Фините прахови частици 2.5 регулират меланогенезата в A375 човешки меланомни клетки
Jul 19, 2023
До редактора: Епидемиологичните проучвания показват, че експозицията на фини прахови частици 2,5 (PM2,5) увеличава риска от хиперпигментация на кожата.[1] Скорошно проучване доказа, че PM2.5 може да индуцира меланогенеза чрез регулиране на тирозиназата (TYR) и свързаната с тирозиназа протеин 1 (TYRP1) и 2 (TYRP2) експресия чрез арил въглеводороден рецептор (AhR)/митоген-активирана протеин киназа, сигнализираща активация.[ 2] AhR е широко разпространен в кожните клетки и неговото лигиране контролира окисляването/антиоксидацията, функцията на епидермалната бариера, фото-индуцирания отговор, вродения имунитет и меланогенезата. Той може да се активира от диоксин и полициклични ароматни въглеводороди (съставните части на PM2.5) и неговото активиране индуцира транскрипцията на гени, кодиращи както фаза I, така и фаза II ксенобиотични метаболитни ензими (цитохроми P450 [CYP] 1A1, CYP1A2 и CYP1B1). [3,4] BaP и опасните диоксини активират AhR със силно генериране на реактивни кислородни видове (ROS), което е поне частично медиирано от CYP1A1. Освен това медиираният от CYP1A{30}} оксидативен стрес е отговорен за производството на провъзпалителни цитокини, като интерлевкин (IL)-1, IL-6 и IL-8 в околната среда третирани със замърсители човешки кератиноцити [3,5] Въпреки това, има много малко проучвания за токсичните ефекти на PM2.5 върху меланогенетичните клетки. Тук третирахме човешки меланомни клетки A375 с различни концентрации на PM2.5, за да изследваме дали PM2.5 може да стимулира меланогенезата и връзката му с AhR сигнализиране, оксидативен стрес и възпалителна реакция.
Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време, ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да пречиства DPPH свободните радикали и има способността да пречиства реактивните кислородни видове и да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена, а също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на анионите от свободните радикали на тимина.
Кликнете върху добавката Cistanche Tubulosa
【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
PM2.5 бяха събрани през зимата (от декември до януари) в Пекин. HY-1000 интелигентен пробоотборник за общо суспендирани частици (TSP) с голям поток (допълнителен нож за PM2,5, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Qingdao, Китай) беше използван за вземане на проби от кварцов филтър. Кварцовата мембрана се потапя в 75 процента етанол, последвано от ултразвуково разклащане. Използва се стерилна вода за приготвяне на изходен разтвор с висока концентрация. Човешки меланомни клетки A375 се култивират в 5% CO2 при 37 градуса в обикновена среда на Dulbecco, модифицирана на Eagle's Medium (Invitrogen Co., Ltd., Карлсбад, Калифорния, САЩ), съдържаща фетален говежди серум (Gibco, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ). A375 клетки бяха третирани с различни концентрации на PM2.5 (0, 100, 200 и 400 ug/mL) в продължение на 24 часа и клетките бяха използвани за следните изследвания. Несдвоен t-тест на Student и еднопосочен анализ на дисперсията бяха използвани за статистически анализ и P <0.05 се счита за статистически значимо.
За да се изследва влиянието на PM2.5 върху A375 клетки, клетъчната пролиферация беше открита с помощта на комплект CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) и клетъчната апоптоза беше открита с помощта на Анексин V флуоресцеин изотиоцианат/ пропидиев йодид (FITC/PI) комплект за апоптоза (Multisciences, САЩ), въз основа на инструкциите на производителя. Резултатите показват, че PM2.5 проявява зависима от концентрацията цитотоксичност към A375 клетки, но не повлиява апоптозата [допълнителна фигура 1, http://links.lww.com/CM9/A917].
За определяне на съдържанието на меланин се използва методът на NaOH. PM25-третираните A375 клетки бяха промити с фосфатно буферен физиологичен разтвор (PBS) и лизирани с вода. Лизатите се центрофугират при 12, 000 r/min за 5 минути, промиват се с 10 процента трихлороцетна киселина (500 mL) (Sigma, St. Louis , MO, USA) и 75 процента етанол (500 mL), и след това отново се избистря. След това към пелетите се добавят 50 mL от 1 mol/L NaOH, съдържащ 10 процента диметилсулфоксид за 1 час при 80 градуса. Абсорбцията при 490 nm (OD 490) се измерва с помощта на четец на микроплаки. Тъй като TYR е най-важният меланогенен ензим, след това открихме активността на TYR с помощта на теста за леводопа (L-DOPA). Плаките Sixwell (Corning, USA) се посяват с A375 клетки при плътност от 3 105 клетки/ямка. След това клетките се промиват с PBS и се лизират с 0,5 процента натриев деоксихолат (Sigma). Лизатът се разделя на три групи и към всяка проба се добавя 0,1 процента L-DOPA (Sigma). След 5 минути се измерва OD 490 и се използва 0,1 процента L-DOPA като стандарт. Ние също така измерихме нивата на експресия на mRNA и протеин на TYR. Общата РНК се екстрахира с помощта на мини комплект RNeasy (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ). Обратната транскрипция беше извършена с помощта на комплекта ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, Япония). След това беше извършена количествена полимеразна верижна реакция в реално време (qRT-PCR) на Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Япония). Праймерите от Invitrogen са представени в допълнителна таблица 1, http://links. lww.com/CM9/A917 и нивото на експресия на всяка тРНК се изчислява с помощта на метода 2*DDCT. Нивата на протеинова експресия се анализират чрез Western blotting. Клетките се промиват с PBS и се лизират в RIPA буфер (Beyotime, Китай), съдържащ фенилметилсулфонил флуорид (микс от протеазен инхибитор, 20:1, Sigma-Aldrich). Концентрациите на протеин се измерват с помощта на комплект за анализ на протеин BCA (Beyotime, Китай). Общият протеин се вари при 70 градуса за 10 минути, разделя се в 4 процента -12 процента гел при 200 V за 40 минути, прехвърля се върху мембрана при 4 градуса, използвайки 120 mA за 75-100 минути, и след това се инкубира с 5 процента обезмаслено мляко за 1 час. След това мембраните се изследват с анти-TYR, анти-AhR, анти-CYP1A1 и анти-CYP1B1 антитела (Abcam) за една нощ при 4 градуса. Като вторично антитяло се използва конюгирано с хрян пероксидаза анти-мише IgG антитяло (Proteintech, САЩ). Резултатите показват, че PM2.5 повишава съдържанието на меланин и активността на TYR в зависимост от дозата. Нивата на експресия на mRNA и протеин на TYR бяха регулирани нагоре [допълнителна фигура 2 A–D, http://links.lww.com/CM9/A917].
PM2.5 може да регулира активността на TYR чрез активиране на пътя на AhR. За да определим дали PM2.5 засяга сигнализирането на AhR, открихме нивата на транскрипция на AhR и неговите класически низходящи гени CYP1A1 и CYP1B1 чрез qRT-PCR и Western blotting. Резултатите показват, че PM2.5 повишава нивата на експресия на mRNA на AhR и CYP1A1, както и протеиновата експресия на CYP1A1 [допълнителна фигура 2 E–G, http://links.lww.com/CM9/A917].
Активирането на AhR причинява генериране на ROS, което също може да увеличи активността на TYR.[5] Следователно, ние оценихме производството на ROS, използвайки 20,70 -дихлорофлуоресцеин диацетат (DCFHDA) и поточна цитометрия. След 24 часа третиране с PM2.5, A375 клетки се инкубират с DCFH-DA (5 mmol/L) в продължение на 30 минути при 37 градуса на тъмно. Клетките се промиват два пъти в PBS и флуоресценцията се измерва с поточен цитометър. Средният интензитет на флуоресценция се определя количествено с помощта на софтуера FACS Diva 6.0 (BD Bioscience, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ). Тъй като се смята, че индуцираното от CYP1A{14}} производство на ROS е отговорно за възпалителния отговор [5], нивата на експресия на иРНК на провъзпалителни цитокини (IL-1a, IL-6, IL{ {19}} и фактор на туморна некроза [TNF]-a). Беше установено, че PM2.5 повишава производството на ROS, както и нивата на IL-1a, IL-6 и IL-8 мРНК в клетки A375 [Допълнителна фигура 2 H и I, http ://връзки. lww.com/CM9/A917].
Констатациите от това проучване показват, че PM2.5 насърчава меланогенезата и повишава както активността, така и експресията на TYR в A375 клетки. Освен това, PM2.5 може да активира сигнализирането на AhR и да предизвика оксидативен стрес и възпалителен отговор, което може да бъде меланогенна сигнална каскада, отговорна за хиперпигментацията.
Благодарности
Изразяваме нашата искрена благодарност на следното: проф. д-р Масутака Фуруе и проф. д-р Цуджи Гаку от университетската болница в Кюшу, които подобриха ръкописа и помогнаха с информацията, свързана с AhR. Ние също така сме благодарни за редакцията на английски език, предоставена от проф. д-р Робърт Шварц от Медицинското училище в Рутгерс, Ню Джърси.
Финансиране
Това проучване е подкрепено от грант от Националната природонаучна фондация на Китай (№ 2101000271).
Конфликти на интереси
Нито един.
Препратки
Peng F, Xue CH, Hwang SK, Li WH, Chen Z, Zhang JZ. Излагане на фини прахови частици, свързано със сенилно лентиго при китайски жени: напречно проучване. J Eur Acad Dermatol Venereol 2016;31:355–360. doi: 10.1111/jdv.13834.
Shi Y, Zeng Z, Liu J, Pi Z, Zou P, Deng Q и др. Праховите частици насърчават хиперпигментацията чрез AhR/MAPK сигнализиращо активиране и чрез повишаване на паракринните нива на a-MSH в кератиноцитите. Environ Pollut 2021; 278: 116850. doi: 10.1016/j.envpol.2021. 116850.
Peng F, Tsuji G, Zhang JZ, Chen Z, Furue M. Потенциална роля на PM2.5 в меланогенезата. Environ Int 2019; 132: 105063. doi 10.1016/j. envint.2019.105063.
Napolitano M, Patruno C. Арил въглеводороден рецептор (AhR) възможна цел за лечение на кожни заболявания. Медицински хипотези 2018; 116: 96–100. doi: 10.1016/j.mehy.2018.05.001.
Dijkhoff IM, Drasler B, Karakocak BB, Petri-Fink A, Valacchi G, Eeman M, et al. Въздействие на частиците във въздуха върху кожата: систематичен преглед от епидемиология до in vitro проучвания. Част Fiber Toxicol 2020; 17:35. doi 10.1186/s12989-020-00366-y.
【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
