Проучване на потенциала на екстракти от исландски морски водорасли, произведени чрез водна импулсна екстракция с помощта на електрически полета за козметични приложения, част 2

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

2.4. Антиоксидантен капацитет на екстракти от исландски морски водорасли

A.esculenta има най-силната DPPH почистваща активност сред суровите екстракти от трите вида водорасли (p<0.05), with="" scavenging="" effects="" higher="" than="" 90%(table="" 3).="" compared="" with="" the="" different="" standard="" solutions,="" a.esculenta="" showed="" comparable="" scavenging="" activity="" as="" 100ug/ml="" of="" ascorbic="" acid="" (87.9%),="" gallic="" acid="" (91.0%),="" and="" α-tocopherol="" (87.9%).="" our="" results="" were="" in="" agreement="" with="" recent="" studies="" [50],="" which="" also="" reported="" a="" positive="" antioxidant="" activity="" of="" a.esculenta="" extracts.="" surprisingly,="" no="" significant="" differences="" in="" antioxidant="" activity="" were="" observed="" between="" the="" different="" extraction="" methods="" tested="" (p="">0.05). Очакваше се, че PEF екстрактите ще покажат по-добри антиоксидантни стойности от екстрактите, произведени с гореща традиционна екстракция, тъй като други проучвания показват, че зелени техники (като екстракция с помощта на микровълни или ензимна екстракция) могат ефективно да избегнат разграждането на биоактивни съединения, показвайки по-високи антиоксидантни активности [59,60].

Способността на екстрактите от морски водорасли да редуцират фери (Fe8#) до железни (Fe2 плюс) йони и способността за отстраняване на радикала ABTS също беше изследвана, съответно чрез метода FRAP и ABTS. Резултатите от FRAP показват сходни тенденции с DPPH, показвайки, че A. esculenta има най-силната способност да редуцира фери (Fe3 плюс) до железни (Fe2 плюс) йони сред суровите екстракти от трите вида водорасли (p<0.05). however,="" a="" different="" behavior="" was="" found="" for="" the="" abts.="" all="" seaweed="" extracts="" showed="" a="" similar="" ability="" to="" scavenge="" the="" radical="" abts="" (p="">0.05), което показва, че тези видове вероятно съдържат някои ефективни съединения, които са отговорни за тяхната пречистваща дейност.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Като цяло е известно, че кафявите водорасли имат по-висок антиоксидантен потенциал в сравнение с червените и зелените семейства [61]. Нашите резултати също така показаха, че водните екстракти от A. esculenta показват ефективни антиоксидантни действия по отношение на отстраняването на свободните радикали и намаляването на мощността, което предполага, че A. esculenta потенциално може да бъде източник на естествени антиоксиданти. Високата антиоксидантна активност, наблюдавана при екстрактите от A.esculenta, може да бъде свързана с високото съдържание на фенолни съединения, определени в екстрактите от кафяви водорасли. В много проучвания антиоксидантната активност на екстрактите от водорасли се приписва на фенолните съединения, показвайки положителни корелации между съдържанието на фенол и капацитета за почистване най-вече с DPPH [62,63]. Подобни корелационни резултати бяха открити в настоящото проучване за екстракти от A.esculenta (вижте по-добра дискусия в раздел 2.6. Корелации между химични съединения и биоактивни свойства).

2.5. Ензуматични инхибиторни активности на екстракти от исландски морски водорасли

Екстрактите от исландски морски водорасли показват положителни инхибиторни ефекти спрямо всички тествани ензими (Таблица 4), откривайки нови пътища за използване на естествени ензимни инхибитори от източници на водорасли. Доколкото ни е известно, това е първият път, когато са тествани ензимни инхибиторни активности на екстракти от исландски морски водорасли, произведени от PEF.

купи цистанче

2.5.1. Инхибираща активност на колагеназата

Екстрактите от A.esculenta показват положително инхибиране на колагеназата, вариращо от 68 до 91 процента, докато екстрактите от P. palmaria и U. Lactuca показват незначителна активност на инхибиране срещу колагеназа (Таблица 4). Екстрактът от гореща вода на A.esculenta показва 71,1 процента активност на инхибиране на колагеназа, което е по-висок от стандартния разтвор на епигалокатехин-3-галат (EGCG) (63,2 процента) и сравним с положителния стандарт, осигуряван от търговския ензимен комплект (74,9 процента). Важно откритие е, че екстрактите от A.esculenta, произведени от PEF, показват инхибиране на колагеназата от 91 процента, показвайки дори по-висока активност от инхибитора, предоставен от търговския комплект. Трябва да се подчертае, че тази активност се наблюдава само във водните екстракти, произведени от PEF, а не от комбинацията от PEF плюс HW. Това поведение може да се обясни с възможността процесът с гореща вода да има отрицателен ефект върху съединенията, отговорни за инхибирането на колагеназната активност. Въпреки това са необходими допълнителни проучвания, за да се обяснят тези резултати поради сложността на суровите екстракти от водорасли. Гореспоменатата изследователска група в момента работи върху идентифицирането на инхибиращите молекули в екстрактите от A.esculenta, за да разбере по-добре тези положителни ефекти, произведени от PEF.

Cistanche може да спре стареенето

Резултатите по отношение на инхибирането на колагеназата от екстракти от A.esculenta са в съответствие с предишни данни, в които A.esculenta се използва в търговски екстракти поради неговия ефект против стареене. Разграждането на колагена настъпва със стареенето поради активността на колагеназата, което води до бръчки по кожата. Инхибирането на колагеназата от естествено срещащи се съединения е интересна възможност за продуктите против стареене. Например SEPPIC, доставчик на съставки за козметичната индустрия, предлага липофилен екстракт от A.esculenta (Kalpariane AD) [64].

2.5.2. Еластазна инхибираща активност

Only the crude extracts of A.esculenta inhibited elastase, exhibiting activities higher than 70% of inhibition (Table 4). However, the anti-elastase activities of A.esculenta extracts did not statistically differ among extraction methods (p>{{0}}.05). В сравнение с разтвори на кверцетин, добре известен инхибитор на еластаза, който показва 100 процента инхибиране при 1 mM и 58,7 процента при 0,5 mM, ефективността на екстрактите от A. esculenta е висока.

Еластазата е протеиназен ензим, който може да намали еластина чрез разкъсване на специфични пептидни връзки. Следователно, инхибирането на еластазната активност в слоя на дермата може да се използва за поддържане на еластичността на кожата [65]. Много растителни екстракти са идентифицирани като инхибитори на еластаза [17]; въпреки това са проведени малко изследвания върху инхибирането на еластазата от ресурси от водорасли. Според литературни данни е известно, че полифенолите, извлечени от растения, са силни инхибитори на еластаза и хиалуронидаза [66]. Скорошно проучване съобщава, че флоротанините, типът танин в кафявите водорасли, екстрактите от морски водорасли Eisenia bicycles и кафявите водорасли Ecklonia cava, благоприятстват кожата, като значително намаляват активността на еластазата [67]. Екстрактите от A.esculenta, произведени в това проучване, показват най-високите стойности на TPC и TFC в сравнение с другите изследвани видове (Таблица 4), така че това може да е причината, поради която водните екстракти от P. palmaria и U. Lactuca не показват анти- еластазни дейности. За да се потвърди тази хипотеза, беше проведен корелационен анализ на Pearson, който предполага, че антиензимните активности корелират положително със съдържанието на фенолни вещества (вижте допълнителна дискусия в Раздел 2.6. Корелации между химични съединения и биоактивни свойства).

2.5.3. Инхибираща активност на тирозиназата

Екстрактите от A.esculenta показват положително инхибиране на тирозиназата над 90 процента за всички използвани методи за екстракция, докато екстрактите от P.palmaria и U. Lactuca не показват инхибиторни ефекти върху тирозиназата (Таблица 4). Въпреки това, антитирозиназните активности на екстрактите от A.esculenta не се различават (стр<0.05) with="" extraction="" methods.="" comparing="" the="" effect="" of="" a.esculenta="" extracts="" with="" the="" quercetin="" solutions="" tested,="" the="" crude="" extracts="" of="" the="" brown="" algae="" showed="" better="" inhibitory="" activities="" than="" these="" solutions(88="" and75%="" for="" the="" 0.5="" and="" 1="" mm="" quercetin="" solutions,="" respectively).="" based="" on="" the="" literature,anti-tyrosinase="" activities="" of="" plants,="" bacteria,="" and="" fungi="" have="" been="" reported="" by="" several="" researchers="" i68i.="" however,="" though="" different="" studies="" suggest="" that="" bioactive="" compounds="" derived="" from="" marine="" algae="" have="" a="" good="" potential="" to="" be="" utilized="" as="" skin="" whitening="" agents="" [13],="" this="" is="" still="" an="" unexplored="" domain="" and="" only="" a="" few="" studies="" have="" been="" carried="" out.="" most="" of="" the="" studies="" performed="" in="" this="" area="" have="" been="" focused="" on="" brown="" algae,="" agreeing="" with="" the="" results="" of="" the="" present="" study="" in="" which="" a.esculenta="" extracts="" exhibited="" the="" best="" anti-tyrosinase="" activities.="" for="" instance,="" phloroglucinol="" derivatives="" and="" phlorotannins,="" common="" secondary="" metabolites="" found="" in="" brown="" algae,="" have="" shown="" inhibitory="" activity="" against="" tyrosinase="" due="" to="" their="" ability="" to="" chelate="" copper="" [69].="" in="" a="" recent="" study,="" the="" extract="" of="" the="" brown="" algae="" lessonia="" trabeculate="" produced="" by="" microwave-assisted="" extraction="" inhibited="" a="" tyrosinase="" activity="" of="" 33.73%[60].in="" another="" study,="" the="" extract="" of="" the="" brown="" algae="" turbinaria="" conoides="" showed="" activity="" as="" an="" antioxidant="" and="" tyrosinase="" inhibitor,="" however,="" in="" this="" case,="" ethanol="" was="" used="" as="" solvent="" [70].="" a="" significant="" correlation="" between="" the="" inhibitory="" potency="" of="" polyphenols="" extracted="" from="" plants="" on="" mushroom="" tyrosinase="" has="" been="" reported="" in="" previous="" studies="" [68].="" likewise,="" the="" results="" of="" this="" study="" suggest="" that="" the="" inhibitory="" activity="" towards="" tyrosinase="" was="" positively="" correlated="" with="" flavonoid="" and="" phenolic="" content="" (see="" section="" 2.6.="" correlations="" between="" chemical="" compounds="" and="" bioactive="">

цистанче แอ ม เว ย์

Тирозиназата играе важна роля в биосинтезата на пигмент меланин в кожата. Меланинът е отговорен за защитата срещу вредното ултравиолетово лъчение, което може да причини няколко патологични състояния [71]. Освен това може да създаде естетически проблеми, когато меланинът се натрупа като хиперпигментирани петна [72]. По този начин, включването на инхибитори на тирозиназа в козметични продукти може да бъде привлекателно поради избелващи и/или изсветляващи ефекти.

2.5.4. Хиалуронидазна инхибираща активност

Всички екстракти от морски водорасли показват значително висока антихиалуронидазна активност (Таблица 4), показвайки сравними резултати с разтворите на танинова киселина (добре известен инхибитор на хиалуронидазата). По-конкретно, екстрактите от A.esculenta показват 100 процента инхибиране за всички тествани методи. Освен това, екстрактите от U. Lactuca показват дейности, по-високи от 90 процента от инхибирането, където инхибирането на екстрактите, произведени от PEF (96,8 процента o) и комбинацията от PEF плюс HW (97,3 процента), е по-високо от инхибирането, произведено от традиционните горещи воден метод 93,4 процента)(стр<0.05). all="" p.palmaria="" extracts="" exhibited="" similar=""><0.05), the="" inhibition="" of="" the="" extracts="" produced="" by="" pef="" was="" (91.9="" %)and="" the="" combination="" of="" pef+hw="" (89.5%)="" and="" the="" traditional="" hot="" water="" method="">

Други автори също описват антихиалуронидазната активност на различни екстракти от морски водорасли, особено екстракти, богати на флоротанини от кафяви водорасли [73,74]. Въпреки това, доколкото ни е известно, това е първият път, когато се съобщава за инхибиторна активност на хиалуронидазата на екстракти от P.palmata и U. Lactuca, произведени от PEF.

Хиалуроновата киселина е основен компонент на дермата, където участва в възстановяването на тъканите, разгражда се със стареенето, причинявайки бръчки и загуба на стегнатост на кожата. В този смисъл инхибиторите на хиалуронидазата повишават нивото на хиалуроновата киселина в дермалния извънклетъчен матрикс за подобряване на външния вид на стареещата кожа на лицето [13].цистанчСледователно резултатите от това проучване могат да отворят нови пътища за използване на естествени инхибитори на хиалуронидаза от водорасли с потенциална употреба в козметични продукти.

В обобщение, събраните данни ни позволиха да заключим, че екстрактите от A.esculenta показват като цяло по-добра инхибиторна активност спрямо тестваните ензими спрямо P.palmaria и U.lactuca. По този начин, като най-обещаващия вид водорасли с отлични анти-ензимни активности и затова беше избран за по-нататъшни изследвания в нашата лаборатория. Въпреки че суровите екстракти от A. esculenta изглеждат добри кандидати за in vitro експерименти, трябва да се проведат допълнителни изследвания, за да се изясни идентичността на метаболитите, отговорни за тези биологични ефекти.

2.6. Корелации между химични съединения и биоактивни свойства

Резултатите от анализа на главните компоненти (PCA) показват, че основното разделяне на групите е определено от PC1 и PC2, което представлява съответно 71,9% и 14,5% от вариацията в данните (Фигура 2). Екстрактите от A.esculenta се характеризират с по-високо съдържание на флавоноиди и фенолни съединения, инхибиторни ефекти върху ензимите (колагеназа, тирозиназа и еластаза) и стойности на DPPH и FRAP, отколкото другите видове, P. palmata и U.lactuca. От друга страна, A.esculenta има по-ниско съдържание на въглехидрати, особено в сравнение с P. palmitate (който се намира от противоположната страна на PC1). Вариацията в данните по PC2 е свързана главно с ABTS и инхибирането на хиалуронидазата. Както е посочено от местоположението на графиката, P. palmitate има по-силна корелация с ABTS, докато U.lactuca е по-свързан с ефектите на инхибиране на хиалуронидазата в сравнение с тези два вида.

Висока и значима положителна корелация между TPC, TFC, DPPH, FRAP и инхибиторни ефекти върху колагеназа, еластаза и тирозиназа беше демонстрирана чрез корелационен анализ на Pearson (Таблица 5).

колко цистанче да приемате

Това е в съгласие с предишни проучвания, съобщаващи, че фенолните съединения (включително флавоноиди) са основният фактор, допринасящ за антиоксидантната активност на различни морски водорасли [75-77]. Високата антиоксидантна активност на екстрактите от кафяви макроводорасли е свързана със специфична група полифеноли, флоротанини и тяхната уникална молекулярна структура. Съобщава се, че флоротанис от кафяви водорасли има до осем взаимосвързани фенолни пръстена, които действат като уловители на електрони [78,79]. Очакваше се, че ABT ще корелира с TPC и други антиоксидантни параметри. Възможни причини може да са, че методите се основават на различни реакционни условия и че реактивността се различава както по отношение на времето, така и по отношение на обхвата на компонентите. Например, ABTS реагентът реагира с по-широк диапазон от антиоксиданти, отколкото DPPH радикала [80]. От друга страна, едно от споменатите ограничения за ABTS е дългата реакция и общото време за реакция може да не позволи достигане на крайна точка.

Резултатите показват, че има висока положителна корелация между TPC и TFC към инхибиторната активност на колагеназата, еластазата и тирозиназата ({{0}}.93-0).99), докато връзката с инхибирането на хиалуронидаза не е толкова силен (r=0.42 и 0.54, съответно). Това показва, че други компоненти може да са допринесли за инхибиращия ефект на екстрактите. Други проучвания съобщават, че полизахаридите имат хиалуронидаза-инхибиторна активност, например алгиновата киселина в кафявите водорасли [81,82]. Необходими са допълнителни проучвания върху химичния състав на видовете макроводорасли за ефектите на изолирани съединения върху ензима, за да се оцени приносът на всеки химичен компонент, тъй като в това изследване фокусът беше върху суровите екстракти. Констатациите са в хармония с предишни проучвания, като се посочва, че химичният състав и нивата на биоактивност на екстрактите варират значително между трите линии (червени, зелени и кафяви водорасли) и между различни видове, принадлежащи към един и същ тип и се влияят от възрастта и тип тъкан. Освен това съставът и характеристиките зависят от много фактори на околната среда, влияещи върху разпространението и растежа на макроводораслите. Например светлина (UV-лъчение), температура, наличие на хранителни вещества, излагане на въздух, движение на водата, излагане на вълни и соленост. Температурата е описана като фактор, който има най-силен ефект върху образуването на пигмент и концентрацията на хранителни вещества, солеността и UV радиацията като фактори, влияещи върху концентрацията на TPC [83].

Разпределението на различните видове макроводорасли варира в зависимост от дълбочината на водата. Позициите по-високо на брега в приливната или крайбрежната зона са по-стресиращи, тъй като видовете, растящи там, трябва да издържат на множество промени в абиотичните фактори, дължащи се на промени в прилива. Например изсушаващият ефект на въздуха, високото слънчево излъчване (при отлив), промените в солеността и температурата и, при условия на ниски температури на въздуха, включително замръзване. Под отметката за ниска вода увеличаването на дълбочината води до много бързо намаляване на интензитета на светлината и по-малко излагане на излъчване.

какво е цистанче

Водораслите, растящи в диапазона на приливите и отливите, имат по-ниска чувствителност към UV радиация и се възстановяват по-бързо от слънчевия стрес. Докато водораслите, растящи в сублиторалната зона, са по-чувствителни към UV радиация и имат по-ниско възстановяване от слънчевия стрес [84]. В същото време водният стълб осигурява защита. В настоящото проучване излагането на слънчева светлина вероятно е по-силно за P. palmitate в сравнение с другите видове. Други проучвания показват, че образуването на MAAs е пряко свързано със слънчевата светлина [85], защитавайки организмите срещу UV-A и UV-B радиация. Освен това беше показано, че специфичното количество MAAs намалява с увеличаване на дълбочината на събиране. Известно е, че водорасли, като A.esculenta, растат в горната сублиторална зона, но също така се простират в най-ниската междуотливна зона точно над нивото на ниската вода. Това означава, че водният стълб осигурява по-силна защита, отколкото за P. palmitate. Освен това морфологичните характеристики са различни, остриетата на A.esculenta са по-дебели в сравнение с другите два вида. потребителски интерфейс. lactuca, растящ главно в интертидала и сублиторала, е в състояние да фотосинтезира и да расте при много ниска радиация. Твърди се, че излагането на UVB светлина ускорява възстановяването на фотосинтетичните параметри на U.lactuca от отрицателните ефекти на UVA светлината. Той е по-малък, с по-проста структура и с по-кратък живот (3 месеца) както от A.esculenta (5-7 години), така и от P. palmata, който има нов растеж всяка година.

В обобщение може да се направи предположението, че основните разлики в свойствата на екстрактите са вариациите в продължителността на живота, морфологичните характеристики и условията на растеж на видовете водорасли.

3. Материали и методи

3.1. Материали

Исландските водорасли U.lactuca (зелени водорасли), A.esculenta (кафяви водорасли) и P. palmitate (червени водорасли) са предоставени от Icelandic Blue mussels and Seaweed, които събират морски водорасли в Breidafjordur (Западна Исландия). След прибиране на реколтата морските водорасли бяха изсушени (до приблизително 90 процента сух материал), смлени и доставени вакуумно опаковани. Пробите се съхраняват на сухо и тъмно място при стайна температура до употреба.

Тирозиназа от гъби, L-3,4-дихидроксифенилаланин (L-DOPA), еластаза от свински панкреас, аскорбинова киселина, N-сукцинил-Ala-Ala-Ala-p-нитроанилид (AAPVN), хиалуронидаза от говежди тестиси, кверцетин, a-токоферол, танинова киселина, 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH),2.4,6-трипиридил-s-триазин (TPTZ), тролокс, фолин- Реагент Ciocalteu, галова киселина и комплект за колориметричен анализ на колагеназна активност (MAK293) бяха закупени от Sigma-Aldrich Co. (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Натриевата сол на хиалуроновата киселина е закупена от MakingCosmetics (Redmond, WA, USA). Всички други използвани химикали и реагенти са с аналитичен клас и са получени от VWR International, LLC. Дейонизирана вода (Elix Essential, Merck, Darmstadt, Германия) се използва за екстракция и приготвяне на разтвори на водна основа.

3.2. Експериментален дизайн

Използван е факторен дизайн за оценка на ефектите от видовете исландски морски водорасли (U. Lactuca, A. esculenta, P. palmitate) и екстракционна обработка (екстракция с гореща вода (HW,95 градуса), екстракция с помощта на PEF (PEF) и комбинацията на двете техники (PEF плюс HW), върху състава на екстракта и биоактивността (Таблица 6).Екстракцията беше извършена в три екземпляра за всяка група и всеки репликат на екстракт беше анализиран в три екземпляра.

биофлавоноид

3.3. Извличането на биоактивни вещества от исландските водорасли

Експлоатацията на биомаса от макроводорасли на различни нива мотивира учените да изследват по-екологични, ефективни и рентабилни техники за извличане, базирани на подходи за екологично извличане. В тази работа екстракцията с помощта на PEF беше оценена като нов и екологичен метод за производство на функционални екстракти, докато традиционната екстракция с гореща вода беше използвана за сравнение. Освен това е проучен ефектът от комбинацията от двете техники, PEF обработка на макроводорасли, последвана от традиционната екстракция с гореща вода, върху биоактивното възстановяване. Поради очакваната електропорация, произведена в клетъчните мембрани след физическата обработка, последващата екстракция с гореща вода може допълнително да улесни освобождаването на вътреклетъчния материал [86], увеличавайки полето на екстракция. Необходимо е време след третирането, за да дифундират материалите от клетките [87,88] и в този експеримент суспензиите изчакаха една нощ до отделянето на течността (екстракт) от пулпата.

По отношение на екстракционната среда, дестилирана вода е използвана за производството на екстракти от морски водорасли, за да се преодолеят ограниченията относно използването на токсични вещества и органични разтворители. Водата се оказа добър разтворител за извличането на няколко биоактивни съединения от морски водорасли [46, 89-91] и е екологична. В допълнение, водата обикновено се използва за екстракция с помощта на PEF, тъй като е добър проводник за електричество.

3.3.1. Процедури за извличане

За всяко повторение във всяка група, водорасли (15 g) се накисват за една нощ при стайна температура (22 градуса) в дейонизирана вода (300 mL). След това суспензията беше обработена с PEF (PEF), нагрята (HW) или едновременно обработена с PEF и нагрята (PEF плюс HW). Суспензиите се държат една нощ в хладилник, последвано от филтруване с груба (20 um) филтърна хартия. След това филтратите (екстракти) се съхраняват при 4 градуса до анализите им.

Екстракцията с помощта на импулсно електрическо поле беше извършена с помощта на импулсен генератор, построен вътрешно. Имаше кондензатор FuGHCK-200-2000 (Fu.G.Elektronik GmbH, Розенхайм, Германия) и искров разряд (18,5 kV OG75, Perkin-Elmer Optoelectronics, GMBH, Wiese-baden, Германия). PEF оборудването генерира експоненциални импулси на затихване с ширина 0.96 us и амплитуда 18 kV. Камера за третиране от плексиглас с размери (Д × В × Ш) 20 × 8 × 2,5 cm, като най-късото разстояние е между пластинчатите електроди, се използва за третиране на суспензиите с 8 kV/cm електрическо поле при 1,2 Hz за 10 минути . HW екстрактите се приготвят чрез нагряване на суспензията в чаша в термостатна водна баня и се поддържат при 95 градуса за 45 минути. За комбинираното импулсно електрическо поле и нагряване, суспензиите се третират с PEF и след това се поставят в бехерова чаша, нагряват се на водна баня и се държат при 95 градуса за 45 минути.

3.3.2. Измервания на проводимост, pH и температура

Електрическата проводимост и pH на суспензиите от морски водорасли бяха измерени след накисване и след екстракционните обработки, при стайна температура, с помощта на pH метър (Orion StarTM A215 pH/Conductivity Benchtop Meter, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), оборудван със сензор за проводимост и pH/ARC триоден комбиниран електрод. Освен това бяха записани температурни промени, дължащи се на третиране.

3.4. Спектрални профили на екстрактите от морски водорасли

UV-VIS абсорбционните спектри на различните екстракти от морски водорасли бяха измерени в диапазона от 200 до 450 nm с помощта на двоен лъч Thermo Scientific Evolution 350 UV-Vis спектрофотометър (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) с 1 cm кварцови кювети. Извършени са три сканирания за всеки екстракт от морски водорасли.

3.5. Определяне на общо полифенолно съдържание

Общото фенолно съдържание (TPC) в екстрактите от морски водорасли се определя чрез използване на реагент Folin-Ciocalteu, следвайки леко модифициран метод, описан от Zhang [92], използвайки Multiskan Sky Microplate Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA). 20 μL екстракт от морски водорасли или сериен стандартен разтвор се смесва със 100 μL реактив на Folin-Ciocalteu (10 процента в дестилирана вода). След 5 минути се добавят 80 μL 7,5 процента (/w) разтвор на натриев карбонат. Реакционната смес се инкубира се при стайна температура и тъмно в продължение на 30 минути Абсорбцията се измерва при дължина на вълната 760 nm Дестилирана вода се използва като празна проба Стандартна крива на галова киселина се използва за определяне на общото фенолно съдържание и се изразява като ug еквиваленти на галова киселина（ GAE）на грам сух материал （ug GAE/g do）.

3.6. Определяне на общо съдържание на флавоноиди

Общото съдържание на флавоноиди (TFC) в екстрактите от морски водорасли се определя по метода, описан от Kamtekar 【93】, и се адаптира към 96-ямкови микроплаки. Накратко, обем от 25 μL екстракт от морски водорасли или сериен стандартен разтвор се смесват с 100 μL натриев нитрит (0,375 процента w/o). След 5 минути към сместа се добавят 25 μL алуминиев хлорид (3 процента w/o) и се инкубират за 6 минути при стайна температура. След това към сместа се добавят 100 μL натриев хидроксид （2 процента w/ø） и се смесват. Веднага се измерва абсорбцията при дължина на вълната 510 nm. Като празни проби се използват дестилирана вода и етанол. Използва се стандартна крива на кверцетин (разтворен в етанол) за определяне на общото фенолно съдържание и се изразява като ug еквиваленти на кверцетин（QE） на грам сух материал（ug QE/g do）. 3.7. Определяне на съдържанието на въглехидрати

Съдържанието на свободна захар се измерва съгласно метода, описан от [94], с леки модификации. 50 μL разтвор на фенол (4 процента) и 250 μL сярна киселина (96 процента) бяха добавени към 100 μL проба или стандартен разтвор. След 10 минути инкубиране при стайна температура, абсорбцията на сместа се отчита при 490 nm. Използва се стандартна крива на глюкозата за определяне на общото въглехидратно съдържание и се изразява като mg глюкозни еквиваленти (GluE) на грам сух материал (mg GluE/g do).

3.8. Антиоксидантни свойства на екстракти от морски водорасли

3.8.1.2,2 Дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH) анализ за отстраняване на свободни радикали

Антиоксидантната активност (DPPH) на екстрактите от морски водорасли е определена по описаната по-горе методология 【94】 с някои модификации. Накратко, 200 μL от 10,825 × 10-5 М DPPH разтвор се добавят към 100 uL проба (1:1 в метанол) в 96-плака с ямки. Същият обем DPPH се смесва с 50 μL стандарт плюс 50 μL метанол. След това пробите и стандартът се инкубират на тъмно място при стайна температура за 30 минути. Абсорбцията се измерва при дължина на вълната 517 nm. Като празна проба се използва дестилирана вода. Способността за отстраняване на DPPH радикала се изчислява с помощта на следното уравнение: където контролата е абсорбцията на контролата (DPH разтвор без проба), A пробата е абсорбцията на тестовата проба (DPPH разтвор плюс тестовата проба) и A Празната проба е абсорбцията само на пробата (проба без DPPH разтвор), а празната проба за аметанол е абсорбцията само на метанол. Търговските антиоксиданти (аскорбинова киселина, галова киселина и -токоферол) бяха използвани като положителни контроли.

3.8.2. Тест за намаляване на антиоксидантната сила на железни йони (FRAP).

FRAP активността се измерва по метода на Benzie и Strain [95]. Накратко, ацетатен буфер (300 mM, рН 3.6), 2.4, 6-трипиридил-s-триазин (TPTZ) 10 mM в 40 mMHC1 и FeCl; 6H-O (20 mM) се смесват в съотношение 10:1, за да се получи работният FRAP реагент. Реакционната смес се инкубира при 37 градуса за 10 минути. Проба от 50 μL от всеки екстракт се смесва със 150 μL работен разтвор на FRAP за 8 минути при стайна температура. Абсорбцията на оцветения продукт, Ferrous-TPTZ, се измерва при дължина на вълната 593 nm. Стойностите на FRAP на екстракти от морски водорасли бяха изразени като uM еквиваленти на Trolox (TE) на грам сух материал.

3.8.3.2,2 Анализ на азино-бис(3-етилбензотиазолин-6-сулфонова киселина) (ABTS)

Анализът беше извършен с помощта на протокола за обезцветяване ABTS [76] с някои модификации. ABTS радикален катион (ABTS плюс) се получава чрез взаимодействие на ABTS (66 mg) с 1 0 mL разтвор на калиев персулфат (2,45 mM). Сместа се оставя на тъмно при стайна температура за 12-16 h преди употреба. Разтворът ABTS плюс се разрежда с вода до абсорбция от 0,700 при 734 nm. Реакционната смес (200 ul) се прехвърля в микроплака, добавят се 50 μL от пробата и след това 150 μL от разтвора на реагента. Плаката се разклаща в продължение на 10 s при средна скорост и абсорбцията се измерва при 734 nm след 5 минути инкубиране при стайна температура. Беше изготвена стандартна крива чрез начертаване на инхибирането на A734nm от стандартите Trolox като функция на техните концентрации. Стойността на еквивалентния антиоксидантен капацитет на Trolox (TEAC) на пробите беше изчислена с помощта на уравнението, получено от линейната регресия на заместените със стандартната крива A734nm стойности за всяка проба:

3.9. Антиензимни активности на екстракти от морски водорасли

3.9.1. Тест за инхибиране на колагеназа

Колориметричен комплект за колориметричен анализ на активността на колагеназата (MAK293), закупен от Sigma-Aldrich, беше използван за определяне на инхибирането на колагеназата на екстракти от морски водорасли. Комплектът измерва колагеназната активност с помощта на синтетичен пептид (FALGPA), който имитира структурата на колагена. Процедурата се извършва съгласно инструкциите на комплекта.

3.9.2. Тест за инхибиране на еластаза

Инхибирането на еластазата на екстракти от морски водорасли беше изследвано в TRIS буферен разтвор с модифицирания метод, както е описано по-рано 【96】. Накратко, 100 μL от 0,1 M TRISбуферен разтвор （pH8,0）, 25 μL еластаза（1 U/mL в TRIS буфер） и 25 μL екстракти от проби се смесват и се инкубират за 15 минути при 30 °C преди добавяне на субстрата за започване на реакцията. След времето за инкубация се добавят 50 μL от 2 mM разтвор на AAAPVN. След това абсорбцията при 420 nm се наблюдава в продължение на 20 минути, като се използва четец на микроплаки при постоянна температура от 30 °C. Накрая, инхибирането на еластазата се изчислява в проценти, като се използва уравнението: където Abs контролата е абсорбцията на анализа, използвайки буфера вместо инхибитор (проба) и Absmple е абсорбцията на екстрактите от пробата. Кверцетинът се използва като положителна контрола. Tris буферът се използва като празен.

3.9.3. Тест за инхибиране на тирозиназа

Тестът за инхибиране на тирозиназа се извършва съгласно метода, описан по-рано от 【66】, като се използва L-DOPA като субстрат. 20 μL от пробата, 10 μL разтвор на гъбена тирозиназа （50 U/mL във фосфатен буфер） и 80 μL фосфатен буфер （pH=6.8）се смесват в микроплака и предварително се инкубират при 37C за 5 минути. След това се добавят 90 uL L-DOPA (2 mg/mL). Образуването на допахром незабавно се наблюдава в продължение на 20 минути при 475 nm в четец на микроплаки при постоянна температура от 37 градуса. Процентът на инхибиране на ензима тирозиназа се изчислява с помощта на уравнението: където Abs контролата е абсорбцията на анализа, използвайки буфера вместо инхибитор (проба), а проба е абсорбцията на екстрактите от пробата. Кверцетинът се използва като положителна контрола. Като празна проба се използва фосфатен буфер.

3.9.4. Тест за инхибиране на хиалуронидаза

Инхибиторната активност на хиалуронидаза се измерва, както е описано по-рано от [66] с малко модификации. Обем от 100 ulof тип-1-Sbovine тестиси хиалуронидаза（2100 U/mL）разтворен в 0.1 M ацетатен буфер (pH 3,5) се смесва със 100 μL екстракт и се инкубира при 37 градуса за 20 минути. Към реакционната смес се добавя обем от 200 μL от 6 mM калциев хлорид и след това сместа се инкубира при 37 градуса С в продължение на 20 минути. Тази Са2 плюс активирана хиалуронидаза се третира с 250 uL натриев хиалуронат (1,2 mg/mL), разтворен в 0,1 М ацетатен буфер (рН 3,5) и след това се инкубира във водна баня при 37 градуса за 40 минути. Към реакционната смес се добавят 50 μL 0,9 М натриев хидроксид и 100 μL 0,2 М натриев борат и след това се инкубират в кипяща водна баня за 5 минути. След охлаждане до стайна температура, към реакционната смес се добавят 250 uL разтвор на р-диметиламинобензалдехид (DAMB). Разтворът на DAMB се приготвя чрез разтваряне на 0.25 g DAMB в 21.88 mL 100 процента оцетна киселина и 3.12 ml 10N солна киселина. Контролната група беше третирана със 100 μL 5% вода вместо екстракт. Абсорбцията се измерва при дължина на вълната 585 nm след 45 минути. Процентното ензимно инхибиране се изчислява, като се използва следното уравнение: където Abs контрола е абсорбцията на анализа, използващ буфера вместо инхибитора (проба), а Abs пробата е абсорбцията на екстрактите от пробата. Таниновата киселина се използва като референтен стандарт.

3.10.Статистически анализ

Средната стойност на трикратния анализ на всеки екстракт беше изчислена и използвана за намиране на средните стойности и стандартните отклонения за всяка група (n=3). Общи линейни модели (GLM) за фиксирани фактори бяха приложени за оценка на основните ефекти и двупосочни взаимодействия на експерименталните фактори (видове и методи за извличане) върху измерените променливи. Освен това, ANOVA и тестът на Tukey-Kramer бяха използвани за идентифициране на значими (стр<0.05)differences between="" the="" groups.="" pearson="" correlation="" was="" used="" to="" evaluate="" linear="" relationships="" between="" the="" variables.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" was="" used="" to="" detect="" structure="" in="" the="" relationship="" between="" measured="" variables="" and="" experimental="" factors.="" the="" pca="" reduces="" voluminous="" data="" to="" a="" small="" set="" of="" linear="" combinations="" of="" related="" variables(i.e.,="" factors)="" based="" on="" patterns="" of="" correlation="" among="" the="" original="" variables.="" the="" resulting="" linear="" attribute="" combinations="" can="" be="" used="" for="" profiling="" specific="" product="" characteristics="" based="" on="" the="" variables="" studied.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" ncss="" 2020="" statistical="" software="" (2020)="" (ncss,="" llc.,="" kaysville,="" ut,="">

4. Изводи

Резултатите от този първи експеримент за скрининг показаха потенциала на три вида исландски водорасли чрез осигуряване на ефективни полезни ефекти по няколко пътя. Екологичният подход, разработен с използване на водни импулсни електрически полета, показа подобни резултати на традиционната екстракция с гореща вода, показвайки няколко предимства, като нейната нетермична природа и по-кратко време за екстракция (10 минути срещу 45 минути). Сред трите вида водорасли, кафявите макроводорасли A.esculenta показват най-високо съдържание на TPC и TFC, като също така показват най-голям антиоксидантен капацитет. Освен това водните екстракти на A.esculenta показват по-добра инхибиторна активност от P. palmaria и U. Lactuca спрямо колагеназа, еластаза, тирозиназа и хиалуронидаза са най-обещаващите видове морски водорасли с отлични антиензимни активности за тяхното използване при избелване на кожата, против стареене и здраве на кожата. Интересното е, че екстрактите от A.esculenta, произведени чрез метода PEF, показват инхибиране на колагеназата от 91 процента, по-високо от активността на инхибиране, показана при традиционната екстракция с гореща вода и дори по-високо от инхибитора, предоставен от търговския комплект. В заключение, нашето предварително проучване предполага, че екстрактите на базата на исландски морски водорасли, особено екстрактите от кафявите макроводорасли A. esculenta, произведени чрез водна импулсна екстракция с помощта на електрически полета, са потенциални функционални съставки, които биха могли да се използват като активни съединения за козметични и козметични формулировки в близко бъдеще.

Тази статия е извлечена от Mar. Drugs 2021, 19, 662. https://doi.org/10.3390/md19120662 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs