Екстракция на фенилетаноидни гликозиди от Cistanche Tubulosa чрез високоскоростно срязване хомогенизация екстракция

За контакти: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Уенджинг Пей и Руили Гуо

Фон:

Цистанче тубулозае добре позната традиционна китайска медицина с произход от Xinjiang. Разпространен е широко в Северна Африка, Индия и др. Цел: Основен биоактивен компонент наВ. тубулозае фенилетаноидни гликозиди (PhGs). Ехинакозидът и актеозидът са индикативните компоненти за определяне на PhGs и се използват главно за защита на черния дроб, имунна защита и др. Ето защо е много важно да извлечете докторантите от C. tubulosa. Методи: В това проучване са сравнени подпомаганата с ултразвук екстракция (ОАЕ), екстракцията, подпомагана от микровълновата фурна (MAE), и методите за хомогенизиране на високоскоростното срязване (HSHE). Освен това условията за извличане на метода на ХШЕ бяха оптимизирани. Резултати: Резултатите показаха, че методът hSHE е по-добър както от методите на ОАЕ, така и от MAE, И оптималните параметри на екстракция на HSHE бяха концентрация на етанол от 50%, температура на екстракция от 70°C, скорост на въртене от 16000 об/мин, време на екстракция от 2 мин, съотношение твърдо към течно от 1:9 и един цикъл на екстракция. Добивите на ехинакозид и acteoside са съответно 1,366 и 0,519%, а трансферните проценти на ехинакозид и acteoside достигат съответно 87 и 94%. Заключения: Може да се заключи, че методът hSHE е проста, бърза и ефикасна техника за извличане на докторанти от C. tubulosa. Акценти: Разследван е ефикасен и екологичен метод на HSHE за извличане на докторанти от C. tubulosa. Получени са оптималните условия на метода HSHE за извличане на PHGs от C. tubulosa. Това изследване осигурява нов метод за промишлено извличане на ПГ отВ. тубулоза.

Цистанче тубулоза

Цистанче тубулозае често срещано традиционно китайско лекарство, което произхожда от Xinjiang. Разпространен е широко в Северна Африка, Арабския полуостров, Пакистан и Индия и е официално записан в Китайската фармакопея през 2010 г. Основният биоактивен компонент наВ. тубулозае фенилетаноидни гликозиди (PhGs), клас водоразтворими природни продукти, включително ехинакозид, acteoside, изоактеозид, и 2-ацетилактеозид (1, 2). Структурата на PhGs се състои от цинаминова киселина и хидроксифенилетилови сортове, и двете от които са прикрепени към β-глюкопираноза чрез естер и гликозидни връзки, съответно (3). Фармакологичните проучвания показват, че PhGs на C. tubulosa имат много лекарствени функции, като например умора (4), невропротективни (5–7), чернодробни защитни (8–10), и имунопротективни ефекти (11). Ето защо, ефективното извличане на PHGs от C. tubulosa е от голямо значение за развитието и утилизацията на естествени продукти.

Настоящите традиционни методи за екстракция на PhGs са екстракция с горещ рефлукс, екстракция с ултразвукова помощ (ОАЕ), и екстракция с помощта на микровълнова печка (MAE; 12–16). Тези методи имат различни недостатъци, като ниска ефективност, дълги времена на извличане, и високи разходи. В сравнение с традиционните методи, високоскоростният метод за извличане на хомогенизация на срязване (HSHE) е нововъзникващия, новов метод на екстракция и има предимствата на по-бързите времена на екстракция, по-малко отпадъци от разтворители, по-високи добиви, по-опростено устройство и по-лесна работа (17). Работният принцип на метода HSHE се основава на въртящ се вътрешен катер, задвижван от високоскоростен мотор. Мощна сила на срязване се произвежда от вътрешните и външните фрези за нарушаване и смесване на пробите. Междувременно фрезата с високоскоростно завъртане предизвиква разлики в налягането между вътрешната и външната кухини на фрезата, което води до масов трансфер между пробите и разтворителите. С комбинацията от висока сила на срязване, сила на сблъсък, налягане и други сили бързо може да се постигне разтворим баланс между твърди проби и разтворители (18). По този начин процесът на извличане на HSHE може да бъде завършен за няколко минути, а дори и толкова бързо, колкото десетки секунди (19–22).

Напоследък HSHE е изследван при извличането на биоактивни компоненти от различни природни продукти (23–25). Cheng et al. използва HSHE, за да извлече пет лигнана от плода на Шисандра Чинензис (26). Резултатите показват, че оптималните условия са концентрация на етанол от 75%, време на екстракция от 1 мин, съотношение твърдо към течно от 1:19, напрежение на екстракцията 180 V, и размер на пробите частици от 120 меша. Общият добив на петте лигнана е 13,89 ± 0,014 mg/g при оптимизираните условия. Tang et al. използва HSHE за получаване на биоактивно масло от семена от перила (27). Оптималните условия бяха време за екстракция от 2 мин, съотношение твърдо към течно от 1:10, напрежение на екстракция 150 V и два цикъла на екстракция. Добивът на масло от семена от перила достигна 59,3%. Горните резултати показват, че HSHE има предимствата на кратки времена на екстракция, ниски разходи, и високи добиви. Въпреки това, липсва проучване за извличането на докторанти от HSHE.

В настоящото проучване HSHE е използван за проучване на потенциалното му приложение при извличането на ГК отВ. тубулоза. Добивът на PHGs е определен от HPLC. Трите метода на извличане, HSHE, ОАЕ, и MAE, бяха сравнени при същите условия. Изследвани са ефектите от концентрацията на етанол, температурата на екстракция, скоростта на въртене, времето на екстракция, съотношението твърдо към течно, както и броят на циклите на екстракция на добива. Предимствата и недостатъците на тази работа и препратките се сравняват и обсъждат.

Материали и методи

Материал и химически реагенти

В. тубулозае закупен от Синцзян Congrongtang биологични технологии Ко, Ltd (Синдзян, Китай). Стандартите на ехинакозид (чистота ≥98%) и acteoside (причислите ≥98%) са закупени от Шанхай Standard Biological Technology Co., Ltd (Шанхай, Китай). Ацетонитрил, метанол, и оцетна киселина са били от HPLC клас (Фишър научни, Справедлива морава, NJ). Етанолът от аналитичен клас е закупен от Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Тиендзин, Китай). През целия експеримент е използвана дионизирана вода.

HPLC анализ

Извършен е HPLC анализ на течна хроматография Waters e2695 (Waters, Milford, MA), оборудвана с 2489 UV/Видим детектор и колона Симетрия C18 (Води), 250 × 4,6 мм, 5 μm размер на частиците. Концентрациите на ехинакозид и актеозид са анализирани по HPLC метода. Подвижната фаза се състоя от (1) ацетонитрил и (2) 2% воден разтвор на ледежна оцетна киселина. Програмата за отмиване на градиента е представена в Таблица 1.

Засечената дължина на вълната е 330 nm, дебитът е 1 mL/min, обемът на инжектиране е 10 μL, а температурата на пещта е определена на 30°C. Хроматографният връх на аналита беше потвърден чрез сравняване на времето му за задържане с това на стандартите. Количественото определяне е извършено чрез интегриране на пика, като се използва външен стандартен метод.

Тестът за прецизност е извършен чрез инжектиране на едни и същи проби за екстракция пет пъти. За теста за стабилност същите проби бяха анализирани на стъпки от 0, 1, 2, 4, 12, 24, и 48 ч. Тестовете за възстановяване на ехинакозид и актеозид бяха проведени чрез добавяне на стандартите в пробите за екстракция. Всички пикови зони и времена на задържане на ехинакозид и acteoside бяха записани. Резултатите от калибровъчната криви за ехинакозид и acteoside са изброени в таблица 2.

Изчисляване на Добива

Ехинакозид и актеозид са използвани като индикативни компоненти за определяне на ДХ. Добивът на ехинакозид или acteoside е изчислен с помощта на следното уравнение:

Y=CV/W×100% (1)

когато Y = добив на ехинакозид или актеозид (%); C = концентрации на ехинакозид или актеозид (mg/mL); V = обем на разтвора за екстракция (mL); и W = тегло на праха C. tubulosa (mg).

Методи за извличане на PHGs

Стъблата на C. tubulosa за първи път са смилани от електрическа мелница (JC-500g; Йонгканг Кайюан Индустрия & Трейд Ко, ООД, Йонгканг, Китай) и филтриран от филтърно сито (приблизително 380 μm). След това прахът C. tubulosa е изсушен във фурната при 70°C, докато теглото е постоянно. Пет грама С. тубулоза на прах се смесва с екстракционния разтворител и се поставя в бутилка за екстракция. След това течната смес е предварително загрята (30–80°C) за 5 мин на водна баня с постоянна температура (DF-101S; Джинтан Аналитичен Инструмент Ко ООД, Джинтан, Китай).

а) Метод hSHE.—HSHE беше извършен от система FA25 (FLUKO Co., Ltd, Шанхай, Китай), която се състоеше от въртящия се фреза, високоскоростния мотор, и контролера. Скоростта на въртене на вътрешния резач е регулирана в диапазона от 10000 – 28000 об/мин, а времето за извличане е регулирано в диапазона от 2 – 15 мин.

б) метод на ОАЕ.—Пет грама изсушена проба и 300 mL метанол бяха точно претеглени и добавени в бутилка за екстракция. Бутилката за екстракция е потопена в ултразвукова вана и се извършва при ултразвукова мощност от 300 W за 10 мин. Температурата на екстракция е зададена на 30°C.

в) МЕТОД MAE.—Пет грама сушена проба и 300 mL метанол беше точно претеглен и добавен в бутилка за екстракция. Бутилката за екстракция е пусната в микровълнения реактор и се извършва на 180 W за 10 мин. Температурата на екстракция е зададена на 30°C.

Методът HSHE е сравнен с методите на ОАЕ и MAE със същия екстракционен разтворител, времето за екстракция, температурата на екстракция, съотношението твърдо към течно съотношение и номера на цикъла на екстракция. Разтворът за екстракция е филтриран от 0,22 μm мембрана и анализиран чрез HPLC, за да се определят концентрациите на ехинакозид и актеозид. Всички процеси на извличане бяха повторени три пъти

Определяне на трансферните цени

Въз основа на стандартния метод в Китай фармакопеята от 2015 г. са определени съдържанието на ехинакозид и acteoside в C. tubulosa прах (28). Един грам C. тубулоза на прах и 50 mL 50% метанол бяха точно претеглени и добавени в 50 mL кафява мерителна колба. Течната смес беше претеглена и напоена за 30 мин. След това, кафявата обемна колба е потопена в ултразвукова вана и се извършва при ултразвукова мощност от 250 W и честота от 35 kHz за 40 мин. Течната смес е претеглена, а 50% метанол е добавен към снабдяването за загуба на разтворители. Разтворът за екстракция е филтриран от 0,22 μm мембрана и е анализиран с помощта на HPLC за определяне на концентрациите на ехинакозид и актеозид. Процесите на извличане бяха повторени три пъти.

Трансферните курсове на ехинакозид или актеозид са изчислени с помощта на следното уравнение:

X= M1/M2 ×100% (2)

където X = скорост на прехвърляне на ехинакозид или актеозид (%); M1 = качество на ехинакозид или актеозид в екстракта (mg); и M2 = качество на ехинакозид или актеозид в C. tubulosa прах (mg).

Резултати и Дискусия

Валидиране на HPLC метода

HpLC профилите на ехинакозид и актеозид от C. tubulosa, използващи HSHE, са показани на фигура 1. RSD на пиковите области на ехинакозид и acteoside са съответно 1,89 и 1,40%. Резултатите показват, че HPLC методът има добра прецизност в количествения анализ на ехинакозида и acteoside. В различни времена (0–48 h) RSD-тата на пиковите области на ехинакозид и актеозид са съответно 1,71 и 1,70%, което показва, че пробата е стабилна в 48 ч. Възстановяването на ехинакозид и актеозид е съответно 99,3 и 99,1%, а техният RSD е съответно 0,70 и 0,67%, което потвърждава надеждността на HPLC метода.

Сравнение на различните методи за екстракция

Беше проведено сравнение на метода hSHE с методите MAE и ОАЕ по отношение на добивите на ехинакозид и acteoside, чиито резултати са показани на фигура 2. Беше наблюдавано, че добивите на ехинакозид и acteoside, получени от HSHE, са по-високи от тези, получени както от MAE, така и от ОАЕ. В сравнение с MAE добивите на ехинакозид и acteoside, получени от HSHE, са по-големи съответно с 20,5 и 20,8 %. И в сравнение с ОАЕ добивите на ехинакозид и acteoside, получени от HSHE, бяха по-големи съответно с 6,6 и 7,4%. Тези резултати показват, че ХШЕ може значително да увеличи добивите на дч.

Оптимизация на Метода на ХШЕ

Екстракционните параметри на ДХП по ХШЕ включват концентрация на етанол, температура на екстракция, скорост на въртене, време на екстракция, съотношение твърдо към течно, както и броя на циклите на екстракция (26, 29).

Ефект на концентрацията на етанол върху извличането на PHGs

Концентрацията на етанол е важен фактор, който влияе върху добивите на PHGs. Както е показано на фигура 3, добивите на ехинакозид и acteoside от C. tubulosa под различни концентрации на етанол са изследвани. Той разкри, че добивът на ехинакозид се е увеличил от 0 на 30% и след това е намалял от 30 на 90% с увеличаване на концентрациите на етанол. Добивът на acteoside се увеличава от 0 до 70% и след това намалява от 70 на 90% с нарастващи концентрации на етанол. Когато концентрацията на етанол е била 50%, сумата от ехинакозидните и acteoside добиви е била на максимума си. Различните концентрации на етанол имат различни полярности, което води до различни разтворимости на ехинакозид и acteoside. Така оптималната концентрация на етанол е била 50%.

Ефект на скоростта на въртене върху извличането на PHGs

Фигура 5 показва ефектите на различните скорости на въртене върху добивите на ДХ. Добивите на ехинакозид и acteoside се увеличиха с нарастващи скорости на въртене. Увеличаването на скоростта на въртене може да увеличи силата на срязване на вътрешната и външната фреза, като по този начин увеличава добивите на PhGs. Оптималната скорост на въртене е била 16000 об/мин.

Ефект на времето за извличане върху извличането на PHGs

Добивите на ехинакозид и актеозид под различните времена на екстракция са показани на фигура 6. Добивите на ехинакозид и acteoside бяха стабилни с нарастващи времена на екстракция. Следователно може да се заключи, че PHGs могат да бъдат напълно извлечени от C. tubulosa в 2 мин, а оптималното време за екстракция е било 2 мин.

Ефект на съотношение "Твърдо към течно" върху извличането на PHGs

Както е показано на фигура 7, бяха обсъдени добивите на ехинакозид и актеозид под различните съотношения от твърдо към течно състояние. Добивите на ехинакозид и атеозид се увеличиха от 1:3 на 1:9 и станаха стабилни от 1:9 до 1:24. Тъй като малко количество екстракционен разтворител не може напълно да разтвори ехинакозида и acteoside, процентите на масов трансфер са намалени. Прекомерното извличане на разтворители причини ненужни отпадъци. Следователно оптималното съотношение твърдо към течно съотношение е било 1:9.

Ефект на броя на циклите на екстракция върху извличането на PHGs

Фигура 8 показва, че ефектите на редица цикли на екстракция върху добивите на ДХ. Добивите на ехинакозид и acteoside се увеличиха с нарастващия брой цикли на екстракция. Въпреки това, времето за извличане забележително се увеличи с нарастващи цикли на екстракция, и повече енергия се консумира. Оптималният брой цикли на екстракция беше един.

Сравняване на Метода на ХШЕ с други методи за екстракция за извличане на дч

Резултатите от метода HSHE в сравнение с други методи за екстракция за извличане на ДЧ от C. tubulosa са изброени в таблица 3. HSHE е по-прост и по-лесен от методите за прикачване като асистирания с ултразвук воден двуфазен добив и ултразвуковите технологични методи за екстракция на микровълнова фурна. В допълнение, налягането на екстракция на HSHE е по-ниско от метода за извличане на течност под налягане, а условията на работа на първите са по-безопасни. По-важното е, че от таблица 3 може да се види, че HSHE показва най-краткото време за екстракция и най-малко потреблението на разтворители сред всички методи за екстракция. Може да се заключи, че методът hSHE има много предимства като висока ефективност, леки условия на работа, ниски нива на потребление, обикновено оборудване, както и лесна работа за добив на естествени продукти.

Заключения

В това проучване, ефикасен и екоприятелски HSHE метод е изследван за извличането на PHGs от C. tubulosa. В сравнение с методите на ОАЕ и MAE, романът HSHE метод произвежда по-висок добив на дч при същите условия. В сравнение с метода на MAE добивите на ехинакозид и актеозид са увеличени съответно с 20,5 и 20,8%. И в сравнение с ОАЕ добивите на ехинакозид и acteoside са увеличени съответно с 6,6 и 7,4%. Параметрите на извличане на HSHE на дхг от C. tubulosa бяха оптимизирани. При оптимизираните параметри добивите на ехинакозид и acteoside достигат съответно 1,366 и 0,519%, а трансферните курсове на ехинакозид и acteoside достигат съответно 87 и 94%. Методът HSHE има предимствата на високата ефективност, леките условия на работа, ниските нива на потребление, обикновеното оборудване, лесната работа и ниските разходи. Това изследване осигурява нов метод за промишленото извличане на PHGs от C. tubulosa.