Стомашно-чревен епителен вроден имунитет - регионализация и органоиди като нов модел

Човешкият стомашно-чревен тракт е в постоянен контакт с микробни стимули. Неговите бариери трябва да осигурят съвместно съществуване с комменсалните бактерии, като същевременно позволяват наблюдение на нахлуващи патогени. В центъра на взаимодействието лежи епителният слой, който маркира границите на тялото. Той е оборудван с множество различни вродени имунни сензори, като Toll-подобни рецептори, за монтиране на възпалителни реакции към микроби. Дисфункцията на тази сложна система води до патологии, свързани с възпаление, като възпалително заболяване на червата. Въпреки това, сложността на клетъчните взаимодействия, тяхната молекулярна основа и тяхното развитие остават слабо разбрани. През последните години органоидите, получени от стволови клетки, привличат все по-голямо внимание като обещаващи модели както за развитие, така и за широк спектър от патологии, включително инфекциозни заболявания. В допълнение, органоидите позволяват изследването на епителния вроден имунитет in vitro. В този преглед се фокусираме върху стомашно-чревната епителна бариера и нейната регионална организация, за да обсъдим вроденото имунно усещане и развитие.

Излагането на микробни стимули може да подобри имунитета, тъй като микробните стимули могат да стимулират тялото да произвежда имунни клетки и имунни молекули, като по този начин стимулира имунния отговор на тялото. По-конкретно, излагането на микробни стимули може да активира имунни клетки като макрофаги, дендритни клетки и естествени клетки убийци, да ускори пролиферацията и диференциацията на имунните клетки и да подобри жизнеността и устойчивостта на имунните клетки към болести. В допълнение, микробните стимули могат също така да насърчат възпалителни реакции и имунна регулация и да подобрят имунната защита на организма срещу патогени. Следователно разумното излагане на микробни стимули може да насърчи подобряването на човешкия имунитет. Вижда се, че трябва да подобрим имунитета. Цистанче може значително да подобри имунитета. Месната пепел съдържа различни биологично активни съставки, като полизахариди, две гъби, Huang Li и др. Тези съставки могат да стимулират различни видове месо в имунната система. клетки, повишавайки тяхната имунна жизнеспособност.

Кликнете върху ползите за здравето от цистанче

Ключови думи

Стомашно-чревния тракт. Имунитет. Регионализация и органоиди.

Въведение

Стомашно-чревният (GI) тракт е необходим за смилането на храната и се простира от устната кухина през хранопровода, стомаха, тънките черва и дебелото черво до ануса. Стомашно-чревният лумен е колонизиран от голямо разнообразие от коменсали, симбионти и понякога патогени. Микробната колонизация следва градиент с по-малко от 103 микроби/ml в стомаха до 103 –107 микроби/ml в тънките черва и 1011–1012 микроби/ml в дебелото черво (прегледано в [1–3]). От жлезистия стомах нататък стомашно-чревният тракт е облицован с един слой колонни епителни клетки. Този епителен слой се състои от различни специализирани клетки, плътно свързани от съединителни протеинови комплекси, налагащи физическата бариера (фиг. 1).

Взаимодействието между чревната микробиота, както и погълнатите патогени и епителните клетки се медиира от рецептори за разпознаване на образи (PRR), включително Toll-подобни рецептори (TLR), нуклеотид-свързващ олигомеризационен домен (NOD)-подобни рецептори (NLR) и други цитозолни рецептори (фиг. 2, прегледано в [7, 11]). Тези PRR играят ключова роля в разпознаването на свързаните с микроби молекулярни модели (MAMPs) и молекулярни модели, свързани с увреждане (DAMPs). При активиране на PRR в епителните клетки, сигналните каскади надолу по веригата индуцират експресията на различни цитокини и хемокини чрез възпалителни пътища, като пътя на NF-κB, за насочване на професионалните имунни клетки (прегледано в [8, 12–16]). В допълнение към класическите PRR, наскоро бяха открити допълнителни сензори за бактериална активност, като алфа-киназа 1 (ALPK1) [17–19]. Инфламазомите, цитоплазмените комплекси, съставени от NLR протеини, разпознават допълнителни молекулярни модели, като бактериални метаболити (прегледани в [7, 9]).

Стомашно-чревните вродени имунни отговори, включително PRR отчитането, трябва да балансират нуждата от защита от потенциално вредни патогени с възможността да толерират излагането на разнообразния луминален микробиом. Следователно, експресията и функцията на PRR сигнализирането се очаква да имат голямо въздействие не само върху отчитането на патогени, но и върху тъканната хомеостаза (Каре 1) и възпалителни заболявания, включително остър гастроентерит, гастрит и възпалителни заболявания на червата (IBD) (прегледани в [ 12, 13, 20, 21]). Въпреки че всяко от тези заболявания показва напълно различни патогенези, те споделят критична характеристика: интерфейсът между околната среда и тялото е значително нарушен. Въпреки това продължава дебат дали промените в чревния епителен слой, по-специално тези, които засягат неговата вродена имунна функция, са причина или следствие от гореспоменатите заболявания.

Повечето знания за PRR сигнализирането са събрани от изследвания върху хемопоетични клетки. Беше предизвикателство да се разграничат функциите на PRR сигнализирането в епителните клетки от тези на инфилтриращите имунни клетки. Основните пречки включват трудности при изолирането на чисти епителни клетки и повишаване на надеждни антитела срещу PRRs. С напредването на органоидите, които произлизат от чревни епителни стволови клетки, сега е наличен редукционистки експериментален модел, който позволява изследвания на вродения имунен отговор на първичните епителни клетки. Органоидите се дефинират като получени от стволови клетки, 3- дименсионални клетъчни култури, които имат способността за самоорганизиране и запазват част от функцията на оригиналния орган (напр. секреция, филтриране, абсорбция, свиване). Тъй като органоидите могат да се отглеждат или от резидентни в тъканите възрастни стволови клетки (ASCs), или от плурипотентни стволови клетки (PSCs), клетките не са трансформирани. Заедно двата вида органоиди покриват обширен репертоар от органи, които могат да бъдат имитирани (прегледано в [4, 22, 23]). И двете технологии имат своите предимства (разгледани в [4, 22, 23]). Например, култури от органоиди, получени от ASC, имат огромен потенциал за разширяване и са относително хомогенни, а органоидите, получени от PSC, са по-сложни в смисъл, че комбинират клетки с много различен произход на развитие (напр. епителни и мезенхимни клетки). Органоидите, получени от PSC, позволяват анализ на етапите на развитие, но може да не достигнат пълното ниво на диференциация в епителния слой, както е установено in vivo [24]. Органоидите, получени от ASC, генерирани от фетални тъкани, могат също така да позволят изследването на съзряването на феталния епител, тъй като те стареят в културата [24, 25].

Този преглед ще подчертае прозрения от проучвания, използващи органоиди, и ще обсъди потенциала на тази технология за изследване на епителния вроден имунитет. Ние се фокусираме върху регионалната организация в стомашно-чревния тракт.

Регионална идентичност и вродена имунна сигнализация в стомашно-чревния тракт

Когато разглеждаме стомашно-чревните заболявания, важно е да се отбележи, че някои от тях са ограничени до определен участък от стомашно-чревния тракт. IBD включва болест на Crohn (CD) и улцерозен колит (UC), които показват диференциален и специфичен за заболяването модел на възпаление: докато UC започва в ректума и се намира в дебелото черво, CD може да засегне всички части на стомашно-чревния тракт от устната кухина към ануса. Освен това, CD се характеризира със сегментно, прекъснато възпаление в стомашно-чревния тракт, докато UC обикновено се описва като непрекъснато възпаление на дебелото черво (прегледано в [26, 27]). В хранопровода, стомаха и дебелото черво честотата на рак е висока и инфекцията и възпалението могат да насърчат развитието и прогресията на тези видове рак (прегледано в [28, 29]). Обратно, злокачествената трансформация в тънките черва е много рядка (преглед в [30]). Очевидната сегментна специфичност на тези заболявания в стомашно-чревния тракт остава енигматична, но е изкушаващо да се спекулира, че техният специфичен за региона произход се корени в специфични за региона нарушения на тясно балансираната система на функцията на епителната бариера, вродения имунитет и регенерацията на лигавицата . Следователно е интересно да се подчертаят разликите в сегментите в стомашно-чревния тракт.

Стомашно-чревният тракт се състои от няколко анатомично дефинирани сегмента с много различни физически функции (прегледано в [31]). Основната функция на стомаха е смилането на храната и елиминирането на входящите патогени от стомашната киселина. Хранителните вещества не трябва да достигат до епителния слой на стомаха; по този начин тялото силно инвестира в защитна слузна бариера, предпазваща епителните клетки не само от неговата киселина, но и от луминално съдържание (прегледано в [32, 33]). Обратно, основната функция на тънките черва е не само храносмилането, но и усвояването на хранителни вещества. В съответствие с това, тънките черва имат значително увеличена повърхностна площ поради власинките, изпъкнали в лумена на червата, където клетъчните повърхности влизат в близък контакт с хранителните вещества. По-голямата част от храносмилането се извършва в проксималните части на тънките черва, дванадесетопръстника и йеюнума, където вълните са дълги и тънки. Йеюнумът има най-високото съотношение на клетки на Панет, секретиращи антимикробни пептиди [34], които украсяват доста разхлабената слуз, като по този начин предпазват епителния слой и поддържат криптите стерилни (прегледано в [35]).

Власинките стават прогресивно по-къси и по-широки към илеума (преглед в [36]), където отново слузта поема важна част от защитата: с най-високото съотношение на бокалисти клетки, илеумът има по-дебел слой слуз и по-нисък скорост на храносмилане и абсорбция от йеюнума [34] (преглед в [31]). И накрая, дебелото черво реабсорбира водата и се инвестира в обширна, гъста и двуслойна слузна обвивка, за да може безопасно да приютява трилиони коменсални бактерии. Дебелото черво няма въси и криптите са по-малки от тези на тънките черва. Няма клетки на Панет и съотношението на бокалните клетки може да бъде до 25 процента от епителния слой [37]. По този начин трите чревни сегмента имат различни стратегии за поддържане на безопасно разстояние между епителните клетки и микробиотата. MAMP разпознаването и активирането на имунните пътища е друг слой от това взаимодействие и следователно е разумно те също да са структурирани по стомашно-чревния тракт (прегледано в [38]). Въпреки това остава увлекателна загадка какво точно оформя структурата на PRR организацията.

Въпреки че е интуитивно, че гените, важни за регионалните функции, като храносмилане и усвояване на хранителни вещества, следват пространственото разделение по цефалокаудалната ос (прегледано в [39]), такава организация не се очаква за епителна вродена имунна сигнализация. Предишни проучвания съобщават за регулиране на PRR сигнализирането в отговор на стимулация с MAMPs. Например, реакцията на TLR4 намалява след раждането, вероятно поради излагане на LPS по време на раждането и последваща колонизация на червата [40]. Също така, стимулирането на TLR9 с неговия лиганд CpG-DNA води до намаляване на експресията на Tlr4 и инхибира сигнализирането на TLR4 [41]. По този начин се очакваше, че контактът с микроорганизмите, техните молекули и метаболити в стомашно-чревния тракт ще доведе до заглушаване на експресията на PRR към лумена на червата (прегледано в [14]). Въпреки това, противоречиви резултати, причинени от технически трудности като ненадеждни антитела, насочени към TLR, доведоха до объркване в областта и не беше ясно дали определен PRR е изразен или не (прегледано в [42]). Ранните Northern блотове за иРНК на Tlr2 и Tlr4 в ex vivo изолирани епителни клетки показват, че нивата на експресия на тези две Tlr молекули са специфични за сегмента: Tlr2 се експресира главно в дебелото черво, докато Tlr4 се експресира главно в стомаха и дебелото черво. Авторите наричат ​​това " стратегическа компартментализация“ на тези TLR [43]. Последните проучвания сега откриха, че този принцип на сегментно-специфична експресия се простира отвъд тези два TLR и разкри много сложна регионална организация на PRR сигнализацията, която не винаги следва микробното натоварване [44, 45].

Първото от двете проучвания идва от групата на Бартън и разкрива няколко нива на организация на експресията на TLR. Групата генерира пет щама репортерни мишки, позволяващи анализ на експресия на TLR2, 4, 5, 7 и 9, съответно. TLR2 и 5 се експресират в тънките черва и проксималното дебело черво, TLR4 се експресира в дебелото черво, а TLR7 и 9 не се експресират. Експресията на репортер в органоиди от тези мишки много имитира in vivo експресията, което показва, че експресията е независима от контакт с микробиотата или с имунни клетки [45].

Второто проучване използва биобанка от прясно генерирани човешки и миши органоиди, покриващи различните сегменти на стомашно-чревния тракт: корпус, пилор, дванадесетопръстник, йеюнум, илеум и дебело черво. Транскрипционният анализ на органоидите потвърди моделите на експресия за TLRs, докладвани от групата Barton, но в допълнение разкри огромна степен на диференциална експресия на TLRs, NLRs, компоненти на инфламазома и други гени, свързани с вродения имунитет (фиг. 3 и [44] ]). Например, Nod2 се експресира главно в стомаха, докато експресиите на няколко компонента на пътя на възпалението като Nlrp1b, Nlrp6 и Aim2 са ограничени до червата. Различни рецептори са еднакво експресирани; например, експресията на Tlr3 беше открита във всеки сегмент от миши GI тракт във високи количества, докато Tlr5 беше експресирана във всеки сегмент, но в ниски количества [44]. В резултат на това изглежда, че всеки сегмент има свой собствен, специфичен комплект от вродени имунни рецептори и сигнални компоненти.

Сравняването на мишите с човешките стомашно-чревни органоиди демонстрира, че и при двата вида принципът на сложната организация на PRR сигналните компоненти е един и същ, но индивидуалните профили на PRR експресия могат да се различават. Някои PRR, като TLR4 и NLRP6, са моделирани по подобен начин по стомашно-чревния тракт и на двата вида. TLR4 се експресира предимно в стомаха и дебелото черво, а експресията на NLRP6 е ограничена до сегментите на червата. От друга страна, няколко PRR като TLR1 и TLR2 показват модели, които се различават между двата вида. Докато при миши органоиди експресията и на двата се увеличава по протежение на стомашно-чревния тракт и е най-висока в дебелото черво, при човешки органоиди експресията е най-висока в стомаха и намалява по протежение на стомашно-чревния тракт [44]. Освен това, експресията на TLR5 е по-висока в човешките органоиди, като най-високите нива се наблюдават в стомаха [44].

Както бе споменато по-горе, органоидите също така позволяват тестване дали определен път е функционален чрез добавяне на лиганда и последващ анализ на експресията на целевия ген надолу по веригата. В допълнение към анализа на специфичната за региона експресия, проучването установи също, че човешките и миши органоиди показват специфична за региона функция: мишият стомах реагира на TLR4 лиганда LPS, но не и на TLR2 лиганда PAM3CSK4 или TLR5 лиганда флагелин, чрез регулиране на NF- κB целеви ген Cxcl2. Миши йеюнум повишава Cxcl2 в отговор на PAM3CSK4 и флагелин, но не и в отговор на LPS. В допълнение, дебелото черво експресира Cxcl2 в отговор на всички тези 3 тествани лиганда [44]. Обратно, човешки органоиди от всички региони експресират човешкия Cxcl2 аналог IL-8 в отговор на флагелин, но не и в отговор на LPS и PAM3CSK [44]. По този начин не само експресията, но и функцията на PRRs в червата е силно организирана и специфична за сегмента. Тези експерименти бяха проведени чрез добавяне на стимула към органоидната среда, като по този начин се стимулира само базалната страна, тъй като апикалната страна е обърната към затворения лумен на органоидите. Други експерименти показват, че има още по-високо ниво на организация, тъй като експресията на PRR в рамките на сегмент може да бъде ограничена до специфични типове клетки или дори субклетъчни местоположения, като например само базалното отделение. Те са описани по-подробно по-долу.

Всеки регион на стомашно-чревния тракт изразява своя специфичен набор от вродени имунни гени. Въпреки че обобщението е трудно, настоящите данни предполагат, че TLRs се експресират най-силно в стомаха и дебелото черво, докато тънките черва се характеризират с експресията на инфламазомни компоненти. Понастоящем основният молекулярен механизъм и еволюционната полза са неясни.

Подозираме, че физическите и химичните бариери, покриващи епителните слоеве в различните сегменти на червата, изискват мониторинг на специфични заплахи. Например и стомахът, и дебелото черво имат двуслоен дебел слузен слой, като вътрешният слузен слой е здраво прикрепен към епителния слой, докато тънките черва са покрити с тънък, вискозен слузен слой [46]. Различната конституция на слузните слоеве на свой ред вероятно се дължи на различните функции на съответните чревни сегменти (храносмилане срещу усвояване на хранителни вещества срещу резорбция на вода). Възможно е дебелината на слузта да повлияе на типа PRR, необходими на определени места.

Специализирани клетки с имунна функция в епитела

Дългогодишна концепция в епителния вроден имунитет е съществуването на специфично за клетъчния тип вродено имунно разпознаване. Прототипите на специализираните епителни клетки със защитна функция са микронагънатите (М) клетки и клетките на Панет - наскоро допълнени от специализирана бокална клетка, сентинелната бокална клетка. Съществуването на такива специализирани клетки подчертава сложните и излишни системи, които осигуряват баланса на усвояването на хранителни вещества, съвместното съществуване с микробиотата и наблюдението на възможни нашественици. Насочената диференциация на органоидите сега също позволява изследването на тези клетки в клетъчна култура.

М клетките са разположени в свързания с фоликула епител, покриващ пейеровите петна. Те имат уникална морфология с неправилни граници на четката и намалени структури на микровили. Тяхната роля е да транспортират антигени в лумена на червата през епителния слой до подлежащата лимфоидна тъкан за регулиране на имунните отговори [47]. Показано е, че самите М клетки, както и свързаният с фоликулите епител експресират няколко TLR [48] (прегледани в [14]). Въпреки това, М клетките са трудни за изследване, тъй като няма много в епителната тъкан и се намират само в близост до сложната структура на пластирите на Peyer [47]. Независимо от това, М клетките могат да бъдат генерирани в органоидни култури, като се използва насочена диференциация. За тази цел към средата се добавя рецепторният активатор на NF-кВ лиганда (RANKL), който повишава транскрипционния фактор SpiB, който е характерен за диференциацията на М клетки [49]. Органоидите, генерирани от мишки с генетичен дефицит за NF-кВ субединицата RelB, не са в състояние да произвеждат М клетки след стимулация с RANKL, което показва, че NF-кВ активирането е от съществено значение за развитието на М клетки [50]. В човешката органоидна култура, в допълнение към RANKL, лимфотоксинът и ретиноевата киселина са от решаващо значение за индуциране на диференциация към М клетки. Тези М клетки специфично поемат чревни вируси като ротавирус и реовирус, което показва правилно фенокопиране на естествената М клетъчна функция също и в органоидни култури [51]. Бъдещата органоидна работа ще трябва да продължи да разкрива взаимовръзката на епителната NF-κB сигнализация, развитието на М клетките и комуникацията с имунните клетки.

Клетките на Панет са смесени с чревните стволови клетки в основата на криптата и отдавна се считат за пазители на отделението за стволови клетки, тъй като отделят антимикробни пептиди. Например, клетките на Панет секретират алфа-дефензини, процес, за който е доказано, че се регулира от микробни модели и вродени имунни механизми [52, 53]. В допълнение, NOD2, който за първи път беше открит в областта на криптата на мишите тънки черва [54], регулира секрецията на няколко алфа-дефензина от клетките на Панет, което от своя страна води до активиране на адаптивен имунитет. Клетките на Панет също експресират TLR5, а органоидите, обогатени с клетки на Панет, експресират особено високи нива на TLR5. Секвенирането на РНК след стимулация разкрива, че докато нормалните тънкочревни органоиди експресират само умерени нива на целевите гени TLR5 надолу по веригата в отговор на стимулация с флагелин, като NF-kB-индуцирани цитокини, органоидите, насочени да съдържат голям брой клетки на Панет, монтират много по-силно отговор, което показва, че клетките на Панет са основните реагиращи на флагелин в тънките черва [44, 45]. За разлика от експресията на таргетния ген, най-драматичният отговор на клетките на Paneth (дегранулация, екструзия и клетъчна смърт) не се задейства от стимулация с TLR лиганди, а по-скоро изисква стимулация с професионалния имуноклетъчен цитокин интерферон-гама [55]. Тези резултати от органоиди са в съгласие с наблюденията, показващи дегранулация и екструзия на клетки на Панет след интерферон-гама стимулация in vivo [55]. Това елегантно подчертава системата от проверки и баланси в епителния слой.

Бокаловидни клетки са важни за епителната защита, тъй като те произвеждат гликозилирани муцини, които са от решаващо значение за образуването на мукусна бариера върху епителния слой (прегледано в [56]). При мишки дефицитът на MUC2 води до спонтанно възпаление и повишава чувствителността към инфекция [57, 58]. Наскоро в дебелото черво на мишката беше описана подгрупа от бокални клетки, наречени сентинелни бокални клетки. Използвайки тъканни експланти, проучването идентифицира удебеляване на мукусния слой в отговор на излагане на TLR1/2, 4 и 5 лиганди, но не и на TLR9, NOD1 и NOD2 лиганди [59], в съответствие с предишен доклад за Tlr 2 ,4 и 5 се експресират в чашковидни клетки [60]. Авторите определят, че отговорът също зависи от наличието на инфламазома Nlrp6 и е независим от мукозните лимфоцити, използвайки тъкани от редица нокаут мишки [59]. Също така, предишен доклад демонстрира значението на инфламазомата NLRP6 за секрецията на слуз от бокалните клетки [61]. Образната диагностика разкрива, че специфични гоблетни клетки, разположени в апикалните области на криптата, са ендоцитирани флуоресцентно маркирани LPS [59]. Тези наскоро наречени контролни гоблетни клетки не само претърпяват бърза дегранулация и епителна експулсия след третиране с TLR лиганди, но също така предават калциев сигнал към съседни клетки чрез междуклетъчни цитоплазмени мостове, образувани от междинни връзки, вероятно стимулирайки други гоблетни клетки да увеличат секрецията на слуз [59] . Както бокалните клетки, така и клетките на Панет принадлежат към секреторната линия. Органоидите позволяват насочена диференциация към двете клетъчни идентичности, като се получават органоиди, силно обогатени или в бокални клетки, или в клетки на Панет [62]. Сравняването на транскриптоми на тези изкривени органоиди помогна да се идентифицират ключови регулатори на пътя на диференциация [63]. По-нататъшният анализ на данните от omics, както и функционалният анализ на тези органоиди ще позволи по-добро разбиране на ролята на двата типа клетки във вродената имунна защита.

И накрая, съобщава се също, че самите стволови клетки експресират специфични PRRs като TLR4 [64, 65], които не се намират в миши тънкочревни въси или клетки на Панет [66]. В допълнение, по-голямата част от експресията на Nod2 в мишата крипта изглежда е ограничена до стволови клетки [67]. Стимулирането с NOD2 лиганд повишава оцеляването на стволовите клетки и образуването на органоиди, което показва, че стимулирането на PRR може също да регулира директно регенерацията на чревния епител.

Без съмнение настоящите усилия за генериране на атласи на генна експресия, обхващащи всеки клетъчен тип с още по-големи подробности, скоро ще дадат по-пълна картина на клетъчната организация на вродената имунна сигнализация в червата, както и в цялото тяло [68–71]. ].

Клетъчна полярност и странични специфични вродени имунни отговори

И накрая, също така е уместно да се има предвид, че стомашно-чревните епителни клетки са силно поляризирани, със специализирана апикална страна, обърната към лумена на червата с неговата микробиота, и базолатерална страна, обърната към тъканта. При хомеостаза MAMP достигат само до апикалната страна. Въпреки това, когато епителната бариера е нарушена, микроорганизмите могат също да предизвикат базолатералната страна. По този начин се предполага, че епителните клетки могат селективно да монтират провъзпалителен отговор само когато са стимулирани от базолатералната страна, за да отговарят на заплахата, породена от сигнала. Например, доказано е, че TLR9 индуцира различни сигнални пътища, когато се стимулира от апикалната или базолатералната страна в ракови клетъчни линии [72], а TLR5 индуцира само гена за отговор на NF-κB IL-8, когато се стимулира от базалната страна [73 ].
Докато по-ранни проучвания, използващи маркиране на антитяло срещу TLR, съобщават за специфична експресия само от едната страна (прегледано в [14, 16]), анализът на TLR репортерни мишки, използвайки оцветяване на HA маркер, не потвърди това, а вместо това демонстрира TLR2, 4 и 5 рецептори от апикалната и базалната страна на проксималното дебело черво, както и някои вътреклетъчни TLR4 [45]. Тези очевидни разлики вероятно се дължат на различните технически подходи.

Органоидите вече позволяват директно функционално тестване на странични специфични имунни отговори, тъй като клетъчната поляризация се запазва в органоидите. При стандартни условия, когато органоидите се отглеждат в извънклетъчен матрикс, апикалната страна е обърната към лумена на органоида, а базалната страна е обърната към извънклетъчния матрикс [74–76]. Когато се отглеждат извън извънклетъчен матрикс, полярността може да се обърне [77, 78]. Когато клетки от органоиди се посяват върху стандартни повърхности на клетъчни култури, като културни чинии или трансуелчета, апикалната страна е обърната към лумена на ямката [44, 79–82].

Няколко проучвания използват органоиди за тестване на общата функция на определени PRR, без да се обръща внимание на специфичните разлики между апикалната и базалната стимулация. Тези изследвания включват стимула в средата на органоидите, който при стандартни условия стимулира базалната страна на клетката. Използвайки тази техника, регулирането на NF-κB надолу по веригата целеви гени беше идентифицирано след базална стимулация с лиганди на TLR4 в стомаха, TLR2 и 3 в тънките черва и TLR2, 3, 4 и 5 в дебелото черво на мишки [44, 45, 83] и към лиганди на TLR2 и 5 в стомаха и TLR5 в тънките черва и дебелото черво на човека [44]. Освен това базалното стимулиране на органоиди на дебелото черво на мишка с TLR4 агонисти индуцира клетъчна диференциация, особено към секреторната линия [64], докато NOD2 агонистите индуцират повишена преживяемост на стволови клетки [67, 84], а тауринът стимулира NLRP6-зависима регулация нагоре на инфламазомния низходящ целеви ген IL-18 [85]. Във всички тези проучвания апикалната стимулация не е тествана.

Само няколко проучвания са насочени към страничните специфични функции на PRR. Трябва да се отбележи, че противно на проучванията, използващи поляризирани ракови клетъчни линии, досега нито едно от проучванията, използващи органоиди, не е идентифицирало странично специфично активиране на типичен NF-κB-зависим провъзпалителен ген. Трансуелните монослоеве, получени от човешки органоиди на дебелото черво, експресират подобни нива на NF-κB целевия ген IL-6, когато се стимулират от апикалната или базалната страна с лиганди на TLR1/2, 3, 4, 5, 7/8 и 9 [82]. Миши стомашни органоиди също отговарят на апикална стимулация с TLR4 лиганд LPS в няколко анализа, включително в трансуелти и микроинжектиране на LPS в лумена на органоиди [44]. Миши тънкочревни епителни клетки не експресират NF-κB целевия ген icam1 в отговор на набор от лиганди, независимо дали са добавени към непокътнати органоиди, като по този начин стимулират базалната страна, или са добавени към единични, дисоциирани клетки, като по този начин стимулират всички страни [55].

Въпреки това, гледайки отвъд отговора на NF-κB, едно скорошно проучване идентифицира странична специфична функция на TLR3 и нейното значение при вирусна инфекция [82]. Резултатите от експерименти с монослоеве, получени от човешки органоиди на дебелото черво, показват, че експресията на критичните гени за защита на вируса тип I и тип III интерферон се регулира нагоре след базална стимулация с TLR3 агонист, но не и след стимулация с други TLR агонисти. При инфектиране с вирус по подобен начин интерфероновият отговор на органоидите е много по-силен при инфектиране от базалната страна в сравнение с инфекцията от апикалната страна. Това се вижда в монослоеве, получени от органоиди, както и в органоиди, микроинжектирани с вируса. Проучването допълнително идентифицира адаптера за сортиране на клатрин AP-1B като молекулата, отговорна за поляризираната експресия на TLR3. Съответно, мишки с дефицит на Ap-1b показват изострени имунни отговори след вирусна инфекция [82]. Това потвърждава поляризираната функция на PRRs и подчертава важността на това ниво на регулиране в по-нататъшното модулиране на разпознаването и защитата на патогена.

Досега няма универсален отговор на въпроса за полярността и разрешаването на специфичния за сайта характер на PRR сигнализирането остава технически предизвикателна задача за бъдещето.

Толерантността като отговор на колонизацията и като стандартна програма за развитие

Механизмите, допринасящи за организирането на вродения имунитет на епитела, все още са неясни. Основната концепция в това отношение е индуцирането на толерантност след колонизиране на стерилните черва по време на раждането, така нареченият прозорец на възможността (прегледано в [86–88]). Тази концепция постулира първичен период на вродената и адаптивна имунна система след раждането, което поставя началото на имунната хомеостаза и последващите взаимодействия гостоприемник-микроб.

Неонаталната имунна система и епителният вроден имунитет са уникално оборудвани да овладеят този преход от стерилност към съвместно съществуване с микробиотата. При раждането човешкото неонатално черво е напълно зряло с чревни власинки и крипти, съдържащи клетки на Панет. Мишият неонатален чревен епителен слой е по-незрял и претърпява драматична промяна, измерима на ниво транскриптом, сравнявайки различни етапи на развитие [89] и видима в тъканната архитектура и клетъчната диференциация: оста крипта-вила все още не е формирана и клетъчната пролиферация е по-ниска, без клетъчна миграция или ексфолиация. Не съдържа зрели клетки на Панет; въпреки това, ентероцитите произвеждат кателицидин-подобния антимикробен пептид (CRAMP) [90]. Клетките на Панет се появяват, когато се образуват крипти 2 седмици след раждането [91]. По време на отбиването епителът е напълно оформен с крипти и власинки, ентероцити, чашковидни клетки и ентероендокринни клетки; Клетките на Панет са поели производството на антимикробни пептиди; и бокалните клетки са увеличили производството на муцини, за да образуват слузния слой (преглед в [92]).

Този зависим от възрастта преход на епитела върви ръка за ръка с постепенно намаляване на експресията на TLR5 в епитела на тънките черва. В същото време експресията на TLR3 се увеличава по време на неонаталния период. Други PRR, като TLR2, 4 и 9, се експресират на подобни нива при новородени и възрастни мишки [45, 93].

Механизмите, водещи до регулиране на експресията и функцията на PRR след раждането, остават неясни. Както бе споменато по-горе, няколко проучвания предлагат принос на околната среда, по-специално на микробната колонизация, за регулирането на експресията на PRR след раждането [40, 41] (прегледано в [14]). Въпреки това, мишките без микроби срещу мишките без специфични патогени не показват разлики в експресията на TLR нито в тънките черва, нито в дебелото черво, което показва, че нито регулирането нагоре на TLR3, нито понижаването на TLR5 в този ранен период зависи от микробиотата [45, 93]. Също така, в органоидите, експресията на много, но не всички PRR сигнални компоненти вече е дефинирана в органоиди от тъкани, които никога не са били в контакт с микробни продукти [44]. Това показва, че голяма част от организацията на вродените имунни сигнални пътища се дефинира независимо от контакта с микробиотата и изглежда се определя от процесите на развитие по подразбиране, като тези, описани по-горе, които оформят общата тъканна идентичност по стомашно-чревния тракт . Това не изключва по-нататъшно фино регулиране на експресията на PRR от фактори на околната среда по време на зряла възраст.

Значението на навременното регулиране на епителните микробни взаимодействия става ясно, когато незрелият епител е преждевременно изправен пред микробна колонизация: недоносените бебета са склонни към развитие на некротизиращ ентероколит (NEC), характеризиращ се с чревна некроза, системен сепсис и множество органи провал. Въпреки че патогенезата се счита за многофакторна, няколко проучвания показват, че тя се развива в отговор на дисбаланс между провъзпалително сигнализиране и възстановителни механизми в преждевременното черво (прегледано в [94]) и се предполага принос на PRRs [41, 65, 95 –97]. Няколко проучвания са използвали човешки фетални органоиди [24, 98, 99], нормални миши органоиди, изложени на бактерии и хипоксия за моделиране на NEC [100], или органоиди от миши NEC модел, както и от пациенти с NEC [101]. Бъдещите проучвания ще използват тези установени и нови модели на органоиди, за да дефинират допълнително приноса на епитела в NEC.

Моделиране на зависими от епитела аспекти на IBD с органоиди

Загубата на целостта на чревната епителна бариера е определяща характеристика на IBD, т.е. CD и UC, и изглежда се причинява от многофакторно взаимодействие на генетично предразположение, фактори на околната среда, промени в чревната микробиота и промени в локалния и системния имунен отговор (прегледан в [27]). Настоящите терапевтични средства са насочени предимно към (анормалните) имунни отговори при IBD, които са свързани с високи нива на неотговорили и странични ефекти (прегледано в [27]). Необходимо е по-добро разбиране на специфичния за епитела принос към патофизиологията на IBD, за да се идентифицират нови терапевтични цели, които също могат да повлияят директно на възстановяването на чревната епителна бариера и по този начин върху заздравяването на лигавицата.

За да получат представа за епителната патология, няколко групи са създали живи биобанки, състоящи се от органоиди, генерирани от отделни пациенти с UC или CD. Въпреки че този подход е очевиден, досега само няколко проучвания съобщават за резултати от органоиди, получени от тази група пациенти [102–104]. Това може да се обясни с наблюдението, че органоидите от пациенти с IBD са по-трудни за генериране. Нашият собствен опит показва, че органоидите, генерирани от пациенти с CD, растат по-бавно по време на първите пасажи и някои проби са загубени - което е свързано с по-висок процент на бактериално замърсяване в културите [105].

Характеризирането на органоиди, получени от пациенти с IBD, разкрива фенотип с намален размер и капацитет за размножаване, повишена скорост на клетъчна смърт, луминални остатъци и частично обърната поляризация на епителните клетки [106]. Глобално сравнение на органоиди от пациенти с UC или CD и здрави контроли показа, че разликите в транскрипцията и метилирането, наблюдавани в чревния епител, се поддържат in vitro [102, 103, 107]. Също така, по-ранно проучване от органоиди, генерирани от пациенти с CD, предполага постоянни промени в чревните стволови клетки при IBD. Това се основава на наблюдението, че органоидите, генерирани от активни CD лезии, поддържат високи нива на експресия на маркери на чревни епителни стволови клетки [108]. Това беше до известна степен потвърдено в скорошно проучване, в което органоидите на дебелото черво, получени от педиатрични пациенти с IBD, показват модел на удължена експресия на антиген-представящи гени [109].

Фокусирайки се върху промените в бариерната функция на чревния епител, включително загуба на плътни връзки и дезмозоми, които обикновено се срещат при IBD [110], беше показано, че органоидите от пациенти с CD поддържат този фенотип на промени във връзката при условия на култура [105]. Това беше особено случаят, когато органоидите бяха генерирани от места на тежко възпаление [105]. Намаляване на свързващите протеини може също да бъде предизвикано в органоиди от здрави донори чрез прилагане на провъзпалителния цитокин TNF- и/или IFN- [106, 111]. Въпреки това, фиксираният модел на промени на съединителни протеини в органоиди от пациенти с IBD се наблюдава само на ниво протеин, но не и на ниво иРНК [105].

Тези наблюдения предполагат, че няколко промени са фиксирани в органоидите от пациенти с IBD. Наблюдението, че някои, но не всички, постоянни промени са видими само на ниво протеин, но не и на ниво РНК, предполага, че има постоянни промени в пост-транскрипционните модификации или разграждането на протеина в органоидите от пациенти с IBD. Това обаче предстои да бъде проучено подробно.

Не е ясно какво точно предизвиква постоянните промени в моделите на изразяване на възпаления епител. Отдавна се подозираше влияние на микробиотата; обаче скорошно проучване показа, че ефектът на микробиотата върху епитела се губи с течение на времето [112]. Проучването сравнява няколко съоръжения за мишки, тъй като различните състави на микробиоми на миши колонии са идентифицирани като объркващи фактори в проучванията vivo. За да се изясни този ефект, проучването сравнява епителни изолати и органоидни култури от свободни от микроби мишки и две отделни колонии мишки без специфични патогени с различна микробиота. Докато прясно изолираният епител показва отпечатък от експозицията на микробиотата върху нивата на РНК и протеини, този ефект се губи след няколко седмици от културата на тънкочревни органоиди [112]. Също така, глобално сравнение на генната експресия на органоиди, генерирани от възпалени или невъзпалени региони на едни и същи пациенти с IBD, показа, че IBD органоидите на възпалените региони са загубили възпалителната генна експресия още след няколко седмици в културата. След това транскриптомите на органоидите бяха групирани на пациент; по този начин постоянните разлики между IBD и здрави контроли остават. След това възпалителният фенотип в органоидите на IBD може да бъде повторно индуциран чрез добавяне на цитокинов коктейл [107]. Като цяло това предполага, че постоянните промени, наблюдавани в органоидите от пациенти с IBD, не зависят от контакт с микробиота или цитокини.

По този начин, въпреки че е разумно да се спекулира, че някои от постоянните промени в чревните епителни клетки от пациенти с IBD могат да бъдат причинени от промени във вродената имунна сигнализация, доказателствата за това в момента са оскъдни. В допълнение, не всички епителни промени, наблюдавани във възпалените области в червата, са трайно запазени в пречистения епител, което показва важен принос от местната среда. В бъдеще нови проучвания с по-сложни органоидни модели, включващи също имунни клетки, възпалителна цитокинова стимулация и съвместни култури с микроорганизми, трябва да помогнат за по-подробното разглеждане на тази хипотеза.

Заключения, бъдещи перспективи и перспективи

В обобщение, докато много заболявания в рамките на стомашно-чревния тракт остават неразбрани, нарастващите доказателства сочат критичната роля на стомашно-чревния епител в патогенезата на много от тях - въпреки че специфичната му роля остава неясна.

Ограниченото познаване на вродената имунна функция на стомашно-чревния епител се приписва на липсата на подходящи експериментални модели. С внедряването на органоидната технология е направена голяма стъпка за преодоляване на този проблем. Органоидите, генерирани от всяка област на стомашно-чревния тракт, ще добавят значително към съществуващите знания. Както беше разкрито от предишни проучвания, генерирането на органоиди осигурява решаващото предимство да можем да наблюдаваме отговорите на първичните стомашно-чревни клетки, за разлика от трансформираните клетъчни линии, които се генерират предимно от стомашно-чревни злокачествени тумори. Една от най-очарователните характеристики на органоидите е, че те поддържат специфични характеристики на сегмента от стомашно-чревния тракт, от който са генерирани, като част от тяхната клетъчна идентичност по време на зряла възраст. Според настоящите експериментални проучвания регионалната идентичност е фиксирана в стомашно-чревните стволови клетки. В този контекст оставащ проблем ще бъде да се определи точно как и кога по време на разработката се случва това вътрешно програмиране.

Когато се разглеждат конкретни концепции за това как епителът може да реагира или взаимодейства с околната среда, органоидната технология вече е позволила осветяване на диференциалната и сегментно-специфична експресия и функция на PRRs в стомашно-чревния епител. Общите функционални последици за сложните регулаторни системи в целия стомашно-чревен тракт все още са неясни и ще трябва да бъдат разгледани в бъдеще. За това също ще бъде важно органоидите да се култивират съвместно с имунни клетки (прегледани в [113]), клетки на чревната нервна система [114] и луминални фактори като бактериални съвместни култури (прегледани в [115]) (фиг. 4).

Друг важен аспект е, че органоидите, генерирани от тъкан на пациент, засегната от стомашно-чревни заболявания като IBD, поддържат някои от характеристиките, наблюдавани в съответните тъканни проби, от които са получени. Това предлага уникалната възможност за по-нататъшно разкриване на специфичния за епитела и заболяването принос към патогенезата на стомашно-чревните заболявания - не само тези, включващи промени, предизвикани от възпаление, но също и тези, включващи промени в злокачествени заболявания. И двете може да се окажат, че включват специфичен принос на вродения имунитет, произхождащ от епитела. За това систематичното създаване на „живи биобанки“ би било важна стъпка. Като визия за бъдещето, такива живи биобанки могат да бъдат прикрепени към вече съществуващи биобанки, които в момента предоставят единствено „мъртви“ биоматериали. Това би представлявало друга важна стъпка не само за научни изследвания, но и за улесняване на индивидуализираната диагностика и терапия на пациентите.

Каре 1. Вроденият имунитет и епителните клетки в стомашно-чревния тракт не са ясни дали наблюдаваното въздействие се дължи на вроденото имунно сигнализиране в епителните клетки или професионалните имунни клетки.

За да се разграничи взаимодействието на професионалните имунни клетки и епителните клетки, няколко проучвания са използвали специфични за епитела нокаути или по-скоро епителни органоиди. При миши модели нито една от епителните специфични делеции на PRR не води до спонтанно възпаление. Въпреки това, мишки с епителен-специфичен нокаут на MyD88 са по-податливи на експериментален колит и показват тежко разрушаване на бариерата, нарушени отговори на гоблетни и Панет клетки [121] и намалено производство на муцин и антимикробни пептиди [121, 122]. Органоидите на тънките черва не предизвикват възпалителен отговор към няколко пречистени PRR лиганди [55], въпреки че това не може да се обобщи и зависи от вида, местоположението и възрастта на тъканта, от която се генерират органоидите [44, 45].

Отсъствието на спонтанен възпалителен фенотип в PRR нокаут модели, специфични за епителни клетки, подкрепя хипотезата, че фактори, различни от общия възпалителен отговор на епитела, оказват влияние върху епителната хомеостаза. Например, стимулиране с NOD2 агонист мурамил дипептид (MDP) увеличава броя на органоидите, израстващи от изолирани стволови клетки, което показва, че вродената имунна сигнализация поддържа оцеляването на стволовите клетки [67, 84]. Освен това, данните от мишки подчертават значението на антиапоптозните ефекти на NF-κB сигнализирането в отговор на други стимули, като TNF- [123]. Интересното е, че при хората полиморфизмите във вродени имунни гени, включително NOD2 и TLR4, са свързани с повишен риск от развитие на IBD [124] и блокирането на TNF- в момента е най-ефикасното лечение за IBD при някои пациенти (прегледано в [125]).

Появява се картина, в която ниското ниво на вродена имунна стимулация е важно за секрецията на слуз, целостта на бариерата и оцеляването на епителните клетки. Неговото увреждане може да позволи транслокацията на чревни бактерии от лумена в субепителната тъкан, което води до възпаление.

Благодарности

Благодарим на Ömer Kaya за помощта с илюстрациите и на Rike Zietlow за редактирането.

Авторски принос

Идея: SB Първоначална концепция: SB и Ö.K.; литературно търсене: Ö.K., NS и SB; Първоначална чернова: Ö.K. Ревизиране, пренаписване, добавяне на раздели: NS, SB Всички автори са преработили критично окончателния ръкопис.

Финансиране

Финансиране с отворен достъп, активирано и организирано от Projekt DEAL. Тази работа беше подкрепена от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG GRK 2157; 3D тъканни модели за изследване на микробни инфекции от човешки патогени, проект 10, към SB), Интердисциплинарния център за клинични изследвания (IZKF; www.med.uni-wuerzburg.de/izkf /startseite) във Вюрцбург (Предоставете AD-427 на NS и SB) и DFG SPP1982 SCHL1962/5-2 на NS.

Декларации

Конфликт на интереси

Авторите декларират липса на конкуриращи се интереси.

Свободен достъп

Тази статия е лицензирана съгласно Creative Commons Attribution 4.0 Международен лиценз, който позволява използване, споделяне, адаптиране, разпространение и възпроизвеждане във всякакъв носител или формат, стига да посочите подходящото признание на оригиналния автор(и) ) и източника, осигурете връзка към лиценза Creative Commons и посочете дали са направени промени. Изображенията или други материали на трети страни в тази статия са включени в лиценза Creative Commons на статията, освен ако не е посочено друго в кредитната линия към материала. Ако материалът не е включен в лиценза Creative Commons на статията и предвидената от вас употреба не е разрешена от законови разпоредби или надвишава разрешената употреба, ще трябва да получите разрешение директно от притежателя на авторските права.

Препратки

1. Goodwin CS (1984) Микроби и инфекции на червата

2. Sekirov I, Russell SL, Antunes LCM, Finlay BB (2010) Чревна микробиота в здравето и болестта. Physiol Rev 90:859–904

3. Simon GL, Gorbach SL (1986) Човешката чревна микрофлора. Dig Dis Sci 31:147S–162S

4. Bartfeld S, Clevers H (2017) Органоиди, получени от стволови клетки, и тяхното приложение за медицински изследвания и лечение на пациенти. J Mol Med:1–10. https://doi.org/10.1007/s00109-017-1531-7

5. Barker N (2014) Възрастни чревни стволови клетки: критични двигатели на епителната хомеостаза и регенерация. Nat Rev Mol Cell Biol 15:19–33

6. Bartfeld S, Koo BK (2017) Възрастни стомашни стволови клетки и техните ниши. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol 6:e261. https://doi.org/ 10.1002/wdev.261

7. Liwinski T, Zheng D, Elinav E (2020) Микробиомът и цитозолните вродени имунни рецептори. Immunol Rev 297:1–18

8. Burgueño JF, Abreu MT (2020) Епителни Toll-подобни рецептори и тяхната роля в чревната хомеостаза и заболяване. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 17: 263–278

9. Christian S, Kanneganti TD (2020) Инфламазоми и тънката линия между защитата и болестта. Curr Opin Immunol 62:39–44

10. Ying L, Ferrero RL (2019) Роля на NOD1 и ALPK1/TIFA сигнализиране във вродения имунитет срещу Helicobacter pylori. Инфекция стр.:159–177

11. Takeuchi O, Akira S (2010) Рецептори за разпознаване на образи и възпаление. Клетка 140: 805–820

12. Peterson LW, Artis D (2014) Чревни епителни клетки: регулатори на бариерната функция и имунната хомеостаза. Nat Rev Immunol 14:141–153

13. Pott J, Hornef M (2012) Вродена имунна сигнализация в чревния епител при хомеостаза и заболяване. EMBO Rep 13: 684–698

14. Abreu MT (2010) Тол-подобно рецепторно сигнализиране в чревния епител: как бактериалното разпознаване оформя чревната функция. Nat Rev Immunol 10:131–144

15. Zhang K, Hornef MW, Dupont A (2015) Чревният епител като пазител на целостта на чревната бариера. Cell Microbiol 17: 1561–1569

16. Yu S, Gao N (2015) Компартментализиране на рецептори, подобни на таксата на чревните епителни клетки, за имунен надзор. Cell Mol Life Sci 72: 3343–3353

17. Zhou P, She Y, Dong N, Li P, He H, Borio A, Wu Q, Lu S, Ding X, Cao Y, Xu Y, Gao W, Dong M, Ding J, Wang DC, Zamyatina A, Shao F (2018) Алфа-киназа 1 е цитозолен вроден имунен рецептор за бактериална ADP-хептоза. Природата. 561: 122-126

18. Milivojevic M, Dangeard AS, Kasper CA, Tschon T, Emmenlauer M, Pique C, Schnupf P, Guignot J, Arrieumerlou C (2017) ALPK1 контролира TIFA/TRAF6-зависимия вроден имунитет срещу хептоза{{5} },7-бифосфат на грам-отрицателни бактерии. PLoS Pathog 13:e1006224. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1006224

19. Zimmermann S, Pfannkuch L, Al-Zeer MA et al (2017) ALPK1- и TIFA-зависим вроден имунен отговор, предизвикан от секреторната система на Helicobacter pylori тип IV. Cell Rep 20: 2384– 2395

20. Abreu MT, Fukata M, Arditi M (2005) TLR сигнализиране в червата при здраве и болест. J Immunol 174:4453–4460 174/8/4453 [pii]

For more information:1950477648nn@gamil.com