Ракът на стомаха (GC) е първата водеща заболеваемост и втората водеща смъртност от рак на храносмилателната система

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме

Лечението с платинени лекарства е една от най-преобладаващите химиотерапевтични стратегии за пациенти с рак на стомаха (GC). Въпреки това, терапевтичният ефект е по-малко от задоволителен, до голяма степен поради придобитата резистентност към платиновите лекарства. Следователно по-доброто разбиране на основните механизми може значително да подобри терапевтичната ефикасност на GC. В това проучване ние имахме за цел да изследваме функциите/механизмите, свързани с химиорезистентност, и клиничното значение на глюкозо-регулирания протеин 75 (GRP75) в GC. Тук нашите данни показват, че в сравнение с клетките SGC7901, експресията на GRP75 е значително по-висока при резистентност към цисплатин (клетки (SGC7901 *). Нокдаунът на GRP75 премахва поддържането на потенциала на митохондриалната мембрана (MP) и инхибира ядрения фактор еритроид{{ 10}}свързан фактор 2 (NRF2), фосфатидилинозитол 3 киназа/протеин киназа B (Pl3K/AKT), индуцируем от хипоксия фактор 1a (HIF-1a) и c-myc, което доведе до блокиране на активирането на техните цели надолу по веригата. Тези процеси намаляват способностите за антиоксидация/апоптоза и променят метаболитното препрограмиране в клетките SGC7901, което води до повторно сенсибилизиране на тези клетки към цисплатин. Свръхекспресията на GRP75 в клетките SGC7901 обаче причинява противоположните ефекти. Модел на ксенотранспланти потвърди горепосочените резултати.При пациенти с GC, получаващи химиотерапия с платина и мета-анализ, високото ниво на GRP75 е положително свързано с агресивни характеристики и лоша прогноза, включително, но не само, стомашно-чревни чревни ракови заболявания и е независим предиктор за общата преживяемост. Колективно, нашето проучване показа, че GRP75 участва в резистентността към цисплатин на GC и че GRP75 може да бъде потенциална терапевтична цел за възстановяване на лекарствения отговор в резистентни към платина клетки и полезен допълнителен прогностичен инструмент при насочване на клиничното управление на пациенти с GC.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Въведение

Ракът на стомаха (GC) е първата водеща честота и втората водеща смъртност от рак на храносмилателната система в Китай. Настоящите лечения за напреднал GC бяха хирургическата операция, комбинирана със системна химиотерапия, но дългосрочната преживяемост беше по-малко от задоволителна поради високия брой следоперативни рецидиви2. В клиничната практика платиновите лекарства бяха едно от средствата от първа линия за напреднали GC химиотерапия3. Придобитата резистентност към лекарства обаче винаги се появява след множество цикли на лечение на основата на платина и показва лоша прогноза.цистанчСледователно, осветяването на потенциалните механизми и идентифицирането на новите терапевтични стратегии за преодоляване на резистентността към платинени лекарства при пациенти с GC бяха спешно от съществено значение.

Cistanche може да спре стареенето

Глюкозо-регулираният протеин 75 (GRP75) е индуцируемият от стрес молекулярен шаперон, който принадлежи към семейството на протеините на топлинния шок4. Свръхекспресията на GRP75 е тясно свързана с туморната прогресия при различни човешки ракови заболявания5-7. Тук, чрез изследване на мета-анализ, открихме, че високо ниво на GRP75 показва значително лоша прогноза при няколко вида рак на храносмилателната система (колоректален рак, холангиокарцином и рак на панкреаса). За лекарствена резистентност, инхибирането на GRP75 обърна резистентността към цисплатин и доксорубицин при хепатоцелуларен карцином и рак на яйчниците. GRP75 класически секветира p53 в цитоплазмата, което води до инактивиране на функцията на p53 и потискане на ап-тозата10. Предишно проучване съобщава, че GRP75 положителните тумори имат по-лоша прогноза в сравнение с GRP75 отрицателните тумори при GC с нормална функция на p53. Въпреки това, p53 е един от най-често мутиралите гени при GC (засягащ повече от 50 процента от пациентите) l2-15. Така че ние предположихме че в допълнение към класическата репресия на активността на p53, GRP75 може да участва в индуциране/поддържане на резистентност към платинени лекарства в GC чрез използване на ап53-независим начин.

В това проучване по-високата експресия на GRP75 допринася за резистентност към цисплатин в клетки SGC7901 и в модел на ксенотранспланти. Механично, GRP75 индуцира/поддържа резистентност към цисплатин чрез регулиране на антиокислителните/апоптозни способности и свойствата на метаболитно препрограмиране.cistanche АвстралияПри пациенти с GC свръхекспресията на GRP75 допринася за агресивните характеристики и лошата прогноза. Нашите резултати показват, че GRP75 насърчава резистентността към цисплатин при GC и може да бъде биомаркер за прогнозиране на отговора на лечението с платиново лекарство.Cistanche ползиНасочването към GRP75 може да осигури ново разбиране на GC системната химиотерапия.

Резултати

Ефектите на GRP75 върху резистентността към цисплатина в GC анализи на клетъчната жизнеспособност бяха използвани за проверка на резистентността на SGC7901~ клетки, Ipsos (uM) на цисплатина за SGC7901 и SGC7901CR клетки бяха: 5,518 срещу 72,46 (Фиг. 1А). Въз основа на базите данни на KM-Plotter, повишената експресия на GRP75 показва лоша прогноза (Фигура 1B). Освен това, значително повишени експресии на GRP75 в клетки SGC7901CR в сравнение с неговите родителски клетки SGC7901 (фиг. 1C), което предполага, че GRP75 може да допринесе за резистентността към цисплатин. За да се провери тази хипотеза, клетките SGC7901~ бяха трансфектирани от scramble- или GRP75 siPHK и IC50s (uM) на цисплатин за разбъркани или GRP75 siRNA трансфектирани SGC7901CK клетки бяха: 50,83 срещу 20.86, съответно (фиг. 1D). За разлика,

свръхекспресия на GRP75 чрез трансфектиране на GRP75 плазмидите в SGC7901 клетки показа, че IC50s на цисплатин за разбъркани или GRP75 плазмиди, трансфектирани SGC7901 клетки, са 3,825 срещу 6,98 (Фигура 1Е). Взети заедно, тези резултати разкриват, че GRP75 играе решаваща роля в поддържането/индуцирането на резистентност към цисплатин в GC, но механизмите остават допълнително изследвани.

Потенциалните механизми, лежащи в основата на GRP75, причиняват резистентност към цисплатин

Изтеглихме набори от данни за микрочипове GSE122130 (SGC7901CR срещу SGC7901) и GSE14209 (тъкани, устойчиви на цисплатин срещу чувствителни на цисплатин) от GEO, след което извършихме GO-Biological process и анализ на обогатяване на KEGG-Pathway на базата на DAVID и топ 10 резултатите са показани на Фиг.2A-D. Съществените разлики в биологичните процеси между клетките SGC7901C* и клетките SGC7901 включват редуциране на окисление, апоптотичен процес (фиг. 2A), анализът на обогатяване на KEGG-Pathway установи, че наборите DEG са тясно свързани с метаболитните пътища и фосфатидилинозитол 3 киназа/протеин киназа B (PI3K/AKT) път (фиг. 2B). Отговорът към лекарството беше включен в съществените разлики на биологичните процеси между резистентни към цисплатин и чувствителни към цисплатин туморни тъкани и метаболитният път също беше основната връзка в анализа на обогатяване на KEGG-Pathway (Фигура 2C, D). Освен това, мрежа от 60 протеина, които значително взаимодействаха с GRP75, беше конструирана с помощта на базата данни String, след което анализът на KEGG-Pathway показа, че метаболитните пътища играят важна роля между GRP75 и неговите интерактори (фиг. 2E). Въз основа на тези резултати предположихме, че антиоксидацията/апоптозата и метаболитното препрограмиране могат да насърчат оцеляването и растежа на GC, което води до резистентност към цисплатин. Въпреки това, механизмите на участие на GRP75 в регулирането се нуждаят от допълнително проучване (фиг. 2F).

Ефекти на GRP75 върху антиокисление и антиапоптоза Тук вътреклетъчното ниво на ROS е повишено в SGC7901CR клетки в сравнение с неговите родителски двойници (Фиг. 3A), което предполага, че SGC7901Ck клетките са били изложени на относително по-високи условия на оксидативен стрес. Предишно проучване разкри, че GRP75 участва в стабилизирането на MMP, важен източник на генериране на ROS. Тук нокдаунът на GRP75 премахва поддържането на ММР в SGC7901CK клетки, индуцирани от цисплатин, и свръхекспресията на GRP75 има обратен ефект в SGC7901 клетки (Фиг. 3B).цистанчен холестеролСлед това потвърдихме връзката между GRP75 и антиокислението и антиапоптозата. Както е показано на Фиг. 3C, нокдаунът на GRP75 намалява нивото на фактор 2, свързан с ядрен фактор еритроиден-2- (NRF2) и неговите целеви гени надолу по веригата (HO-1 и NQO-1) в SGC7901 ~ клетки и свръхекспресията на GRP75 показва противоположния ефект в клетките SGC7901. Освен това, нокдаунът на GRP75 или NRF2 в клетките SGC7901CR допълнително засили вътреклетъчните ROS поколения, апоптозата (фиг. 3D) и активностите на каспаза-3 (допълнителна фигура S1), индуцирани от цисплатин. За разлика от това, свръхекспресията на GRP75 в клетки SGC7901 значително отслабва индуцираните от цисплатин ROS поколения, клетъчна апоптоза (Фиг. 3E) и активности на каспаза-3 (допълнителна фигура S1). Тези резултати разкриха, че GRP75 поддържана/индуцирана резистентност към цисплатин може да бъде чрез индуциране на антиокисление и антиапоптоза в GC клетки.

Ефекти на GRP75 върху метаболитното препрограмиране След това допълнително проучихме как GRP75 индуцира промяна на метаболитното препрограмиране. Все повече доказателства показват, че метаболизмът на туморните клетки не е анормална промяна в единичен метаболитен път, а препрограмиране на цялата клетъчна метаболитна мрежа17. Много класически онкогени или сигнални пътища са участвали пряко или косвено в метаболитно препрограмиране, като PI3K/AKT, индуцируем от хипоксия фактор la (HIF-la), c-myc и т.н.“'819. Следователно, ние проверихме дали GRP75 е участващи в метаболитното препрограмиране на GC клетки. Както е показано на Фигура 4A, наблюдавахме повишени нива на p-AKT, HIF-la и c-myc в клетките SGC7901CR в сравнение с неговите родителски клетки SGC7901. Освен това, в клетките SGC7901CR, нокдаунът на GRP75 намалява индуцираните от цисплатин нива на p-AKT, HIF-la и c-Myc протеини и техните низходящи цели, свързани с гликолизата (HK2: хексокиназа 2; PDK1: пируват дехидрогеназа киназа 1; и LDHA: лактат дехидрогеназа А верига). Напротив, свръхекспресията на GRP75 в клетките SGC7901 показва обратния ефект (фиг. 4B, C). Освен това, нокдаунът на GRP75 или AKT в клетките SGC7901CR показва значително намаляване на усвояването на глюкоза и клетъчната жизнеспособност/растеж, индуцирани от цисплатин; свръхекспресия на GRP75 в клетки SGC7901 значително повишава способността за усвояване на глюкоза и клетъчната жизнеспособност/растеж, причинени от цисплатин (фиг. 4D-F). Взети заедно, тези данни показват, че GRP75 поддържа/индуцира резистентност към цисплатин в GC клетки може да бъде чрез участие в медиирано от p-AKT, HIF-la и c-myc метаболитно препрограмиране.

Потвърждение на in vitro данните в модел на ксенотрансплантация След това изследвахме потенциалното клинично значение на GRP75 in vivo. Данните от ксенотрансплантата показват, че лечението само с цисплатин или нокдаун само на GRP75 може да инхибира растежа на тумора; въпреки това, лечението с цисплатин, комбинирано с нокдаун на GRP75, значително улеснява индуцираното от цисплатин инхибиране на туморния растеж (фиг. 5А). Освен това IHC и qPCR анализите показват, че цисплатин плюс GRP75 siRNA значително намалява експресиите на Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT и цели надолу по веригата в сравнение със самото лечение с цисплатин, но повишава апоптозата (както е определено чрез оцветяване с TUNEL, Фиг. 5B , ° С). Взети заедно, тези резултати показват, че чрез регулиране на способностите за анти-оксидация/анти-апоптоза и метаболитно препрограмиране, GRP75 стимулира in vivo преживяемостта и растежа, което от своя страна води до резистентност към цисплатин на GC.

Идентифициране на GRP75 като характерен фактор, насърчаващ рака и клиничното значение на GRP75 при GC

След това оценихме експресията на GRP75 в последователни секции на GC проби. Както е показано на Фиг. 6А, в сравнение със съседни нетуморни стомашни тъкани, се наблюдава значително повишаване на експресията на GRP75 в GC тъканите. Свръхекспресията на GRP75 беше демонстрирана в GC тъкани чрез IHC-интензитет резултат (Фиг. 6B). По-силно оцветяване за GRP75 също се наблюдава с увеличаване на TNM класификацията на стадия на злокачествени тумори (фиг. 6C, D). След това разделихме тези 116 GC проби на две групи ("GRP75 нисък" срещу "GRP75 висок", според IHC-интензитета, Фиг. 6E). Напречните диаметри на туморите в групата "GRP75 high" са значително по-големи от тези в групата "GRP75 low" (фиг. 6F). Допълнително потвърдихме клиничната прогноза на GRP75 в GC. Анализът на преживяемостта на Kaplan-Meier също показа, че пациентите с GC в групата с "GRP75 висок" имат по-лоша обща преживяемост от тези в групата с "GRP75 нисък" (фиг. 6G).

Многовариантният анализ установи, че GRP75 е независим предиктор за общата преживяемост (Таблица 1).Cistanche deserticola странични ефекти,В обобщение, тези резултати предполагат, че GRP75 има характерна роля в водещата прогресия на GC, резистентност към цисплатин и лоша прогноза. Мета-анализ на високото ниво на GRP75 с прогноза Диаграма на потока от търсене и подбор на литература и мета-анализ са показани на допълнителна фигура S2. Моделът със случаен ефект и моделът с фиксиран ефект бяха използвани за изчисляване и анализ на стойността на HR, като и двата показаха, че високите нива на GRP75 са значително свързани с лоши резултати за пациентите. Обединеният HR е 1,91 (95 процента CI 1,62 до 2,25), с хетерогенност (I'=0.0 процента, p =0.559) (Фиг. 7A). След това направихме анализ на подгрупи, който показа, че нивото на експресия на GRP75 при рак на стомашно-чревния тракт (обобщеният HR беше 1,99,95 процента CI 1,64 до 2,43), има значителна връзка с лошата прогноза за оцеляване. Разбира се, подобни резултати са открити и при други тумори (обобщеният HR е 1,74,95 процента CI 1,29 до 2,33) (Фигура 7B). И двете

Графиката на фунията на Begg и тестът на Egger бяха използвани за оценка на възможното отклонение на публикуването на включените проучвания. При анализа на връзката между GRP75 и OS, p-стойността на теста на Begg и теста на Egger бяха 0.076 и 0,024, съответно (фиг.7C и D). Въпреки това, тестът на Egger има по-висока чувствителност при оценката на пристрастията на публикацията. По този начин беше използван методът на изрязване и запълване, за да направим нашите резултати по-достоверни. Както е показано на фиг. 7E, коригираният HR в модела с фиксиран ефект е 1,785 (95 процента CI 1,530 до 2,081, p<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

Дискусия

В това проучване използвахме един от химиотерапевтичните агенти от първа линия за пациенти с GC, платинени лекарства. Класически, платиновите лекарства могат ковалентно да се свържат с гуанин върху ДНК веригата и по този начин да блокират репликацията и транскрипцията на DNA2. Въпреки това, поради лекарствената резистентност и нежеланите странични ефекти, идентифицирането на нови терапевтични стратегии за обръщане на резистентността при пациенти с GC беше спешно от съществено значение. В допълнение, пациентите с GC развиват лекарствена резистентност след получаване на няколко курса на цисплатин и нашите резултати показват, че клетките SGC7901~ проявяват значителна резистентност към цисплатин в сравнение с клетките SGC7901.

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) играе ключова роля в регулирането на инициирането и прогресирането на човешки рак-7. Съвсем наскоро стана ясно, че GRP75 също има критична роля в резистентността към химиотерапия. В допълнение към GRP75, други протеини на топлинен шок играят критична роля в резистентността към цисплатин чрез PI3K/AKT/NF-KB и други пътища21-24 Въпреки това рядко се съобщава за молекулярния механизъм на GRP75 и резистентност към цисплатин. Тук нашето проучване разкри, че GRP75 насърчава способностите за антиоксидация/апоптоза и променя метаболитното препрограмиране, което води до резистентност към цисплатин в GC клетки. Ние също така открихме, че GRP75 е регулиран нагоре в SGC7901~ клетки и в тъканни проби от пациенти и е свързан с лекарствена резистентност, про-оцеляване, растеж и лоши резултати. Междувременно многовариантният анализ установи, че GRP75 е независим предиктор за общата преживяемост. Освен това мета-анализът показва, че високото ниво на GRP75 показа лоша прогноза, включително, но не само GC, което беше в голяма степен в съответствие с нашето изследване.Всички горепосочени резултати потвърдиха, че насочването към GRP75 може се очаква да се превърне в нов подход за обръщане на резистентността към цисплатин и подобряване на прогнозата при пациенти с GC.

При физиологични условия клетките неизбежно са били изложени на ROS от външни фактори и вътреклетъчен аеробен метаболизъм. Като нож с две остриета подходящите ROS са важни сигнални молекули, които регулират нормалната функция на клетките, докато прекомерната ROS води до апоптоза. Следователно в тялото съществува прецизна антиоксидантна регулаторна система за поддържане на редокс баланс и апоптотични процедури 20. Въпреки това, за разлика от физиологичните състояния, нивата на ROS на тумори като цяло са значително по-високи от нормалните контроли от същия тъканен произход, което определя съществуването на специален антиоксидантна система в туморните клетки, особено за резистентните на лекарства туморни клетки27-29. Нашите резултати потвърдиха, че клетките SGC7901CR показват относително по-високо ниво на ROS в сравнение с клетките SGC7901 и че GRP75 повишава капацитета на антиокисление/апоптоза. Туморните клетки имат дълга история на метаболитни аномалии. Още през 30-те години Ото Варбург открива, че туморните клетки предпочитат гликолизата. Дори при условия на достатъчно кислород, туморните клетки все още поддържат високи нива на гликолиза за генериране на АТФ. Този анормален метаболитен модел беше наречен "ефект на Варбург"3031. Водените от ефекта на Warburg метаболитни промени наскоро бяха посочени като метаболитно препрограмиране и проучванията на тези промени предоставиха по-задълбочено разбиране на метаболизма на GC клетките. Беше демонстрирано, че GC клетките и нормалните клетки показват метаболитни разлики не само в метаболизма на глюкозата, но и в метаболизма на липидите и аминокиселините³2-35. В това изследване установихме, че промените в метаболизма на глюкозата са една от основните връзки, поддържащи клетъчния растеж, което в крайна сметка води до резистентност към GC цисплатин.

Както споменахме, класическите онкогени и сигнални пътища като PI3K/AKT, HIF-la и c-myc са пряко или косвено включени в метаболитното препрограмиране. Активирането на PI3K/AKT пътя в туморните клетки засилва много от метаболитните дейности. Първо, той позволява на клетките да усвояват глюкоза, аминокиселини и други хранителни вещества. Второ, AKT повишава гликолизата и производството на лактат чрез своите ефекти върху генната експресия и ензимната активност и е достатъчна, за да индуцира War-burg ефект в раковите клетки. Трето, активирането на този път подобрява биосинтезата на макромолекулите и стимулира експресията на липогенни гени и синтеза на липиди'7. Освен това, GRP75-активираната AKT и извънклетъчните сигнално-регулирани протеин кинази 1 и 2 инхибираха конформационните промени на Bax и апоптозата 8. Туморните клетки се адаптираха към хипоксия, включваща метаболитно препрограмиране чрез регулиране на HIF-la целеви гени за стимулиране на усвояването на глюкоза, гликолизата, производство и секреция на млечна киселина, съхранение на гликоген, глутаминов катаболизъм³ и насърчаване на натрупването на триглицериди в липидните капчици³. Съвсем наскоро стана ясно, че GRP75 може да се свързва специфично с HIF-la и да се насочва към външната митохондриална мембрана, свързана с VDAC1 и HK2, които предотвратяват апоптозата. C-myc може да медиира метаболитното препрограмиране по редица начини и c-myc-медиираното метаболитно препрограмиране до голяма степен се постига чрез засягане на митохондриите. От една страна, c-myc също насърчава гликолизата чрез директно регулиране на експресията на свързани с гликолитика ензими, включително LDHA, HK2 и PDK11938. От друга страна, c-myc активираните ензими, участващи в метаболизма на глутамин чрез транскрипция, насърчават използването на глутамин от митохондриите в туморните клетки. Този ефект се нарича "глутаминолиза". Освен това, свръхекспресията на GRP75- намалява Cyclin-B1 и повишава Cyclin-D1 и c-myc, за да насърчи растежа на раковите клетки на яйчниците*. Въз основа на нашите настоящи резултати, ние предоставихме ново разбиране за резистентността към GC цисплатин чрез GRP75 като потенциално важна връзка в регулирането на мрежите за метаболитно препрограмиране на тумора.

Изводи

В заключение, ние показахме, че свръхекспресията на GRP75 може да насърчи оцеляването/растежа в GC клетките чрез регулиране на анти-оксидация/апоптоза и мрежи за метаболитно препрограмиране, като по този начин индуцира резистентност към цисплатин

Материали и методи

Клетки, реактиви и условия на култивиране

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.0 процента чистота), е закупен от Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай). Клетките се култивират в среда RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA), допълнена с 10 процента фетален говежди серум (FBS), 100 U/ml пеницилин, 100 ug/ml стрептомицин (Gibco) и се инкубират в 5 процента CO2 при 37 градуса. За поддържане на фенотипа на резистентност към цисплатин, клетките SGC7901CR се инкубират в среда, съдържаща цисплатин (5 μM).

Ксенографти и лечение

Това проучване е одобрено от Комитета за институционална грижа и използване на животните към медицинския университет в Нанкин и животните са третирани хуманно и с оглед на облекчаване на страданието. Голите мишки BALB/c бяха получени от SLRC Laboratory Animal Center (Шанхай, Китай) и конвенционално държани, както описахме по-рано*l. За изследването на ксенотрансплантата, 2 × 10 градуса SGC7901CK клетки в 100 ul матригел бяха инжектирани подкожно в хълбоците на мишките в продължение на 5 седмици. За да се определят ефектите на GRP75 върху цисплатинова резистентност на GC, ние проведохме интратуморален и интраперитонеален инжекционен анализ. Накратко, мишките бяха разделени на случаен принцип в 4 групи (5 мишки на група): (1)MOCK, (2)GRP75KD, (3)MOCK＋цисплатин и （4） GRP75 KD＋цисплатин. 100 ul siRNA （si-Con или si-GRP75, 100 nM) бяха интратуморни инжекции на всеки 3 дни. Групите, подложени на терапия с цисплатин (5 mg/kg), бяха интраперитонеални инжекции 3 пъти седмично, а другите групи бяха перфузирани с равен обем физиологичен разтвор. Туморите се измерват всяка седмица и техните обеми се изчисляват по формулата: V=Y (ширина2 дължина). След 5 седмици мишките бяха умъртвени и туморните тъкани бяха отстранени за по-нататъшно изследване.

Пациенти и тъканни проби

Това проучване е одобрено от Комитета по медицинска етика на Втората свързана болница, Медицински университет в Нанкин и от Болница № 2 на Чанжу на Медицинския университет в Нанкин и писменото информирано съгласие на участника е получено от всеки пациент. Клинико-патологичните данни са изброени в допълнителна таблица S1. Тъканният микрочип е конструиран от Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (Шанхай, Китай), както описахме по-рано*

Клетъчна трансфекция

За трансфекция, разбъркана и pcDNA-3.1-GRP75-Flag бяха синтезирани от General Biotech (Шанхай, Китай); докато siPHK са изброени в допълнителна таблица S2. Клетките бяха временно трансфектирани чрез липофектамин 3000 реагент (Invitrogen, Карлсбад, САЩ), съгласно протокола на производителя. Накратко, клетките се посяват върху 6-плаки с ямки при плътност от 1 × 10 градуса клетки в среда RPMI 1640, съдържаща 10 процента FBS без антибиотици. След инкубиране в продължение на 24 часа, клетките бяха временно трансфектирани с 5 ng/ml разбъркан или GRP75-Flag, или 20 nM si-Con или si-GRP75 в продължение на 12 часа. След трансфекцията клетките се култивират в свежа среда, допълнена с 10 процента FBS за още 24 часа, преди да бъдат използвани за други експерименти.

Количествена полимеразна верижна реакция в реално време (qPCR) Използваните праймери са изброени в допълнителна таблица S3. Изолирането на общата РНК, транскрипцията на РНК към сДНК и работата на qRT-PCR с машината Applied Biosystems 7300HT бяха според предишното ни проучване 2. -актинът беше амплифициран, за да се осигури целостта на сДНК и да се нормализира експресията. Кратните промени в експресията на всеки ген бяха изчислени чрез метод на сравнителен прагов цикъл (Ct), като се използва формулата 2-(4ACt)

Тази статия е извлечена от Dai et al. Откриване на клетъчна смърт (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w