допълнение, miR-16-обогатени sEVs от клетки, третирани с епигалокатехин галат, потискат туморния растеж [15].

Cistanche може да подобри имунитета

В настоящото изследване ние се възползвахме от свойствата на sEV, за да повишим както стабилността, така и ефикасността на делфинидин. Индуцирано от sEV инхибиране на ангиогенезата на делфинидин, използвайки човешки аортни ендотелни клетки (HAoECs). Съдържанието на делфинидин по отношение на метаболитите в тези EVs също беше определено.

2. Материали и методи

2.1.Клетъчна култура

HAoECs (Promocell, Хайделберг, Германия) се култивират при 37 градуса и 5 процента CO2 в среда за растеж на ендотелни клетки MV2 (Promocell), допълнена с 1 процент пеницилин/стрептомицин (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Франция). Клетките се трипсинизират при 70/80 процента сливане и се използват между пасажи 3 и 6 за всички експерименти.

Дендритната клетъчна линия JAWS II е закупена от American Type Culture Collection (CRL-1194; ATCC; Manassas, VA, USA). Клетките JAWS II се отглеждат при 37 градуса и 5 процента CO в пълна културална среда, съставена от алфа минимална основна среда (Lonza; Basel, Швейцария), съдържаща рибонуклеозиди и дезоксирибонуклеозиди и допълнена с 20 процента фетален говежди серум (FBS) (Gibco, Life Technologies; Гранд Айлънд, Ню Йорк, САЩ), 4 mM L-глутамин (Lonza), 1 mM натриев пируват (Lonza), 1 процент пеницилин/стрептомицин (пеницилин/-стрептомицин, Sigma-Aldrich) и 5 ​​ng/mL миши GM-CSF (Miltenyi Biotec; Сан Диего, Калифорния, САЩ). Клетките се трипсинизират при 70/80 процента сливане и се използват между пасажи 8 и 16 за всички експерименти.

2.2.sEVIзолация

Клетките JAWS II се посяват при плътност от 5 × 10 градуса клетки в колба за клетъчна култура T175 в пълна растежна среда и те са гладували в FBS преди каквато и да е изолация. Клетъчната среда се центрофугира при 300 × g и 2 000 × g за 10 минути, за да се отстранят съответно клетките и клетъчните остатъци. Полученият супернатант се центрофугира при 20, 000 × g за 30 минути, за да се изключат големи EV. Супернатантът се центрофугира при 200,000×g (ултрацентрофуга Optima MAX-XP и MLA-50 ротор, Beckman Coulter, Villepinte, Франция) в продължение на 2 часа за пелетизиране на sEVs. След това sEVs се промиват във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO410 mM, KH2PO41,8 mM, pH =7.4) и се центрофугират повторно при 200 000 × g за 2 часа. Накрая sEV пелетите се ресуспендират в 1 mL PBS и се съхраняват при 4 градуса до следваща употреба. Количеството sEVs се определя с помощта на метода на Lowry, с говежди серумен албумин (Sigma-Aldrich) като стандарт. sEVs се използват при 10 ug/mL.

2.3. Delphinidin Зареждане

Делфинидинът се приготвя във вода при pH{{0}} с {{10}}.1 процента DMSO, за да се достигне концентрация от 10 ug/mL. Добавят се sEVs (2 mg) и разтворът се разбърква и след това се завихря в продължение на 10 минути. След 2 часа ултрацентрофугиране при 200,000×g, получената пелета се разтваря в 1 mL от 0,1 процента DMSO или PBS. Абсорбцията на делфинидин се измерва при 530 nm и се прави стандартна крива с различни концентрации (0.1 до 10 ug/mL) свободен делфинидин. Процентът на ефикасността на натоварването на sEVs е 9 процента, независимо от концентрацията на използвания делфинидин (данните не са показани). По този начин, количеството на делфинидин се коригира, за да се получи желаната концентрация (0.1 до 5 ug/mL) в рамките на 10 ug/mL sEVs. За да се отстрани свободният делфинидин, тези везикули се промиват два пъти.

2.4. Анализ на проследяване на наночастици (NTA)

SEV пробите бяха разредени в стерилен NaCl0.9 процента и разпределението по размер беше анализирано с помощта на NanoSight NS300 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK). Бяха записани видеоклипове. Софтуерът на NTA определи разпределението на размера, използвайки уравнението на Stokes-Enstein.

2.5. Трансмисионна електронна микроскопия

sEV първо бяха фиксирани за една нощ при 4 градуса с 2,5 процента глутаралдехид (LFG Distribution, Лион, Франция) в 0.1 М PBS. След това sEVs се промиват два пъти в PBS чрез 100,000×g центрофугиране за 70 min.sEVs се отлагат върху медни решетки за 2 min и се оцветяват отрицателно с 20 μL уранил ацетат 5 процента (разреден в етанол 50 процента ) за 30 s. След това решетките се наблюдават с микроскоп Jeol JEM 1400 (Jeol, Croissy sur Seine, Франция), работещ при 120 keV.

2.6. Определяне на метаболити на делфинидин в sEVs

Приготвянето на пробата е както следва: 250 μL метанол (MeOH) се добавят към 10 ug sEVs, разтворени в PBS, и пробите се подлагат на 20 минути ултразвукова обработка. Допълнително се добавят двеста uL МеОН и пробите се центрофугират (10, 000 × g, 10 минути, 4 градуса) и се изпаряват в miVac duo концентратор (Genevac Ltd., Ipswich, UK). Сухият екстракт се възстановява с 200 μL вода с клас LC-MS, съдържаща 1% мравчена киселина. Сместа беше подложена на второ центрофугиране (10, 000 × g, 5 минути, 4 градуса) преди течна хроматография със свръхвисока производителност, свързана с мас спектрометричен анализ с висока разделителна способност (UHPLC-HRMS), за да се анализира метаболити на делфинидин с точни измервания на масата.

Хроматографското разделяне беше постигнато с колона Kinetex@ 1.7 μm XB C18,150×2.1 mm заедно със съответната колона SecurityGard C18 (Phenomenex). Подвижните фази се състоят от Н2О в канал А и ацетонитрил в канал В, като и двете съдържат 0.1 процента мравчена киселина. Градиентът на елуиране（A∶B, o/ø） беше както следва∶ задържане на първоначални условия 95:5 за 2 минути, последвано от линеен градиент от 95:5 до 0:100 през период от 6 минути, задръжте при 0:100 за 3 минути, върнете се към първоначалните условия 95:5 и задръжте тези условия за 3,5 минути. Използва се постоянна скорост на потока от 0.300 mL/min; инжекционният обем беше 10 μL.

Пълно сканиране и целеви масспектри на SIM бяха получени в режим на положителна йонизация, като се използва разделителна способност 70, 000 Пълна ширина при половин максимум (FWHM) с цел за автоматичен контрол на усилването (AGC) от йони 3 × 10 градуса и максимално инжектиране на йони време (IT) от 200 ms. Зависещите от данни MS/MS експерименти бяха получени в режима, зависим от данните на Top5.

Метаболитите, докладвани в литературата [16-18], са наблюдавани: делфинидин, алдехид, флороглюцинол алдехид, галова киселина, халкон, петунидин-3-галактозид, петунидин-3-арабинозид, петунидин {{4} }О-рутинозид, делфинидин-3-арабинозид, делфинидин-3-галактозид, делфинидин 3-О-(6-кумароилглюкозид),делфинидин 3-О- - рутинозид, цианидин-3-галактозид, цианидин 3-O- -рутинозид, пеонидин-3-галактозид и малвидин-3-галактозид.

Ежедневното калибриране на инструмента се извършва чрез инфузия на Pierce LTO Velos ESI комплекти за положително/отрицателно калибриране, както се препоръчва от производителя. Софтуерът Xcalibur 2.2 (Thermo Fisher Scientific, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) беше използван за събиране на данни, а софтуерът TraceFinder 3.0 (Thermo Fisher Scientific) беше използван за обработка на данни.

2.7. Анализ на клетъчната жизнеспособност

1 ×104 HAoECs се посяват върху 96-плака с ямки и се култивират в продължение на 24 часа и се третират с делфинидин (1 до 10 ug/mL). След това, 5 ug/mL 3-（4,5-диме-тилтиазол-2-ил）-5-（3-карбоксиметоксифенил)-2-({ {15}}сулфофенил)-2Н-тетразолий (MTS реагент, Promega, WI, USA) се добавя във всяка ямка и се инкубира при 37 градуса за 120 минути. Абсорбцията се измерва на спектрофотометър CLARIOstar (BMG LABTECH, Ortenberg, Германия) при 490 nm.

2.8. Тест за разпространение

Тестовете за пролиферация бяха проведени с помощта на CyQUANT Cell proliferation Assay kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в съответствие с препоръките на производителя. Накратко, 1.5 × 10* клетки бяха посяти в 96-ямкова плака. Клетките бяха серумно гладни в продължение на 2 часа и след това третирани с делфинидин, нативни sEVs или sEVs, заредени с делфинидин при различни концентрации. След 24 часа инкубация, клетките се промиват с PBS и се добавя разтвор за свързване на багрилото. Клетките се инкубират при 37 градуса за 30 минути. Флуоресцентен четец на микроплаки (CLARIOstar9, BMG LABTECH, Ортенберг, Германия) с филтри за 485 nm възбуждане и 530 nm излъчване беше използван за измерване на флуоресценцията.

2.9.БЕЗ производствен анализ

HAoEC бяха посяти върху 8-слайд с ямки （Ibidi, Gräfelfing, Германия） със скорост 3 × 104 клетки на ямка （т.е. 3 × 104 клетки/cm²） в 300 μL от средата. При 70-80 процента сливане, клетките бяха стимулирани в продължение на 24 часа с делфинидин, естествени sEVs или sEV-зареден делфинидин. Аденозин трифосфат (ATP) се използва като положителна контрола (10 μM, Sigma-Aldrich) за стимулиране на производството на NO. След 24 часа средата от всяка ямка се отстранява и сондата диаминофлуоресцеин диацетат （DAF-2 DA） се добавя （5 μM за 30 минути, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). След това ямките се промиват с PBS. Клетките се фиксират с параформалдехид (4 процента, 20 минути). Флуоресценцията се чете чрез конфокална микроскопия (Zeiss, Йена, Германия, LSM700). Бяха получени четири снимки и софтуерът ImageJ беше използван за количествено определяне.

2.10.Матригел анализ

HAoEC се посяват в ямки, покрити с Matrigel (гел от извънклетъчен матрикс на миши сарком на Engelbreth-Holm-Swarm, Sigma-Aldrich). Накратко, 10 μL течен Matrigel се поставят във всяка ямка на 15-ямка Ibidi μ- плъзнете плака за ангиогенеза (lbidi) и след това се инкубират за 45 минути при 37 градуса, за да се образува гел. След това HAoECs се посяват и инкубират при 37 градуса и 5 процента CO за 45 минути преди третиране или с делфинидин, естествени sEVs или sEV-зареден делфинидин , последвано от инкубиране от 12 до 14 часа при 37 градуса и 5 процента CO. Образуването на "капиляроподобни структури" се наблюдава с оптичен микроскоп (Olympus CK40). Количественото определяне се извършва чрез измерване на броя на капиляроподобните структури с помощта на Софтуер за изображения.

2.11.Статистически анализ

Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. Значимостта на разликите между групите се определя чрез анализ на дисперсията (ANOVA), последван от теста за множество сравнения на Tukey. p-стойности на<0.05 were="" considered="">

3. Резултати

3.1.sEV Характеризиране и зареждане на Delphinidin

В съгласие с литературата, делфинидин, зареден в рамките на sEVs, не предизвиква промени в размера на везикулите, като е 118,7± 2,9 и 111,7± 1,8 nm за празни sEVs и sEVs, заредени с делфинидин, съответно, както е определено чрез анализ за проследяване на наночастици (Фигура 1A) и потвърдено чрез електронен микроскопски анализ (Фигура 1B). В допълнение, и двата вида sEVs, естествени и тези, заредени с делфинидин, експресират екзозомални маркери като ALIX, CD63 и TSG101 на подобни нива (Фигура 1C), докато те не експресират ß-актин, маркер на големи EVs.

Фигура 1. Характеризиране на sEVs. (A) Разпределение на размера на естествените sEVs и sEVs, заредени с делфинидин, на базата на NTA измервания. (B) Представителен трансмисионен електронен микроскопски образ на естествени sEV и sEV, заредени с делфинидин. Скала =100 nm. (C) Western Blot анализ, показващ експресията на Alix, CD63, TSG101 и ß-Actin в sEVs и sEVs, заредени с делфинидин.

Тази статия е извлечена от Nutrients 2021, 13, 4378. https://doi.org/10.3390/nu13124378