Фарнезилтрансферазният инхибитор LNK-754 отслабва аксоналната дистрофия и намалява амилоидната патология при мишки, част 1

Резюме

Заден план:

Отлагането на амилоидна плака и аксоналната дегенерация са ранни събития в патогенезата на AD. A разрушава микротубулите в пресинаптичните дистрофични неврити, което води до натрупване на увредени ендолизозомни и автофагични органели, транспортиращи ензима за разцепване на амилоиден прекурсорен протеин (BACE1). Следователно, дистрофичните неврити генерират A 42 и значително допринасят за отлагането на плака.

Аксоналната дегенерация е неврологично разстройство, което причинява увреждане на аксоните на невроните, като по този начин засяга нервната проводимост. Имунитетът е важна линия на защита на човешкото тяло, за да устои на нахлуването на чужди микроби и вируси. И така, има ли връзка между аксоналната дегенерация и имунитета?

Първо, аксоналната дегенерация не е заболяване, причинено от имунната система, така че няма нужда да се притеснявате, че имунитетът ще я повлияе негативно. Въпреки че конкретната причина за аксонална дегенерация е неизвестна, някои проучвания предполагат, че аксоналната дегенерация може да е свързана с възпалителни реакции в имунната система. Възпалителният отговор е защитен механизъм на имунната система срещу нахлуването на чужди патогени. Въпреки това, ако е свръхактивиран, той ще причини възпалително увреждане на невроните и ще насърчи аксонална дегенерация.

Второ, силната имунна система може да подобри устойчивостта на организма и да намали риска от инфекция и заболяване, което е особено важно за пациенти с аксонална дегенерация. Тъй като нервната система на пациенти с аксонална дегенерация е увредена, способността на тялото за самовъзстановяване е относително слаба. Ако страдат от други заболявания, състоянието ще се влоши и допълнително ще засегне качеството им на живот. Следователно поддържането на здравословна диета и навици на живот и повишаването на имунитета може да помогне за намаляване на риска от други заболявания. В същото време може да подобри имунния отговор на организма и да насърчи възстановяването на аксоните и възстановяването на нервната проводимост.

В обобщение, въпреки че няма необходима връзка между аксонална дегенерация и имунитет, здравата имунна система може да осигури необходимата защита и подкрепа за пациенти с аксонална дегенерация. Ето защо трябва да обърнем внимание на значението на поддържането на имунната система, като се започне от аспекти като диета и жизнени навици и активно подобряване на имунното ниво на тялото, за да се постави солидна основа за здраве и дълголетие. Вижда се, че трябва да подобрим паметта и Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola е традиционен китайски лекарствен материал, който има много уникални ефекти, един от които е да подобрява паметта. Ефикасността на мляното месо идва от различните активни съставки, които съдържа, включително киселина, полизахариди, флавоноиди и др. Тези съставки могат да насърчат здравето на мозъка по различни начини.

Щракнете върху познайте 10 начина за подобряване на паметта

Инхибиторите на фарнезилтрансферазата (FTI) наскоро бяха изследвани за препозициониране към лечението на невродегенеративни разстройства и блокират действието на фарнезилтрансферазата (FTase) за катализиране на фарнезилирането, пост-транслационна модификация, която регулира протеините, участващи във функцията на лизозомата и стабилността на микротубулите. В мозъците след смъртта на AD, FTase и нейното сигнализиране надолу по веригата се регулират нагоре. Въпреки това, влиянието на FTI върху амилоидната патология и дистрофичните неврити е неизвестно.

Методи:

Тествахме ефектите на FTIR LNK-754 и лонафарниб в 5XFAD миши модел на амилоидна патология.

Резултати:

При 2-месечни 5XFAD мишки, лекувани хронично в продължение на 3 месеца, LNK-754 намалява тежестта на амилоидната плака и тау хиперфосфорилирането и отслабва натрупването на BACE1 и LAMP1 в дистрофични неврити. При 5-месечни 5XFAD мишки, лекувани остро в продължение на 3 седмици, LNK-754 намалява размера на дистрофичния неврит и натрупването на LysoTracker-Green при липса на ефекти върху A отлаганията. Острата терапия с LNK-754 подобрява паметта и дефицитите в ученето при hAPP/PS1 амилоидни мишки.

За разлика от LNK-754, лечението с лонафарниб е по-малко ефективно за намаляване на плаки, тау хиперфосфорилиране и дистрофични неврити, което може да е резултат от намалена ефективност срещу FTase в сравнение с LNK-754. Изследвахме ефектите на FTI върху аксоналния трафик на ендолизозомни органели и открихме, че лонафарниб и LNK-754 засилват ретроградния аксонален транспорт в първичните неврони, което показва, че FTI могат да поддържат узряването на късните ендозоми на аксоните в лизозоми. Освен това, лечението с FTI повишава нивата на LAMP1 в миши първични неврони и мозъците на 5XFAD мишки, демонстрирайки, че FTI стимулира биогенезата на ендолизозомни органели.

Изводи:

Ние показваме нови данни, които предполагат, че LNK-754 насърчава аксоналния трафик и функцията на ендолизозомните отделения, за които предполагаме, че намаляват аксоналната дистрофия, намаляват натрупването на BACE1 и инхибират отлагането на амилоид в 5XFAD мишки. Нашите резултати са в съответствие с предишната работа, идентифицираща FTase като терапевтична цел за лечение на протеинопатии и може да има важни терапевтични последици при лечението на AD.

Ключови думи:

Болест на Алцхаймер, дистрофични неврити, инхибитори на фарнезилтрансферазата.

Заден план

Болестта на Алцхаймер (AD) е прогресивно невродегенеративно заболяване, което е най-честата причина за деменция сред застаряващото население и се характеризира със значително увреждане на ученето и паметта. На молекулярно ниво отличителни белези на мозъка на AD са натрупването на амилоидни (A) плаки и наличието на хиперфосфорилирани тау включвания.

В ранните, асимптоматични стадии на AD, А се натрупва в мозъка за повече от две десетилетия или повече преди началото на увреждане на паметта [1–3]. Следователно, намаляването на мозъчните нива А е централният фокус на стратегиите за лечение на AD [4]. Понастоящем единствената терапия, модифицираща болестта, условно одобрена от FDA, е анти-А антитяло, което изчиства агрегираните форми на А от мозъка [5], потвърждавайки, че насочването на А в мозъка е обещаващ подход към лечението на AD.

Въпреки това повечето клинични изпитвания, фокусирани върху А, са се провалили поради опасения за безопасността или ефикасността и сега се набляга на цели, базирани на различни хипотези за AD, включително разпространение на тау, възпаление, калциева дисхомеостаза и невроваскуларни фактори [4, 6, 7]. ]. В допълнение, има нарастващ интерес към терапевтичния потенциал за активиране на лизозомни деградативни пътища като метод за намаляване на патогенните протеини, характеристика, обща за невродегенеративните заболявания [8–12].

Обширната дисфункция на ендолизозомните и автофагичните пътища е добре документирана като ранно събитие на патогенезата на AD. Много генетични локуси на чувствителност към AD са свързани със субклетъчен ендолизозомален транспорт и функция на лизозома [13], а увеличените дисфункционални ендолизозомни и автофагични органели се натрупват в мозъка на AD в рамките на дистрофични неврити [14, 15].

Изглежда, че дистрофичните неврити се инициират при увреждане на невроните, а при AD се предполага, че това е дестабилизирането на микротубулите от A [16]. Това води до фокални аксонални отоци, които нарушават нормалния трафик и пътища на разграждане на ключови протеини, участващи в производството на A, включително BACE1 [16, 17]. В резултат на това дистрофиите генерират A 42 и значително допринасят за отлагането на екстрацелуларна плака и аксонална дистрофия [18], инициирайки път напред, водещ до синаптична загуба, невродегенерация и когнитивен дефицит [16].

Терапевтичните стратегии, които подобряват транспорта и активността на ендолизозомни и автофагични органели, биха могли да предотвратят невритната дистрофия, да поддържат разграждането на патогенни протеини и да бъдат критичен механизъм за намаляване на нивата на BACE1 и A при AD.

Тъй като търсенето на ефективно лечение на AD продължава, броят на преназначените лекарства в клиничните изпитвания за AD нарасна значително, тъй като клинично оценените лекарства имат известни проблеми с безопасността и ефикасността, като по този начин ускоряват процеса на разработване на лекарства [7, 19]. През последните години проучванията идентифицираха FTI като клас лекарства с потенциал да бъдат преназначени за лечение на невродегенеративни заболявания.

FTI инхибират фарнезилирането, пост-транслационна модификация, която регулира протеини, в които фарнезил пирофосфат е ковалентно модифициран до цистеинови остатъци в протеини, които съдържат CAAX мотив [20]. Първоначално FTIs са предназначени да блокират онкогенната Ras активност чрез инхибиране на нейното пренилиране, но са преустановени в клинични изпитвания за лечение на рак след откриването на алтернативни пътища на Ras пренилиране [21, 22].

Съществуват обаче много субстрати на FTase [23–25], което води до оценка на FTI за широк спектър от заболявания, включително сърдечно-съдови заболявания, хепатит D и прогерия [20, 26]. Освен това, FTI са показали обещание за невродегенеративни заболявания, характеризиращи се с натрупване на протеинови агрегати. В модели на протеинопатии при гризачи и клетъчни култури, FTI индуцират лизозомна активност и протеолиза на специфични за заболяването токсични протеини [8, 9, 27, 28].\

По-рано показахме, че LNK-754, FTI, тестван в проучвания за рак, засилва трафика на лизозомна хидролаза и намалява агрегатите на алфа-синуклеин (-синуклеин) в неврони, получени от пациенти с болестта на Паркинсон (PD) и миши модели на PD [8 ].

Други проучвания съобщават за подобни резултати от FTI за намаляване на протеиновите агрегати; лечение на модели на клетъчна култура на PD с FTI-277 редуциран -синуклеин [28] и лонафарниб, одобрен от FDA FTI за лечение на прогерия [29], повишена лизозомна активност и намалени тау включвания в миши модел на тауопатия [ 9]. Освен това, скорошно проучване показа, че генетичният нокаут на невронна FTase в APP/PS1 миши модел на AD предотвратява A поколение [30]. Фокусът на минали проучвания, оценяващи FTIs за протеинопатии, е ролята на FTase субстрати в лизозомната активност и автофагията.

Известно е обаче, че FTI насърчават стабилността на микротубулите (МТ) и синергизират с МТ-стабилизиращи лекарства за подобряване на ацетилирането на тубулин, чрез Ras-независим път [31–33]. Стабилизирането на МТ инхибира патологията на AD при APP/PS1 мишки [34] и в момента няколко стабилизиращи МТ агенти се изследват клинично за лечение на AD [35]. Следователно, значителни доказателства предполагат, че FTIs могат да бъдат от полза за заболявания, характеризиращи се с дисфункционални механизми на протеинова хомеостаза, като AD. И все пак, целите и пътищата, които свързват протеиновото фарнезилиране с намалените протеинови агрегати при невродегенеративни заболявания, не са напълно разбрани.

В това проучване ние оценихме дали фармакологичното лечение с FTIs може да подобри А-свързаната AD патология. Ние оценихме ефектите на LNK-754 и lonafarnib, две FTI, за които е известно, че намаляват протеиновите агрегати при невродегенеративни разстройства, върху натоварването на плаките и дистрофичните неврити в 5XFAD миши модел на амилоидна патология. Нашите резултати дават представа за пътищата, засегнати от инхибирането на FTase, и силно подкрепят по-нататъшното изследване на повторното използване на FTI като терапевтично средство за AD и други невродегенеративни заболявания, характеризиращи се с натрупване на протеинова агрегация.

Материали и методи

Животни и лечение с лекарства

Цялата работа с животни беше извършена от одобрението на Институционалния комитет за грижа и използване на животните на Северозападния университет (IACUC). Мишките бяха хранени със стандартна храна за гризачи и вода ad libitum и настанени със стандартен 12--часов цикъл светлина/тъмнина. 5XFAD мишки на фона на C57BL6 (Jackson Laboratories) се поддържат чрез кръстосване на трансген-положителни хемизиготни мъжки C57BL6 мишки с трансген-отрицателни женски C57BL6 мишки (Jackson Laboratories).

В нашия протокол за хронично лечение, лечението с лекарства е започнало на 2-месечна възраст, възрастта, на която започва отлагането на плака [36, 37]. В протокола за остро лечение, лечението с лекарства е започнало на 5-месечна възраст, след което отлагането на плаки и аксоналната дегенерация са широко разпространени [38, 39].

LNK{{0}} е синтезиран от Link Medicine (Масачузетс, САЩ), а лонафарниб е получен от Cayman Chemical Company (Ann Harbor, MI). За третиране на животни LNK-745 и лонафарниб се приготвят в загрят разтвор на 0.5% карбоксиметилцелулоза (Sigma-Aldrich) като носител в концентрация 0,10 mg/mL, докато се разтворят и разтворът се ясно.

Аликвотни части за инжектиране се замразяват при -20 градуса и след това се размразяват и съхраняват при 4 градуса за всяка седмица от лечението. Мишките бяха третирани, следвайки установен протокол, за който е известно, че повишава лизозомната активност [8]. В протокола за хронично лечение, 2-месечни мишки 5XFAD бяха инжектирани чрез интраперитонеална (ip) инжекция с носител, LNK754 или лонафарниб ежедневно, като се използваше 29-инсулинова спринцовка за 12 седмици, докато мишките станаха на 5 на месеци. В режима на остро лечение, 5-месечни мишки 5XFAD бяха инжектирани ежедневно в продължение на 3 седмици.

След завършване на лечението мишките бяха анестезирани и перфузирани и мозъците бяха събрани за по-нататъшни анализи (вижте разделите по-долу). За експерименти с клетъчни култури, LNK-754 и лонафарниб бяха разтворени в DMSO и добавени към миши първични невронни култури в концентрация от 10 nM за 48 часа. Третирането с носител беше еквивалентно количество DMSO. Клетките бяха събрани и анализирани, както е описано по-долу.

Антитела

Антителата, използвани за експерименти с имунофлуоресценция, са плъши анти-LAMP1 (#1D4B, DSHB), заешки анти-A 42 (#700254, Invitrogen), заешки анти-BACE1 (#ab108394, Abcam), заешки анти-III тубулин (#ab18207, Abcam). За имуноблотинг използваните антитела бяха заешки анти-актин (#926–42,210, LI-COR), заешки антиp44/42 MAPK (pErk1/2) (#CS9101, Cell Signaling Technology), заешки анти-44/42 (Erk1/2) (#CS137F5, технология за клетъчно сигнализиране), заешки анти-LAMP1 (#CS3234, технология за клетъчно сигнализиране), миши анти-BACE (3D5; Zhao et al., 2007), миши анти-APP (6E10) ( #803001, BioLegend), заешки анти-p-tau (ser404) (#CS20194, Cell Signaling Technology), миши анти-Tau1 (#MAB3420, Millipore Sigma), преламин-A (#MABPT858, Millipore Sigma) и миши анти -HDJ-2 (#sc-59,554, Санта Круз). Анти-заешки или миши вторични антитела от Vector Laboratories бяха използвани за имуноблотинги.

Поведенчески тестове

Животни и лечение с лекарства

Поведенческите анализи бяха извършени от reMYND, Inc. с помощта на hAPP/PS1 миши модел с неврон-специфична експресия на клиничен мутант на човешки амилоиден прекурсорен протеин заедно с клиничен мутант на човешки пресенилин 1 [40]. Тази двойна трансгенна мишка показва спонтанно, прогресивно натрупване на А в мозъка, което в крайна сметка води до амилоидни плаки в субикулума, хипокампуса и кората на 6-месечна възраст. 48 женски hAPP/PS1 мишки в FVB x C57Bl/6J фон на възраст 6 месеца бяха използвани за това изследване, в комбинация с 12 съответстващи на възрастта женски контроли от див тип в FVB x C57Bl/6J фон. Прилагането на 0,9 mg/kg/ден от LNK-754 се извършва през устата, веднъж на ден, в продължение на 12 последователни дни. Умъртвяването на животните се извършва 2 часа след последното дозиране.

Всички мишки бяха генотипирани чрез полимеразна верижна реакция (PCR) на възраст от 3 седмици и получиха уникален идентификационен номер, след като резултатите от PCR бяха известни. Всички мишки бяха проверени двойно с втори PCR преди началото на изследването. Всички мишки бяха рандомизирани на сляпо и съвпадащи по възраст. Мишките получават случаен номер от компютър и се разпределят на случаен принцип за лечение. Животните бяха поставени отново в клетка от групата за лечение 15 дни преди началото на изследването, за да им се позволи да се запознаят с новия контекст на клетката. Мишките имаха свободен достъп до предварително филтрирана и стерилна вода и стандартна храна за мишки (Snif® Ms-H, Snif Spezialdiäten GmbH, Soest, Германия). Храната се съхранява при сухи и хладни условия в добре проветриво складово помещение. Количеството вода и храна се проверява ежедневно, доставя се при необходимост и стандартно се освежава веднъж седмично. Първоначално мишките бяха настанени при обърнат ритъм ден-нощ (14 часа светлина/10 часа тъмнина), започвайки от 19 часа в стандартни метални клетки тип RVS T2 (площ от 540 cm2).

Клетките са оборудвани с твърди подове и слоеве постеля. Броят на мишките в клетка е ограничен от местното законодателство за хуманно отношение към животните. 15 дни преди началото на лечението, мишките бяха поставени отново в отделни вентилирани клетки макролон Т2 и транспортирани до лабораторията за аклиматизация към лабораторната среда в подготовка за лечение. В лабораторията ритъмът ден-нощ беше променен на 12 часа светлина/12 часа тъмнина, започвайки от 19 часа

Воден лабиринт на Морис

Водният лабиринт на Morris се извършва на 8-12 дни от лечението и животните се умъртвяват директно след теста със сондата. Басейнът (бял, кръгъл съд с диаметър 1 м) съдържаше вода при 20 градуса с титанов диоксид като безмирисна, нетоксична добавка, за да скрие платформата за бягство (1 см под нивото на водата). Плуването на всяка мишка беше записано на видео и анализирано (Ethovision, Noldus Information Technology, Wageningen, Холандия). Преди тренировка всяка мишка беше поставена върху платформата за 15 секунди. За тестове за навигация по място мишките бяха обучени да намират скритата платформа в седем блока от три опита в продължение на четири последователни дни.

Всяко изпитание се състои от тест за принудително плуване от максимум 120 секунди, последван от 10 минути почивка. Беше измерено времето, необходимо на всяка мишка, за да намери платформата. Седемте последователни блока водят до крива на обучение. 24 часа след последното обучение, всяко животно беше подложено на тест със сонда с отстранена платформа. На мишките беше позволено да търсят в продължение на 60 секунди и бяха измерени времето за търсене на квадрант и пресичането на първоначалната позиция на платформата. По време на последния тест със сонда, мишките бяха оставени да търсят предишното местоположение на платформата за 60 секунди след отстраняването на платформата.

Първична невронна култура

Предните мозъци бяха дисектирани в балансиран разтвор на сол на Ханкс (HBSS) (Thermo Fisher #14185–052) от бременни мишки от див тип C57BL6 (Jackson) на E15.5, за да се получат първични неврони. Разрязаните предни мозъци се усвояват в 2,5% трипсин при 37 градуса за 20 минути. Полирана с огън пипета на Пастьор беше използвана за дисоцииране на невроните в HBSS. След това невроните се поставят върху покрита с поли-L-лизин шестямкова плака, 2 × 106 неврони на ямка в невробазална среда, допълнена с 2% B-27, 500 μM глутамин, 10% конски серум и 2,5 μM глутамат (всички от Thermo Fisher).

Средата се смени 2 часа по-късно на Neurobasal с 2% B-27, 500 μM глутамин и 2,5 μM глутамат. 24 часа по-късно средата беше променена на Neurobasal плюс 2% B-27 и 500 μM глутамин. На всеки 2–3 дни се правят половин промени в медиите. Първичните неврони се култивират в продължение на 7 дни и се третират с носител (DMSO) или 10 nM концентрации на LNK-754, или лонафарниб в продължение на 48 часа. След това невроните бяха фиксирани или изобразени на живо, както е описано по-долу.

За фиксиране невроните се инкубират за 20 минути в 4% параформалдехид, 0.12M захароза в 1XPBS, пермеабилизирани в 0,5% Triton X-100, и се инкубират с първични антитела за една нощ, последвано от магарешки анти-миши Alexafuor-конюгирани вторични антитела (Molecular Probes, 1:1000) и съвместно оцветени с 300nM DAPI. Покривните стъкла бяха монтирани с помощта на Prolong Gold (Molecular Probes) и изображенията бяха получени на конфокален микроскоп Nikon A1 с обектив 60X (NA 1.4) и софтуер NIS Elements.

Живо изображение на неврони

За експерименти с изображения на живо, невроните се приготвят както по-горе и се поставят в 35 mm стъклени дънни съдове (MatTek # P35G-1.5-14C) за 7 дни в култура. 10nM LNK-754 или лонафарниб след това се добавя към кондиционирана среда, контролните култури се третират с DMSO като носител. След 48 часа третиране, средата беше заменена с кондиционирана среда от нетретирани паралелни плочи от неврони. 25 nM LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) се добавя към кондиционираната среда и невроните се инкубират за 30 минути при 37 градуса.

Изобразяването на неврони с изтичане на времето беше извършено с помощта на Ti2 микроскоп с широко поле. Изобразяването започва веднага след 30 минути и продължава не повече от 30 минути. 1-s експозиции бяха правени всяка минута и 20–30 отделни области на чиния бяха изобразени в рамките на 30 минути. Количественото определяне на разстоянието и скоростта на частиците LysoTracker и кимографските анализи бяха извършени с помощта на софтуера NIS Elements и описани подробно по-долу. В отделни експерименти 1 μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) беше добавен към кондиционирана среда и заснетите изображения на живи неврони бяха направени за не повече от 15 минути с помощта на конфокален микроскоп Nikon A1 с обектив 60X (NA 1.4) и NIS Elements софтуер.

For more information:1950477648nn@gmail.com