Експресия на бъбречни гени, свързани с витамин D и фосфатонин, в овчи модел на остеопороза

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:Остеопорозата е важен проблем за общественото здраве по света, като постменопаузалната остеопороза, дължаща се на естрогенен дефицит, води до приблизително 3/4 от случаите. В това проучване 18 възрастни мериносови овце са овариектомирани, а 10 са контролни. Три от овариектомираните овце са лекувани всяка седмица с 400 mg метилпреднизолон в продължение на 5 месеца и три са лекувани всяка седмица в продължение на 2 месеца, последвани от 3-месечен период на възстановяване. На 2 месеца пет контролни животни и шест овариектомирани животни бяха евтаназирани. На 5 месеца всички останали овце са евтаназирани. Бъбречни проби бяха събрани след смъртта за qPCR анализ на NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1Illc, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA и NCX1. Овариектомираните овце имат значително по-голяма експресия на VDR в сравнение с други групи. Овариектомирани овце, третирани с глюкокортикоиди в продължение на 2 месеца, последвани от евтаназия на 5-ия месец, показват значителни разлики в експресията на TRPV5, CYP24A1 и klotho ген в сравнение с други групи. Разликите в експресията на клото бяха най-забележими след корекция за повтарящи се измервания (p=0.1). Klotho е известен като "хормонът против стареене" и участва в метаболизма на калция и фосфора. Klotho може да участва във възстановяването на костната минерална плътност при овариектомирани овце, лекувани с глюкокортикоиди в продължение на 2 месеца, последвано от евтаназия на 5-ия месец. Препоръчват се допълнителни изследвания за ролята на клото.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Ключови думи:остеопороза; овце; витамин D; фосфатиране; qPCR; калциев метаболизъм; метаболизъм на фосфора; клото

1. Въведение

Остеопорозата е основен проблем за общественото здраве за все по-застаряващото население на света, струвайки на Съединените американски щати близо 17 милиарда щатски долара през 205 г. и се очаква да нарасне до 25 милиарда щатски долара през 2025 г. [1,2]. Приблизително 70-75 процента от тежестта на остеопорозата се дължи на постменопаузална остеопороза при жените [1], първична остеопороза, при която дефицитът на естроген води до намалено костно образуване и повишена костна резорбция, което води до намалена костна маса и чупливост на костите [3] . Остеопорозата може да възникне и вследствие на специфични причини, като например лечение с глюкокортикоиди. Овцата е добре установен голям животински модел за различни човешки скелетни заболявания, включително остеопороза[4]. Едно от предимствата на голям животински модел, като овцата, е способността да се тестват ортопедични импланти, хирургични техники и биоматериали [4] Освен това овцата е с относително ниска цена, лесна е за боравене и предоставя изобилен материал за тестване [4,5].

Най-често срещаните модели на остеопороза при овце са 12-месечните следоперативно овариектомирани овце и 6-месечните овце с овариектомия на диета с дефицит на калций и витамин D, получаващи глюкокортикоиди[4]. Чрез използване на комбинация от известни фактори, предизвикващи остеопороза, включително овариектомия, лечение с глюкокортикоиди и диета с ниско съдържание на калций, ние успяхме да създадем овчи модел на остеопороза само за 5 месеца [6,7], като по този начин намалихме настаняването, труда, и разходи за храна, включени в разработването на модела. В този модел беше установено, че овариектомията повишава серумните концентрации на С-терминални телопептиди от тип I колаген (CTX-I, маркер за костна резорбция) и остеокалцин (маркер за костна обмяна) в сравнение с контролните овце. Овце, които са получавали глюкокортикоидно лечение в продължение на 2 месеца, имат по-високи серумни концентрации на CTX-I и по-ниски серумни концентрации на остеокалцин. Освен това костната плътност на бедрената и лумбалната част на гръбначния стълб и общата и трабекуларната обемна костна минерална плътност на проксималната пищялна кост са по-ниски в експериментално третирани групи в сравнение с контролните групи, особено при овариектомирани овце, третирани с глюкокортикоид [6]. Установено е също, че аминокиселинният и липидният метаболизъм са променени при овариектомирани и лекувани с глюкокортикоиди овце [7].cistanche wirkungПодобни промени са открити и при други модели на остеопороза при овце [8].

Cistanche може да спре стареенето

Гените, реагиращи на витамин D, и системата за фосфатиране не са били изследвани досега в модели на овариектомирани овце. Витамин D, от който 1,25-дихидроксивитамин D е активната форма, в крайна сметка води до повишени плазмени концентрации на йонизиран калций и фосфор чрез свързване с хетеродимера на рецептора на витамин D (VDR)-ретиноид X и променя експресиите на множество витамини D-реагиращи гени, като калций-свързващи протеини (калбиндин D9 и 28k (CalD9k, CalD28k)) и калциеви канали (преходен рецепторен потенциален катионен канал подсемейство V член 5 и 6 (TRPV5, TRPV6), калциева АТФаза на плазмената мембрана (PMCA) , натриево-калциев обменник 1(NCX1)[9].Производството на 1,25-дихидроксивитамин D е строго регулирана стъпка, при която бъбречната lo хидроксилаза (CYP27B1) катализира превръщането на 25-хидроксивитамин D до 1,25-дихидроксивитамин D, а ензимът 24-хидроксилаза (CYP24A1) разгражда 25-хидроксивитамин D и 1,25-дихидрокси витамин D до неактивни странични продукти.cistanche ВеликобританияСистемата за фосфатиране също така контролира плазмените концентрации на фосфор и калций[10]. Основният елемент в тази система е фибробластният растежен фактор 23, който се произвежда от остеоцитите в костите и основно контролира плазмените концентрации на фосфор чрез свързване с кофактора клото, за да намали експресията на натриево-фосфатни котранспортери (NPT1, NPT2a, NPT2c) [11]. Поради взаимосвързаните ефекти на паратироидния хормон и 1,25-дихидрокси витамин D, определянето на ефектите на FGF23 върху калциевия метаболизъм е предизвикателство, но има доказателства, които предполагат, че той може да регулира чревната абсорбция на калций и бъбреците калциева реабсорбция[12,13].

Глюкокортикоидите имат многобройни ефекти върху метаболизма на калций и фосфор, включително инхибиране на чревната абсорбция на калций, намалена бъбречна тубулна реабсорбция на калций и намалена бъбречна реабсорбция на фосфор [14-16]. Освен това малко изследвания са изследвали ефекта от дефицита на естроген върху гените, реагиращи на витамин D, и системата за фосфатиране [17,18].

Тази овариектомирана диета с ниско съдържание на калций, лекувана с глюкокортикоид овчи модел на остеопороза предостави възможност за получаване на предварителна информация за ефектите от тези лечения върху експресията на фосфатиращи и реагиращи на витамин D гени в овчия бъбрек. Целите на това проучване бяха две: (1) да се определи дали овариектомията или лечението с овариектомия и глюкокортикоиди променя експресията на витамин D и свързаните с фосфатирането гени в бъбреците; (2) да се определят връзките между бъбречния витамин D и свързаните с фосфатирането гени, серумен витамин D и серумни маркери за костен обмен (CTX-I и остеокалцин).

2. Материали и методи

Подробни методи за разработване на овариектомиран и третиран с глюкокортикоид модел на остеопороза при овце са публикувани преди това [6]. Накратко, възрастни овце-майки Мерино (7-9 години, n=28) бяха разпределени на случаен принцип в групи: контрола (n=10)овариектомирани (OVX) (n=12), овариектомирани и лечение с глюкокортикоиди (40 mg метилпреднизолон чрез подкожна инжекция) всеки месец в продължение на 2 месеца, последвано от липса на лечение в продължение на 3 месеца (n=3) и лечение с глюкокортикоиди (400 mg метилпреднизолон) всеки месец в продължение на 5 месеца (n=3) .цитрусови биофлавоноидиОвцете са настанени в обор и са хранени или с контролна (115 g/kg калций; 2,2 g/овца на ден) или диета с ниско съдържание на калций (5 g/kg калций; 1 g/овца на ден) с концентрат на овчи пелети [19]. Изискванията за поддръжка на небременна овца са 1,2 g/овца на ден[19].

Кръвни проби бяха събрани чрез югуларна венепункция 2 месеца и 5 месеца след операцията. Остеокалцинът беше измерен с помощта на комплекта за имуноанализ Micro Vue Osteocalcin и CTX-I с помощта на комплекта IDS Serum CrossLaps ELISA, както беше съобщено по-рано [6] Концентрациите на серумен общ калций и фосфор бяха измерени с помощта на спектрофотометрия на AU680 Clinical Chemistry Analyzer (Beckman Coulter, Brea , Калифорния, САЩ). Серумната концентрация на 25-хидроксивитамин D се измерва с помощта на течна хроматограма с изотопно разреждане; рафична масспектрометрия в Endolab, Canterbury Health Laboratories, Крайстчърч, Нова Зеландия.

След месеци 5 овце-майки от контролната група и 6 от групата с OVX бяха евтаназирани и аутопсирани. На 5 месеца останалите овце също бяха евтаназирани (контролна група n =5, OVX група n=6, OVX плюс 2m глюкокортикоиди n=3 и OVX плюс 5m глюкокортикоиди n=5 ) и аутопсия. Бъбречни проби се събират в рамките на 30 минути след смъртта и се разделят на две, като едната проба се поставя в 10 процента неутрален буфериран формалин и се обработва за хистология, а другата се замразява в течен азот и се съхранява при -80 градуса до обработката на хематоксилин и оцветените с еозин участъци от бъбреците са изследвани от първичния автор и потвърждават липсата на значителни лезии.

Всички експериментални процедури бяха одобрени от комисията по етика на животните на университета Маси (номер на одобрение 14/103) и извършени съгласно Кодекса за етично поведение за използване на живи животни за изследвания в университета Маси, Палмерстън Норт, Нова Зеландия.

Екстракцията на РНК и qPCR се извършват, както е описано по-горе [20,21]. Накратко, Tri Reagent (Gigma-Aldrich Inc, Merck KGaA, Дармщат, Германия) се използва за извличане на РНК съгласно инструкциите на производителя. Геномната ДНК беше отстранена с Ambion Turbo DNA free (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) съгласно инструкциите на производителя. Концентрацията на РНК беше определена с помощта на флуорометър Qubit 2.0 и комплект за широкообхватен анализ на РНК на Qubit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, САЩ), а качеството на РНК беше оценено чрез определяне на съотношението 260/280 и пускане върху агарозен гел. Комплектът за синтез на cDNA на първата верига на Transcriptor (Roche) беше използван за синтезиране на cDNA. Всяка 20 μL реакционна смес съдържа 600 ng РНК, 2,5 μM олиго（dT）, 8 mM RT реакционен буфер, 1 mM dNTP, 10U обратна транскриптаза, 20 U РНКазен инхибитор и вода без Рназа-Дназа. Реакцията се извършва при 55 градуса за 30 минути, 85 градуса за 5 минути и след това се охлажда при 4 градуса, като се използва Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). qPCR в реално време се извършва с помощта на PCR машината StepOne Plus в реално време (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA). Всяка PCR смес съдържа 5 uL Power SYBR Green PCR master mix (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), прав и обратен праймери в концентрациите, посочени в таблица S1, 10 ng cDNA и след това се допълва до 10 μL с РНКаза, вода без ДНКаза. PCR протоколът се състои от 95 градуса за 20 s, 40 цикъла при 95 градуса за и 60 градуса за, и накрая, крива на топене, варираща от 60 градуса до 95 градуса със скорост на нагряване от 0,3 градуса /15 s. Вода и реакционна смес без обратна транскриптаза бяха включени като отрицателни контроли във всеки PCR цикъл и всички проби бяха проведени в два екземпляра. Бяха оценени следните гени: NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1IIC, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA и NCX1. По-рано е установено, че PKG1 и SDHA са стабилно експресирани в овчи бъбрек [20] и пробите са нормализирани по отношение на експресията на тези гени и ефективността на гена с помощта на 2-AACt метода [22].

Статистическият анализ беше извършен с помощта на R Studio 1.3.1093[23] с R версия

4.0.3 и tidyverse, nlme 3.1-150 и Гари

2.1.2 пакети. Линейни модели бяха приложени към log10 трансформираните данни за нагъване на генната експресия. В първия модел генната експресия беше променливата на резултата, докато групата (контрола или OVX, но с изключение на третирани с глюкокортикоид овце) и времето (евтаназирани на 2 m или 5 m) бяха зависими променливи, с включен термин за взаимодействие (група: време). Във втория модел генната експресия беше променливата на резултата, докато групата (контрола, OVX, OVX с глюкокортикоидно лечение за 2 m и OVX с глюкокортикоидно лечение за 5 m) беше зависимата променлива.ползи от cynomoriumТъй като множество променливи на резултатите (гени) бяха тествани за разлики между групите, p-стойностите бяха коригирани за многократно тестване с помощта на последователната процедура на Holm [24]. Серумните концентрации на калций, фосфор и 25-хидроксивитамин D бяха тествани в моделите на генна експресия, но не бяха значими и поради липсата на значителни разлики между групите бяха премахнати. Освен това беше използван анализ на главните компоненти, за да се оцени дали данните за експресията на трансформиран ген log10 се различават по група, време на евтаназия или концентрация на 25-хидроксивитамин D в серума. Двойната корелация на Spearman и диаграмите на разсейване бяха използвани за изследване на корелацията между log10 трансформирани данни за експресия на нагъване на ген и серумни аналити.

3. Резултати

3.1. Ефект от овариектомията, времето след овариектомията и лечението с глюкокортикоиди върху серумните концентрации на калций, фосфор и 25-хидроксивитамин D

Пълните резултати за серумните концентрации на калций, фосфор и 25-хидроксивитамин D във всяка група са представени на фигура 1."Няма значителни разлики в серумните концентрации на калций, фосфор и 25-хидроксивитамин D между групата с овариектомия и диета с ниско съдържание на калций и групата с диета без овариектомия с адекватна калциева диета и времето след овариектомията от 2 месеца и 5 месеца. Тези резултати предполагат, че овариектомията, комбинирана с диета с ниско съдържание на калций, няма влияние върху серумните концентрации на калций. Овце, които са били овариектомирани за и лекувани с глюкокортикоиди в продължение на месеци, последвани от евтаназия на 5-ия месец, имат значително по-ниски серумни концентрации на калций (p =0.0462, adj R20.13) в сравнение с 5 m овариектомия на диета с ниско съдържание на калций и 5 m овариектомия на диета с ниско съдържание на калций и овце, лекувани с глюкокортикоиди. Въпреки това, изследването на данните предполага, че това може да се дължи на едно животно, което е имало хипокалциемия (1,52 mmol/L, референтен диапазон 2.0-2.7 mmol/L); отстраняване на това животно премахна всякакво значение.пустинен зюмбюлВсички други овце са имали серумни концентрации на калций в рамките на референтния диапазон. Не са наблюдавани разлики в концентрациите на серумния фосфор или 25-хидроксивитамин D при 5 m овариектомирани и третирани с глюкокортикоиди овце.

3.2. Ефект на овариектомията и времето след овариектомията върху експресията на гените, свързани с витамин D и фосфатонина в бъбреците

Генната експресия на витамин D и свързаните с фосфатирането гени не е свързана с овариектомия или време след овариектомията (Фигура 2). Изключение беше рецепторът на витамин D (VDR), при което групата OVX имаше значително по-голяма VDR експресия (p=0.05, adj R2 0.16); обаче, тази значимост изчезна след корекция за повтарящи се измервания.

3.3. Ефект от овариектомия и лечение с глюкокортикоиди върху експресията на ген, свързан с витамин D и фосфатонин в БЪБРЕКА 5 месеца след операцията

Пълните резултати са представени на Фигура 3. Експресията на PTH1R е значително по-голяма при OVX овце, третирани с глюкокортикоиди в продължение на 5 месеца, в сравнение с другите групи (p=0.04, adj R40.18), докато TRPV5 (p{ {8}}.01, adj R20.31) и CYP24A1(p=0.005, adj R40.40) експресията е била значително по-висока при OVX овце, третирани с глюкокортикоиди в продължение на 2 месеца в сравнение с другите групи.

Експресията на klotho е значително различна между всички групи (p =0.01, adj R20.48), с най-ниска експресия при контролните овце. OVX овце, третирани с глюкокортикоиди в продължение на 2 месеца, имат най-висока експресия (p =0.002), следвани от OVX овце (p=0.008) и след това OVX овце, третирани с глюкокортикоиди в продължение на 5 месеца (p{ {10}}.03). Въпреки това, когато се коригира за повтарящи се измервания, генната експресия не се различава значително между тези групи, като klotho показва най-голямата разлика при OVX овце, третирани с глюкокортикоиди в продължение на 5 месеца (p=0.1).

По същия начин, експресията на VDR е значително различна между всички групи (p=0.03, adj R20.38). Най-голямото изразяване на VDR е при OVX овце, лекувани с глюкокортикоиди в продължение на месеци (p=0.009), следвани от OVX овце (p=0.01), след това OVX овце, лекувани с глюкокортикоиди в продължение на 5 месеца (p=0.05), а най-ниската експресия присъства при контролните овце.

3.4.PCA на общата генна експресия между групите

PCA анализът на OVX, контрола и евтаназията на 2 и 5 месеца не успя да раздели различните групи (Фигура S1). PCL и PC2 обясниха 69,6 процента от вариацията. По същия начин PCA анализът на групи, евтаназирани на 5 месеца, също не успя да раздели различните групи. PCL и PC2 обясняват 53,2 процента от вариацията (Фигура S2). Анализът на PCA показва, че цялостната генна експресия не може да се обясни със серумния калций и фосфор в концентрациите на 25-хидроксивитамин D (Фигура S3).

3.5. Корелация по двойки между всички аналити и генната експресия

Независимо от статуса на овариектомия, съдържанието на калций в диетата, времето след овариектомията (2 или 5 месеца) или статуса на лечение с глюкокортикоиди, генната експресия на NPT1 е значително и положително корелирана (p<001) with="" pth1r,="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" trpv5,="" cald9k,="" and="" cald28k="" gene="" expression.="" pth1r="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><001) with="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" npt2a="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" fgfr1wic.="" klotho="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" cyp24a1="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" trpv5="" and="" cald28k.="" trpv6="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cal9dk="" and="" pmca,="" while="" cal9dk="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cald28k="" and="" pmca.="" none="" of="" the="" serum="" analytes="" measured="" (osteocalcin,="" ctx,="" 25ohd,="" ca,="" and="" p)="" were="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" any="" genes.="" the="" full="" pairwise="" correlations="" are="" shown="" in="" figure="">

4. Обсъждане

Резултатите от това проучване показват, че лечението на овариектомирани овце с глюкокортикоиди е имало най-голямо въздействие върху генната експресия, докато самата овариектомия и времето след овариектомията (2 и 5 месеца) са имали малко влияние върху генната експресия. При едновариантен анализ са наблюдавани значителни разлики в експресията на TRPV5, CYP24A1 и klotho ген при овариектомирани овце, лекувани с глюкокортикоиди в продължение на 2 месеца, последвани от евтаназия на 5 месеца, и в PTH1R при овариектомирани овце, лекувани с глюкокортикоиди в продължение на 5 месеца. Разликите бяха най-забележими в експресията на клото след корекция за повтарящи се измервания.

Количествената периферна компютърна томография на проксималната тибия на тези овце показа, че овариектомията намалява общата обемна костна минерална плътност (vBMD) с 8 процента, овариектомията с лечение с глюкокортикоиди за 5 месеца с 27 процента и овариектомията с глюкокортикоиди за 2 месеца и евтаназия на 5 месеца с 13 процента [6]. Интересно е, че трабекуларната BMD, трабекуларната област и съдържанието на трабекуларни костни минерали са сходни или по-високи от контролите при овариектомирани овце, третирани с глюкокортикоиди в продължение на 2 месеца и евтаназирани на 5 месеца, което предполага възстановяване на костната маса [6]. Глюкокортикоидите имат няколко добре документирани ефекта върху костите, които водят до развитие на индуцирана от глюкокортикоиди остеопороза. Тези ефекти включват инхибиране на образуването на остеобластни прогениторни клетки и остеобласти, увеличаване на остеобластната апоптоза и намаляване на производството на остеоиди, всички от които намаляват образуването на кост [25,26]. В същото време глюкокортикоидите повишават костната резорбция чрез намаляване на експресията на OPG, увеличаване на експресията на RANKL, увеличаване на образуването на остеокласти, намаляване на апоптозата на остеокластите и увеличаване на секрецията на катепсини и матрични металопротеинази от остеокласти [25,26].

Klotho е неразделна част от фосфатиращата система, чрез която се свързва с фибробластния растежен фактор 23 (FGF23) в бъбреците. След това комплексът klotho-FGF23 се свързва с рецептора FGFR1IIC, който инициира няколко клетъчни пътя и в крайна сметка води до повишаване на експресията на бъбречната 24-хидроксилаза (CYP24A1) и понижаване на бъбречната la-хидроксилаза (CYP27B1) и бъбречните тубули Na/P II котранспортери (NPT2a и 2c) [10]. Повишената експресия (разликите в които са най-изразени след коригиране за повтарящи се измервания) на klotho при овце на глюкокортикоиди в продължение на 2 месеца и след това евтаназирани на 5 месеца може да обясни повишената експресия на CYP241, наблюдавана също при тази група овце, въпреки липсата на значителни разлики в серумни концентрации на 25OHD.

Klotho е известен като протеин против стареене, а мишките с дефицит на klotho имат ниско костно образуване и костна резорбция, което води до ниска остеопения на костния обмен [27,28]. Освен това, специфичните полиморфизми на klotho гена са свързани с намалена костна минерална плътност при хора [29,30]. Разтворимото клото регулира нагоре протеин 1 на ранния растежен отговор (EGR-1) и индуцира експресията на маркери за костна диференциация в клетъчна култура на остеобласти [31] Освен това глюкокортикоидите могат да потиснат фибробластния растежен фактор 232]. Може би по-голямата експресия на клото при овце на глюкокортикоиди в продължение на 2 месеца и след това евтаназирани на 5 месеца отразява процеса на възстановяване на тази овца след лечение с глюкокортикоиди и, като се има предвид ролята му в образуването и резорбцията на костите, вероятно ключов двигател за възстановяване на костите и, следователно, потенциално цел за лечение на остеопороза при хора.

Въпреки това, OVX овцете също имат повишени клото изрази в сравнение с контролните овце. По подобен начин, едно проучване при мишки с дефицит на ароматаза показа, че дефицитът на естроген повишава нивата на klotho протеин, а лечението с естрадиол намалява експресията на klotho при тези мишки [17]. При мишки естрогенът намалява NPT2a в процес, който е независим от klotho/FGF23 и PTH [18]. Въпреки това, този ефект не е наблюдаван при овариектомираните овце в настоящото изследване. В противен случай има малко литература за ефекта на естрогенния дефицит върху клото. По-нататъшни изследвания трябва да изследват ефектите както на овариектомията, така и на глюкокортикоидите върху експресията на клото, като се има предвид ролята му при стареенето и при хронично бъбречно заболяване.

TRPV5 е епителен калциев канал, експресиран главно в дисталните извити тубули и свързващите тубули на бъбрека [20,33]. TRPV5 каналът е конститутивно отворен, но претърпява калциево-зависима инактивация във връзка с калмодулин, калций-чувствителен протеин [34]. Експресията на TRPV5 може да бъде повишена от PTH и 1,25(OH)D3 [35]. Една овца, която е била на глюкокортикоиди в продължение на 2 месеца и след това е била евтаназирана на 5-ия месец, е била хипокалцемична и серумните концентрации на калций са били значително по-ниски при овцете в тази група в сравнение с другите групи. Следователно е вероятно повишената експресия на TRPV5 да е резултат от намалената серумна концентрация на калций при тези животни. Доказано е, че глюкокортикоидите намаляват чревната абсорбция на калций чрез намаляване на експресията на TRPV6 и CalD9k [36,37] и увеличаване на отделянето на калций в урината [14], но клинично значима хипокалциемия при здрави индивиди не е честа. По същия начин, овцете с ниска серумна концентрация на калций не показват клинични признаци на хипокалциемична тетания. Алтернативно, повишената експресия на TRPV5 при овце на глюкокортикоиди в продължение на 2 месеца и след това евтаназирани на 5 месеца може да отразява процеса на възстановяване, при което за заместване на възстановената трабекуларна КМП, площ и костно минерално съдържание е необходима повишена резорбция на калций от бъбрека.

При овце, лекувани с глюкокортикоиди в продължение на 5 месеца, експресията на PTH1R се повишава в сравнение с другите групи. Освен това, в сравнение с други групи, имаше малка разлика в изразяването между овцете в групата. Въпреки че не са наблюдавани разлики в серумните концентрации на калций при овце, лекувани с глюкокортикоиди в продължение на 5 месеца, вероятно това може да се свърже с повишеното действие на ПТХ и неговия рецептор. Ефектите на глюкокортикоидите върху секрецията и действието на ПТХ са неясни. Някои проучвания при хора са установили, че лекуваните с глюкокортикоиди пациенти имат повишени серумни концентрации на ПТХ, заедно с намалена абсорбция на калций, повишена екскреция на калций в урината и намалена костна маса [38,39]. Повечето проучвания обаче не са открили промени в серумните концентрации на ПТХ при хора на лечение с глюкокортикоиди [38,40,41]. Едно проучване показва, че вероятно въздействието на глюкокортикоидите е върху промяната на секрецията на ПТХ, с повишена пулсираща секреция на ПТХ при индивиди, лекувани с глюкокортикоиди[4]. Други също показват повишена експресия на PTH1R в мезенхимни стволови клетки и остеобластоподобни клетки в отговор на лечение с дексаметазон[43,44]. Като такова, увеличаването на бъбречната експресия на PTH1R при овцете, лекувани с глюкокортикоиди в продължение на 5 месеца, вероятно се дължи на 5-месечното лечение с глюкокортикоиди.

Докато овариектомията, съчетана с диета с леко ниско съдържание на калций, доведе до минимални промени в генната експресия, изглежда, че променя експресията на VDR, като овцете с овариектомия на диета с леко ниско съдържание на калций имат по-голяма експресия на VDR в сравнение с контролните овце. Това е в контраст с проучване върху овариектомирани плъхове, при което тези, хранени с диета с нормални нива на калций, показват повишена бъбречна експресия на VDR, докато тези, хранени с диета с ниско съдържание на калций, имат намалена експресия на VDR [45]. Трудно е в настоящото изследване при овце да се отдели ефектът на овариектомията върху бъбречната експресия на VDR от ефекта на диетата с ниско съдържание на калций. Въпреки това, няма значителни разлики в серумните концентрации на калций между групите (с изключение на групата на глюкокортикоидите), което предполага, че диетата с леко ниско съдържание на калций е имала минимален ефект и може би ефектите върху VDR се дължат на овариектомията. Въпреки това ще са необходими допълнителни изследвания, за да се проучат тези взаимоотношения.

Две предишни проучвания са изследвали отделните връзки между гените, реагиращи на витамин D, и свързаните с фосфатирането гени в бъбреците на овце [20,21]. Връзките между витамин D и пътищата на фосфатиране обаче не са изследвани. Интересното е, че най-значимите корелации между гените, докладвани в тези две статии, са валидни и за генните връзки в настоящото изследване на овце, което предполага последователност в резултатите между изследванията и връзките между тези гени.екстракт от цистанче салсаОт интересните връзки, които не са докладвани по-рано, както може да се очаква предвид основната му роля в калциевия метаболизъм, експресията на PTH1R е силно корелирана с CalD28k, CalD9k, TRPV5 CYP27B1, CYP24A1, VDR, Klotho и NPT2c. Експресията на klotho е силно свързана с генната експресия на TRPV5, което е в съответствие с друга литература, показваща, че klotho регулира нагоре TRPV5 и насърчава реабсорбцията на калций в бъбреците [46,47].

За съжаление, различните групи не могат да бъдат разделени въз основа на експресията на чувствителен към витамин D и фосфатиращ ген с помощта на PCA анализ. Това вероятно се дължи на основното ограничение на това проучване - малкия размер на извадката. Със само 3-6 животни във всяка от групите, това вероятно е ограничило способността за откриване на разлики в генната експресия между групите.

5. Изводи

Резултатите от това проучване показват, че най-забележимите разлики в генната експресия са били в бъбречната експресия на клото при овариектомирани овце, третирани с глюкокортикоиди в продължение на 2 месеца, последвани от период на възстановяване от 5 месеца. Като се има предвид, че клото е хормонът против стареене и има критична роля в калциевия и фосфатния метаболизъм, е възможно този хормон да участва критично във възстановяването на трабекуларната костна минерална плътност и площ при лекуваните овце и следователно може потенциално да бъде цел за лечение на остеопороза при хора. Необходими са обаче повече изследвания за ефектите на глюкокортикоидите и овариектомията върху клото.

Тази статия е извлечена от Animals 2022, 12, 67. https://doi.org/10.3390/ani12010067 https://www.mdpi.com/journal/animals