Метаболизмът на глутатиона допринася за индуцирането на трениран имунитет

Резюме:

Вродената имунна система показва хетероложни характеристики на паметта, които се характеризират с по-силни отговори на вторично предизвикателство. Това явление, наречено обучен имунитет, разчита на епигенетичното и метаболитно пренастройване на вродените имунни клетки. Тъй като производството на реактивни кислородни видове (ROS) е свързано с фенотипа на обучен имунитет, ние предположихме, че повишените нива на ROS и основната вътреклетъчна редокс молекула глутатион играят роля в индуцирането на обучен имунитет. Тук показваме, че фармакологичното инхибиране на ROS в in vitro модел на обучен имунитет не повлиява клетъчната реакция; модулирането на нивата на глутатион намалява производството на провъзпалителни цитокини в човешки моноцити. Установено е, че единичните нуклеотидни полиморфизми (SNPs) в гените, участващи в метаболизма на глутатиона, са свързани с промени в капацитета за производство на провъзпалителни цитокини при обучен имунитет.

Също така, плазмените концентрации на глутатион са положително свързани с ex vivo производството на IL-1, биомаркер на обучен имунитет, произведен от моноцити на BCG-ваксинирани индивиди. В заключение, метаболизмът на глутатиона участва в индуцирането на обучен имунитет и бъдещите проучвания са оправдани за изследване на неговите функционални последици при човешки заболявания.

Човешкият имунитет е много важен, защото ни предпазва от болести и инфекции. Имунната система е сложна система, съставена от много различни клетки, тъкани и органи. Те работят заедно, за да се справят с различни патогени отвътре и отвън. В изследването открихме, че полизахаридът и вербаскозидът на Cistanche deserticola могат да подобрят активността на ензимите на сърдечната и мозъчната тъкан и да укрепят коремната кухина. Фагоцитната функция на клетките и реакцията на пролиферация на лимфоцитите имат очевидно въздействие върху подобряването на имунитета.

Щракнете върху продукт за добавка Cistanche deserticola

Ключови думи:

глутатион; трениран имунитет; макрофаги; метаболизъм; вродена имунна памет.

1. Въведение

Доскоро се смяташе, че адаптивният имунитет е единственият компонент на защитата на гостоприемника, характеризиращ се с капацитет за запазване на паметта, приспособяване на Т и В клетъчните отговори към специфичен антиген.

Въпреки това, нарастващ брой скорошни изследвания също приписват характеристиките на хетероложната памет на вродената имунна система, процес, наречен обучен имунитет [1]. Моноцитите, изложени за кратък период от време на Candida albicans, компонента на гъбичната клетъчна стена - глюкан или дори стерилни стимули като окислен липопротеин с ниска плътност (ox-LDL), показват повишено производство на провъзпалителни цитокини при несвързана вторична стимулация дълго след първоначалният стимул е премахнат [2,3].

В допълнение, епидемиологичните проучвания показват, че ваксинацията срещу туберкулоза Bacillus Calmette-Guérin (BCG) засилва антимикробната функция на вродените имунни клетки, като впоследствие индуцира неспецифична защита срещу несвързани инфекции и намалява общата смъртност [4].

Обученият имунитет се корени в епигенетични промени, които модулират достъпността на гените на провъзпалителния отговор за транскрипционния механизъм на клетката. Епигенетичното пренавиване в обучени вродени имунни клетки е придружено от метаболитни промени, които насърчават пътища като гликолиза, окислително фосфорилиране и биосинтеза на холестерол [5,6]. Метаболитите, получени от тези пътища, са сигнални молекули и кофактори, които от своя страна могат да модулират активността на модифициращите хроматин ензими. Глутатионът (GSH) е основният антиоксидант, запазващ вътреклетъчния редокс баланс и се предполага, че допринася за епигенетичните промени [7].

В допълнение, стимули, които индуцират обучен имунитет, като BCG и oxLDL, увеличават производството на реактивни кислородни видове (ROS) на макрофагите при вторична стимулация [8–10]. Ние предположихме, че повишената метаболитна активност на обучени макрофаги също ще повиши нивата на ROS и ще модулира GSH, което от своя страна ще повлияе на силата на обучените имунни реакции.

2. Материали и методи

2.1. Изолиране на човешки мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC) и моноцити

Бъфи палта от здрави донори са получени след писмено информирано съгласие (Sanquin Blood Bank, Nijmegen, Холандия). Беше получено етично одобрение от CMO Arnhem-Nijmegen (NL32 357.091.10). Изолирането се извършва чрез центрофугиране с диференциална плътност върху Ficoll-Paque (GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK). Впоследствие се извършва изолиране на моноцити с хиперосмотично центрофугиране с градиент на плътност Percoll (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) и се промиват веднъж с безпирогенен студен фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Клетките се ресуспендират и по-късно се култивират в холандска модифицирана среда RPMI 1640 (Invitrogen, Waltham, MA, САЩ), допълнена с 5 µg/mL гентамицин (Centraform, Etten-Leur, Холандия), 2 mM Glutamax (Gibco, Waltham, MA, САЩ ) и 1 mM пируват (Gibco). За да се осигури максимална чистота, изолираните от Percoll моноцити бяха оставени да се придържат към плоскодънни плаки от полистирол (Corning, Sigma-Aldrish, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ) в продължение на 1 час при 37 ◦C 5 процента CO2 и след това се промиват веднъж с топъл PBS.

2.2. Модел на ин витро обучен имунитет

Прилепналите моноцити се култивират, както е описано по-горе [11]. Накратко, 105 моноцита се посяват върху плаки с плоско дъно 96-ямки (Greiner, Kremsmünster, Австрия) и се инкубират с 1 µg/mL -глюкан или 5 µg/mL BCG ваксина (InterVax, Торонто, Онтарио, Канада) в RPMI с 10 процента човешки обединен серум. -1,3-(D)-глюкан (-глюкан) от Candida albicans беше любезно предоставен от професор Дейвид Уилямс (Медицински колеж, Джонсън Сити, Тенеси, САЩ).

Когато е посочено, клетките се инкубират предварително с {{0}}.5 µM дифениленйодоний (DPI), 50 µM a-токоферол (AT) (Sigma-Aldrich), 0,5 µM аскорбинова киселина (AA), 1 mM N-ацетил цистеин (NAC) (Sigma-Aldrich) или 100 µM DL-бутионин сулфоксимин (BSO) (Sigma-Aldrich) за 1 час преди добавянето на -глюкан. След 24 часа клетките се промиват веднъж с топъл PBS и се оставят да се диференцират в RPMI, допълнен с 10 процента обединен човешки серум в продължение на 5 дни. Средата беше освежена на ден 3 от културата. На 6-ия ден макрофагите бяха повторно стимулирани с 10 ng/mL липополизахарид на Escherichia coli (LPS; серотип 055: B5, Sigma-Aldrich) за допълнителни 24 часа.

2.3. Количествено определяне на реактивни кислородни видове (ROS).

Моноцитите/макрофагите се култивират за 2 часа, 24 часа или 6 дни, промиват се, отделят се със студен PBS и се инкубират с 5 µM H2DCFDA (Life Technologies, Waltham, MA, USA) в PBS за 30 минути при 37 ◦C. Клетките бяха анализирани чрез поточна цитометрия (CytoFlex, Beckman Coulter, Brea, СА, САЩ). Анализът на данните беше извършен с помощта на софтуера Kaluza 2.1. Клетъчните агрегати бяха изведени на базата на диаграмата на височината на разпръскването напред (FSC) спрямо FSC-площта и популацията от моноцити/макрофаги беше разсеяна според FSC и страничното разсейване (SSC). Данните са представени като средна стойност ± SEM и са анализирани с теста на Friedman, последван от тестовете за множество сравнения на Dunn. P-стойност под 0.05 се счита за статистически значима, както е посочено със звездички (* p <0.05).

2.4. Данни за секвениране на РНК на човешки моноцити, стимулирани in vitro

Анализът на генната експресия на моноцити, изложени in vitro на -глюкан, беше извършен с помощта на публикувани по-рано данни за RNA-seq [12]. Накратко, PBMCs бяха изолирани чрез центрофугиране във Ficoll-Paque (GE Healthcare). Моноцитите се пречистват с помощта на отрицателна селекция с перли за CD3 плюс (Т клетки), CD19 плюс (В клетки) и CD56 плюс (NK клетки) положителни клетки (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Германия). Клетките се култивират, следвайки описания in vitro модел на имунитет и се излагат на 5 µg/mL -глюкан. Моноцитите се събират на 4 часа и 24 часа след експозицията. Гените, свързани с антиоксидантния отговор и метаболизма на глутатиона, бяха извлечени от списъка със значително динамични гени (p < 0.05, FC > 2.5, RPKM > 1) в in vitro модела на имунитет, обучен от моноцити към макрофаги. Данните са представени като log10 на съотношението между моноцитите, третирани с -глюкан, и нестимулираните моноцити.

2.5. Количествено определяне на глутатион

Количественият анализ на вътреклетъчния редуциран (GSH) и окислен (GSSG) глутатион се извършва с помощта на спектроскопия с ядрено-магнитен резонанс (NMR), както е описано по-горе [13].

Накратко, растежната среда се отстранява и култивираните клетки се промиват с топъл PBS (37 °C) и се охлаждат с течен азот, за да се спре метаболизма. След това клетките се изстъргват от плочите и се екстрахират с помощта на студен (-80 ◦C) разтвор на метанол/хлороформ/вода, 8.1:0.9:1 (обем/обем/обем) . Екстрактите се държат замразени върху сух лед за най-малко 30 min и след това се центрофугират за 20 min при 18,{{1{{30}}}}× g при −4 ◦C. Протеиновите пелети се съхраняват за количествено определяне на протеини, докато супернатантите, съдържащи вътреклетъчните метаболити, се изсушават под лек поток от азот и се приготвят NMR проби чрез разтваряне на изсушения материал с 0,22 mL от 0,15 М фосфатен буфер (рН 7,4) в деутерирана вода, съдържаща 0,05 mM триметилсилил пропионова-d4-натриева сол като вътрешен стандарт за NMR референция и количествено определяне. Беше събран 1D 1H NMR спектър за всяка проба на 14.1 T (600 MHz за 1H) Bruker Avance II NMR, използвайки noesygppr1d импулсна последователност (Topspin v3.0, Bruker Biospin Ltd, Карлсруе, Германия). Всички спектри бяха обработени и импортирани в Chenomx NMR пакет 8.4 (Chenomx NMR пакет, v8.0, Едмънтън, AB, Канада) за количествено определяне на глутатион.

Всички концентрации бяха нормализирани към общата протеинова маса на всяка проба. Последният се определя количествено чрез разтваряне на протеиновата пелета в буфер (1:1, 1 процент SDS: 8M урея (0.25M Tris pH:8)) с ултразвук. След това концентрацията на протеин се измерва с помощта на комплект за анализ на протеин PierceTM BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) съгласно неговото ръководство.

2.6. In Vitro и In Vivo обучени модели на имунитет за генетичен и метаболитен анализ

В in vitro модела прилепналите моноцити се инкубират или с културална среда само като отрицателна контрола, 2 µg/mL -1,3-(D)-глюкан или 5 µg/mL BCG (кохорта 300BCG : BCG-Bulgaria strain, Intervax, Canada), за 24 часа при 37 ◦C в присъствието на 10 процента обединен човешки серум. На ден 6, клетките бяха повторно стимулирани за 24 часа или с 200 µL RPMI, или с LPS 10 ng/mL (серотип 055: B5; Sigma-Aldrich).

В модела in vivo здрави възрастни бяха ваксинирани със стандартна доза от 0.1 mL BCG интрадермално в лявата горна част на ръката и беше взета кръв преди и 14 и 90 дни след ваксинацията. При всяко посещение, 5 × 105 PBMCs бяха стимулирани с топлинно убит Staphylococcus aureus (106 CFU/mL) или оставени нестимулирани при 37 ◦C с 5 процента CO2. Секретираните цитокини бяха измерени и в двата модела след 24 часа стимулация и кратното увеличение на реакцията на цитокини, предизвикана от тренировъчните стимули, беше използвано като мярка за обучен имунитет [14].

2.7. Генетичен анализ

Генетичният анализ беше извършен с помощта на кохорта от здрави индивиди от западноевропейски произход от проекта за човешка функционална геномика [15]. Кохортата 300BCG се състои от 325 възрастни от Холандия (44 процента мъже и 56 процента жени, възрастов диапазон 18–71 години). Проучването е одобрено от местния комитет по етика CMO регион Arnhem-Nijmegen, NL58553.091.16. ДНК проби от индивиди (n=325) бяха генотипирани с помощта на наличния в търговската мрежа SNP чип, Infinium Global Screening Array MD v1.0 от Illumina. Оптичен 0.7.0 с настройки по подразбиране беше използван за извикване на генотип [16]. Проби с честота на повикване По-малка или равна на 0.99 бяха изключени, както и варианти с равновесие на Харди-Вайнберг (HWE) По-малко или равно на 0,0001 и честота на малки алели (MAF) По-малко или равно до 0,001. Нишките от варианти бяха подравнени и идентифицирани спрямо референтния панел от 1000 генома с помощта на Genotype Harmonizer [17]. След това вменихме пробите на импутационния сървър в Мичиган, като използвахме човешкия референтен консорциум (HRC r1.1 2016) като референтен панел и филтрирахме генетични варианти с R2 < 0,3 за качество на вменяване и MAF < 5 процента [18], което води до приблизително 4 милиона еднонуклеотидни полиморфизма (SNP) за последващо QTL картографиране. Данните както за генотипа, така и за цитокините за in vitro обучени имунни отговори са получени за общо 267 индивида от групата 300 BCG. Три проби бяха изключени поради употребата на лекарства (от които една беше идентифицирана като генетично отклонение), а една проба се дължи на появата на диабет тип 1 по време на проучването.

Първо, кратната промяна на производството на цитокини между обучени и необучени клетки беше взета като мярка за величината на обучения имунитетен отговор. След проверка на качеството за разпределение на цитокини и след изключване на генетични извънредни стойности, ние картографирахме логаритмично трансформираните кратни промени на производството на цитокини към данни за генотип, използвайки линеен регресионен модел с възраст и пол като ковариати, за да коригираме разпределенията на кратната промяна на производството на цитокини. Използвахме граница на p <9,99 × 10-3, за да идентифицираме предполагаеми асоциации на локуси на количествени характеристики (QTL), засягащи обучените имунни отговори. Използвайки модела на in vivo обучен имунитет, бяха получени данни за генотип и цитокини за общо 296 индивида.

В допълнение към отклоненията, описани за in vitro QTL картографирането, 18 вечерни ваксинирани индивида бяха изключени, което доведе до 278 проби преди QTL картографирането. Първо, нивата на необработените цитокини бяха логаритмично трансформирани и съотношенията на производството на цитокини между посещенията бяха взети като кратната промяна на производството на цитокини. Кратната промяна на производството на цитокини беше нанесена на данни за генотип, като се използва линеен регресионен модел с възраст и пол като ковариати. Използвахме граница от p <9,99 × 10-3, за да идентифицираме предполагаеми QTL асоциации, засягащи обучените имунни отговори. R-package Matrix-eQTL беше използван за QTL картографиране на цитокини [19].

2.8. Метаболомичен анализ

Метаболитните нива на индивиди от групата 300 BCG са измерени преди BCG ваксинацията. Метаболитните характеристики бяха измерени и анотирани от General Metabolics (Цюрих, Швейцария) с помощта на масова спектрометрия с инжектиране на потока и време на полет (поток-инжектиране TOF-M) [20]. Нецелевите метаболити бяха анотирани съгласно базата данни за човешки метаболити (HMDB). Всички метаболомични измервания бяха извършени в дубликати и средната стойност беше изчислена за всяка проба на метаболит. Корелационният анализ на Spearman беше извършен върху метаболитите и ex vivo промените на цитокиновите гънки относно отговорите преди ваксинацията. За да се тества връзката между нивата на глутатион и представляващите интерес SNP, идентифицирани в генетичния анализ, за ​​всеки SNP беше извършен линеен регресионен анализ с възраст и пол, включени като ковариати.

2.9. Количествено определяне и анализ на цитокини

Производството на цитокини се определя с помощта на търговски комплекти ELISA за IL{{0}}, IL-6 и TNF (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), следвайки инструкциите на производителя. Данните са представени като средна стойност ± SEM и са анализирани с двупосочни повторени измервания ANOVA, последвани от тестовете за множество сравнения на Sidak. P-стойност под 0.05 се счита за статистически значима, както е отбелязано със звездички (* p <0.05).

3. Резултати

3.1. - Индуцираният от глюкан и BCG трениран имунитет задейства устойчиво производство на реактивни кислородни видове

Повишеното освобождаване на ROS е описано по-рано като характеристика на фенотипа на тренирания имунитет [21]. Моноцитите, изложени на -глюкан или BCG за 2 h и 24 h, показват повишена ROS. Интересното е, че това увеличение се поддържа и присъства след 5 дни почивка в културална среда (Фигура 1А). Повишените нива на ROS са придружени от транскрипционни промени на различни антиоксидантни гени в моноцити, изложени на -глюкан за 24 часа (Фигура 1В). Митохондриалната супероксиддисмутаза SOD2 и различни тиол-съдържащи молекули се регулират нагоре, а именно тиоредоксин-зависими пероксид редуктази 1-6 (PRDX 1-6) и сулфиредоксин 1 (SRXN1). Експресията на тиоредоксин (TXN) и тиоредоксин редуктаза (TXNRD), съответните тиол-съдържащи ROS акцептори, също се увеличава.

Фигура 1. Повишените нива на ROS на обучени моноцити не допринасят за повишеното им производство на провъзпалителни цитокини. (A) Нива на ROS на 2 часа, 24 часа и 6 дни след излагане на моноцити на -глюкан и BCG (n=6/9 донори, обединени от 2/3 независими експеримента. Тест на Фридман Тест за множество сравнения на Дън) . (B) Нива на експресия на гени, участващи в антиоксидантната защита в моноцити, изложени на -глюкан за 24 часа в сравнение с нестимулирани клетки. Изразът е представен като log10(съотношение). TNF и IL-6, произведени от -глюкан-обучени макрофаги след 1 час предварителна обработка с (C) 0.5µM DPI (n=6 донори, събрани от 2 независими експеримента) и (D ) 1 mM NAC, 50 µM AT или 0,5 µM AA (n=6 донори, обединени от два независими експеримента, двупосочен ANOVA, тест за множество сравнения на Sidak). (средно ± SEM, * p <0,05).

Въпреки това, нито инхибирането на основния производител на ROS NADPH оксидаза с дифениленйодоний (DPI), нито добавянето на антиоксидантните молекули -токоферол (AT) и аскорбинова киселина (AA) преди инкубиране с -глюкан, модулира повишената чувствителност на макрофагите. В макрофагите, изложени на -глюкан, секрецията на TNF и IL-6 24 часа след рестимулацията на LPS не се променя от този фармакологичен подход (Фигура 1C, D).

Излагането само на DPI обаче повишава производството на IL-6 при LPS стимулация. (Фигура 1C). Предварителната обработка с общия поглъщач на ROS N-ацетил цистеин (NAC) причинява намаляване на производството на TNF и IL-6 в сравнение с клетките, изложени само на глюкан (Фигура 1D). Взети заедно, ние показваме, че увеличеното производство на ROS играе незначителна роля в увеличеното производство на цитокини на индуциран от глюкан обучен имунитет. В допълнение, тренираният имунитет, поддържащ повишени нива на ROS, може да бъде свързан с модулирането на клетъчния антиоксидант глутатион, тъй като NAC е не само чистач на ROS, но може да действа и като прекурсор за синтеза на глутатион.

3.2. Метаболизмът на глутатиона влияе върху обучените имунни реакции

Моноцитите, изложени на -глюкан за 24 часа, показват по-високи нива на окислената форма на глутатион (GSSG), което е от по-високите нива на ROS, открити в този момент (Фигура 2А). След периода на почивка редуцираната форма на глутатион (GSH) има тенденция да се увеличава в обучените макрофаги, без промяна на концентрациите на окислената форма.

Фигура 2. Нивата на глутатион се модулират при излагане на -глюкан. (A) Намалени и окислени вътреклетъчни нива на глутатион в моноцитите след 24 часа експозиция с 1 µg/mL -глюкан и 5 дни след периода на почивка (n=4 донори, обединени от два независими експеримента). (B) Експресия на гени, участващи в метаболизма на глутатион в моноцити, изложени на -глюкан за 4 часа и 24 часа. Изразът е представен като log10(съотношение). (C) TNF и IL-6, произведени от -глюкан-обучени макрофаги след 1 час предварителна обработка със 100 µM BSO (n=9 донори, обединени от три независими експеримента, * p < 0,05 двупосочна ANOVA , тестовете за множество сравнения на Sidak) (средно ± SEM).

Гените, които кодират субединиците на ограничаващия скоростта ензим глутамат цистеин лигаза (GCLC и GCLM), показват повишена експресия на 4 часа след стимулиране с глюкан в сравнение с контролните моноцити. Глутатион редуктазата (GSR), глутатион пероксидазата 7 (GPX7) и ензимите от семейството на глутаредоксините (GLRX, 2, 5) също се регулират нагоре в 24-часовия момент (Фигура 2B), което предполага не само увеличаване на синтеза, но и по-висока скорост на рециклиране на глутатион. Фармакологичното инхибиране на активността на GCL с бутионин сулфоксимин (BSO) преди излагане на -глюкан води до намаляване на производството на IL-6 след повторно стимулиране на LPS (Фигура 2C). По този начин екзогенната модулация на нивата на глутатион, или допълване чрез добавяне на прекурсора NAC, или неговото намаляване чрез блокиране на ензима GCL с BSO, намалява повишената чувствителност на -глюкана към вторична стимулация.

За по-нататъшно изследване дали генетичните вариации в гените, участващи в метаболизма на глутатиона, влияят върху обучения имунитет, QTL картографирането е извършено с помощта на кохорта от 325 здрави индивида. Тествахме дали често срещаните SNPs с малка алелна честота (MAF) > 0.05 в гени, имащи отношение към метаболизма на глутатиона, са свързани с промени в капацитета за производство на провъзпалителни цитокини на моноцитите при -glucan и BCG in vitro обучение (Фигура 3A, ° С).

По подобен начин ние също оценихме въздействието на тези генетични варианти върху in vivo обучения имунитет, индуциран от BCG ваксинация на 278 здрави индивида (Фигура 3B, C). Няколко SNPs в рамките на прозорец от 250 kb от гени, участващи в метаболизма на глутатион, бяха предполагаемо свързани (p-стойност <9,99 × 10-3) с регулиране нагоре на IL-1, TNF и IL-6 секреция след обучение (Фигура 3A, B).

В същата кохорта ние измерихме плазмените метаболити, участващи в метаболизма на глутатиона преди BCG ваксинацията. SNPs, идентифицирани в in vitro и in vivo анализите, са значително свързани с циркулиращите концентрации на глутатион (p-стойност < 0.05) (Фигура 3D). В допълнение, ние открихме положителна връзка между плазмената концентрация на глутатион и ex vivo производството на IL-1 90 дни след BCG ваксинация при in vitro излагане на хетероложния стимул Staphylococcus aureus (Фигура 3E). Повишаването на производството на IL-1 чрез BCG ваксинация също е положително свързано с циркулиращата концентрация на други метаболити, участващи в метаболизма на глутатиона, като метионин, цистеин, глутамат и глицин (Фигура 3E). Като цяло, гените, участващи в метаболизма на глутатион, съдържащи QTLs за вродени хетероложни отговори, към LPS (Фигура 3A) или към S. aureus (Фигура 3B), и корелация между серумните нива на глутатион и производството ex vivo на IL-1, и двете сочат към ролята на този път в установяването на трениран имунитет.

Фигура 3. Глутатионът е свързан с характеристиките на обучен имунитет. Топлинна карта на p-стойностите на асоцииране (p <9,99 × 10−3) между SNPs, картографирани към гени, участващи в метаболизма на глутатиона и големината на капацитета за производство на цитокини от моноцити, обучени in vitro с (A) -глюкан и BCG (n=251 здрави доброволци за IL-6 и n=238 здрави доброволци за TNF) и (B) in vivo BCG тренировъчни отговори (n {{10}} здрави доброволци). (C) Boxplot на най-ниската p-стойност SNP за анализ (rs7768134, rs35568915). (D) Графики, показващи плазмени нива на глутатион (коригирани за възраст и пол), стратифицирани по генотип за rs2233294 (GPX3) и rs10136944 (GLRX5, n=302). P-стойността за всеки SNP се извлича от линеен регресионен модел с SNP, който представлява интерес, като независима променлива и глутатион (коригиран за възраст и пол) като зависима променлива. (E) Корелации на Spearman между циркулиращите метаболити на изходно ниво, участващи в метаболизма на глутатион спрямо кратните промени на получените от PBMC S. aureus-индуцирани IL-6, IL-1 и TNF отговори, измерени на 14 или 90 дни след BCG ваксинация в сравнение с изходното ниво (n=297 здрави доброволци). Таблицата представя rho на Spearman за всяка корелация, а корелациите в червено подчертават значителни положителни корелации (* p <0,05, ** p <0,01). Корелацията между концентрацията на глутатион и кратната промяна на производството на IL-1 на 90 дни в сравнение с ден 0 е дадена като пример в диаграма на разсейване.

4. Дискусия

Макрофагите са пластмасови клетки, които адаптират своя фенотип към различни стимули от околната среда. Обучените макрофаги разчитат на висок енергиен метаболизъм, с повишена гликолиза, TCA цикъл и окислително фосфорилиране, за да постигнат отговор с повишено производство на провъзпалителни цитокини [6,22].

В допълнение към производството на цитокини, окислителният взрив с бързо производство на ROS се увеличава в рестимулирани BCG-обучени макрофаги [8]. Неутрофилите на далака, изолирани от мишки, третирани с BCG, също показват повишено производство на ROS [23]. В съответствие с увеличената скорост на метаболизма и увеличения капацитет за монтиране на окислителен изблик, ние наблюдавахме, че моноцитите и макрофагите, изложени на -глюкан или BCG, показват увеличение на базалното производство на ROS. Подобно повишаване на освобождаването на ROS беше съобщено преди това в oxLDL-обучени моноцити [9]. ROS има ефекторни функции в клирънса на патогени, но може също да медиира сигналната трансдукция [24]. Фармакологичното инхибиране на ROS-продуциращия ензим NOX или лечение с антиоксидантни молекули - токоферол и аскорбинова киселина не премахват -глюкана, увеличава производството на цитокини. Обаче ROS акцепторът NAC инхибира производството на TNF, подсилен от -глюкан, което показва възможна роля на ROS в обучения имунитет.

Интересното е, че NAC е не само антиоксидантна молекула, но също така действа като прекурсор на глутатиона, основната ендогенна антиоксидантна молекула. Има две основни клетъчни редокс системи, пиридинови нуклеотиди, като NAD плюс /NADH, и тиолови системи, които включват глутатион и тиоредоксини. Съотношението NAD плюс /NADH се повишава в моноцити, изложени на глюкан, по продължителен начин след периода на диференциация в обучени макрофаги [22], подобно на това, което докладваме за нивата на ROS. Тук показваме, че концентрациите на GSH също се модулират в обучен имунитет.

Най-поразителното е, че концентрацията на GSH-редуцираната форма се повишава само в диференцирани обучени макрофаги, докато нивата на окисления GSSG са стабилни. Това предполага, че обучените макрофаги са увеличили запасите на GSH, които за разлика от NAD плюс /NADH не си партнират с устойчивото производство на ROS. Приносът на метаболизма на глутатиона към тренирания имунитет е допълнително подсилен чрез генетичен и метаболитен анализ на кохорта от здрави индивиди (300BCG). Установено е, че общите генетични полиморфизми в гените, свързани с GSH, влияят на степента на производство на цитокини при in vitro и in vivo обучен имунитет (p <9,99 × 10-3). В допълнение, два от тези QTL локуса, GPX3 при chr5 и GLRX5 при chr14, беше установено, че са свързани с плазмените концентрации на GSH (р <0.05).

GSH е антиоксидантна молекула, но също така е известно, че регулира генната експресия чрез различни епигенетични механизми. GSH участва в пост-транслационни модификации, както се наблюдава при S-глутатионилирането на нуклеозомния протеин хистон H3, и се захранва от метиониновия път, който в крайна сметка води до производството на s-аденозил метионин (SAM). От своя страна SAM е основният донор на метил, използван за метилиране на ДНК и хистони [7]. Метаболитът на TCA цикъла фумарат се натрупва в обучени макрофаги и неговият производен монометил фумарат индуцира фенотип на обучен имунитет [5]. В астроцитите, острата експозиция на производното диметилфумарат изчерпва вътреклетъчния GSH, но повишава общия GSH в по-късни времеви точки [25]. Обученият имунитет е закотвен от епигенетични модификации, които предоставят дългосрочна памет [26]. Наблюдаваното тук повишено съдържание на GSH на обучени макрофаги може да улесни епигенетичното пренавиване, необходимо за установяване на вродена имунна памет.

Тук показваме, че фармакологичната модулация на глутатиона и редокс статуса на клетката намалява хетероложния отговор на макрофага, както се вижда от ефекта на BSO или NAC върху производството на цитокини, усилено с -глюкан. В допълнение, в кохорта от здрави индивиди, метаболизмът на GSH е свързан с тренирани черти на имунитета. Обучените имунни механизми, които се оформят от метаболизма на GSH, остават да бъдат допълнително проучени, но потенциалното участие както на метаболитни, така и на епигенетични пейзажи прави този метаболитен център вълнуващ път за изследване в бъдещи проучвания. Тези прозрения допринасят за разкриването на метаболитната и епигенетичната връзка на тренирания имунитет, позволявайки по-добро разбиране на вроденото имунно въздействие върху здравето и болестите. В крайна сметка по-доброто разбиране ще помогне да се идентифицират нови цели на терапията при заболявания, характеризиращи се с нарушена регулация на вродените имунни процеси.

Авторски принос:

Концептуализация: AVF и JD-A.; методология: AVF, VACMK, VM и JCA-B., MAG; формален анализ: AVF, VACMK, VM и JCA-B.; разследване AVF, JCA-B., SK, LCJdB, SJCFMM, VPM и BN; обработка на данни: AVF, VACMK, VM и BN; писане—подготовка на оригинална чернова, AVF; писане—рецензия и редакция: всички съавтори; надзор: MAG, MGN и JD-A.; придобиване на финансиране: MAG и MGN Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране:

JD-A. се подкрепя от Холандската организация за научни изследвания (грант VENI 09150161910024). MGN. се подкрепя от ERC Advanced Grant (833247) и Spinoza Grant на Холандската организация за научни изследвания. AVF се подкрепя от Fundação para a Ciência ea Tecnologia (FCT, Ph.D. grant PD/BD/135449/2017). JCAB се подкрепя от грант от Административния отдел за наука, технологии и иновации, COLCIENCIAS, в Колумбия (покана 756/2016). BN се подкрепя от грант за изследователи на NHMRC (Австралия) (APP1173314).

Изявление на институционалния съвет за преглед:

Проучването 300BCG е одобрено от местния комитет по етика CMO регион Arnhem-Nijmegen, NL58553.091.16.

Декларация за информирано съгласие:

Беше получено информирано съгласие от всички субекти, участващи в проучването, съгласно одобрението на етичния комитет Arnhem-Nijmegen (№ 2010-104).

Декларация за наличност на данни:

Данните за РНК секвениране, представени в това проучване, са налични в NCBI Gene Expression Omnibus под номер за достъп GSE85243.

Благодарности:

Авторите биха искали да благодарят на всички доброволци за участието в проучването 300BCG.

Конфликти на интереси:

MGN е научен основател на TTxD. Останалите автори декларират липса на конфликт на интереси. Финансиращите нямат никаква роля в дизайна на проучването; при събирането, анализите или тълкуването на данни; в написването на ръкописа или в решението за публикуване на резултатите.

Препратки

1. Нетеа, М.Г.; Домингес-Андрес, Дж.; Барейро, LB; Чавакис, Т.; Дивангахи, М.; Fuchs, E.; Joosten, LAB; ван дер Меер, JWM; Mhlanga, MM; Mulder, WJM; et al. Определяне на трениран имунитет и неговата роля в здравето и болестта. Нац. Rev. Immunol. 2020, 20, 375–388. [CrossRef]

2. Quintin, J.; Саид, С.; Мартенс, ПВР; Giamarellos-Bourboulis, EJ; Ifrim, DC; Logie, C.; Джейкъбс, Л.; Янсен, Т.; Kullberg, BJ; Wijmenga, C.; et al. Инфекцията с Candida albicans осигурява защита срещу повторно заразяване чрез функционално препрограмиране на моноцитите. Клетъчен гостоприемник микроб 2012, 12, 223–232. [CrossRef]

3. Бекеринг, С.; Quintin, J.; Joosten, LA; Van Der Meer, JW; Netea, MG; Riksen, NP Оксидираният липопротеин с ниска плътност индуцира дългосрочно производство на провъзпалителни цитокини и образуване на пенести клетки чрез епигенетично препрограмиране на моноцити. Артер. Thromb. Vasc. Biol. 2014, 34, 1731–1738. [CrossRef] [PubMed]

4. Бен, CS; Netea, MG; Селин, Л.К.; Aaby, P. A Small Jab-A Big Effect: Неспецифична имуномодулация чрез ваксини. Тенденции Immunol. 2013, 34, 431–439. [CrossRef]

5. Изкуства, RJW; Новакович, Б.; ter Horst, R.; Карвальо, А.; Bekkering, S.; Lachmandas, E.; Родригес, Ф.; Силвестър, Р.; Cheng, SC; Wang, SY; et al. Глутаминолизата и натрупването на фумарат интегрират имунометаболични и епигенетични програми в трениран имунитет. Cell Metab. 2016, 24, 807–819. [CrossRef] [PubMed]

6. Кийтинг, С.; Groh, L.; van der Heijden, C.; Родригес, Х.; Дос Сантос, Ж.; Fanucchi, S.; Okabe, J.; Kn, H.; van Puffelen, J.; Хелдър, Л.; et al. Комплектът 7 лизин метилтрансфераза регулира пластичността при окислителното фосфорилиране, необходимо за трениран имунитет, индуциран от бета-глюкан. Cell Rep. 2020, 31, 107548. [CrossRef] [PubMed]

7. Гарсия-Хименес, JL; Romá-Mateo, C.; Pérez-Machado, G.; Peiró-Chova, L.; Pallardó, FV Роля на глутатиона в регулирането на епигенетичните механизми при заболяване. Свободен Радик. Biol. Med. 2017, 112, 36–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Бекеринг, С.; Блок, BA; Joosten, LAB; Riksen, NP; Ван Кревел, Р.; Netea, MG In Vitro експериментален модел на обучен вроден имунитет при човека. Clin. Ваксина Имунол. 2016, 23, 926–933. [CrossRef]

9. Сохраби, Й.; Lagache, SMM; Schnack, L.; Годфри, Р.; Kahles, F.; Bruemmer, D.; Waltenberger, J.; Findeisen, HM Зависимият от mTOR оксидативен стрес регулира oxLDL-индуцирания обучен вроден имунитет в човешки моноцити. Отпред. Immunol. 2019, 9, 3155. [CrossRef] [PubMed]

10. Van Der Heijden, CDCC; Кийтинг, ST; Groh, L.; Joosten, LAB; Netea, MG; Riksen, NP Алдостеронът индуцира обучен имунитет: Ролята на синтеза на мастни киселини. Cardiovasc. Рез. 2020 г., 116, 317–328. [CrossRef]

11. Домингес-Андрес, Х.; Изкуства, RJW; Bekkering, S.; Бахрар, Х.; Блок, BA; de Bree, LCJ; Бруно, М.; Булут, Ö.; Дебисарун, Пенсилвания; Dijkstra, H.; et al. In vitro индукция на обучен имунитет в прилепнали човешки моноцити. STAR Protoc. 2021, 2, 100365. [CrossRef] [PubMed]

12. Новакович, Б.; Хабиби, Е.; Wang, S.-Y.; Изкуства, RJW; Давар, Р.; Megchelenbrink, W.; Ким, Б.; Кузнецова, Т.; Кокс, М.; Zwaag, J.; et al. -Глюканът обръща епигенетичното състояние на LPS-индуцирана имунологична толерантност. Cell 2016, 167, 1354–1368.e14. [CrossRef]

13. Костидис, С.; Addie, RD; Morreau, H.; Mayboroda, OA; Giera, M. Количествен NMR анализ на вътре- и извънклетъчния метаболизъм на клетки от бозайници: Урок. анален Чим. Acta 2017, 980, 1–24. [CrossRef]

14. Koeken, VACM; de Bree, LCJ; Mourits, VP; Мурлаг, SJCFM; Walk, J.; Чирович, Б.; Изкуства, RJW; Jaeger, М.; Dijkstra, H.; Lemmers, H.; et al. BCG ваксинацията при хора инхибира системното възпаление в зависимост от пола. J. Clin. разследване. 2020, 130, 5591–5602. [CrossRef]

15. Проект за човешка функционална геномика. Налично онлайн: http://www.humanfunctionalgenomics.org/site/ (достъп на 19 април 2021 г.).

16. Шах, TS; Liu, JZ; Флойд, JAB; Морис, JA; Вирт, Н.; Barrett, JC; Андерсън, Калифорния OptiCall: Стабилен алгоритъм за извикване на генотип за редки, нискочестотни и често срещани варианти. Биоинформатика 2012, 28, 1598–1603. [CrossRef]

17. Deelen, P.; Бондър, MJ; Van Der Velde, KJ; Вестра, HJ; Уиндър, Е.; Хендриксен, Д.; Франке, Л.; Swertz, MA Хармонизатор на генотип: Автоматично подравняване на нишки и преобразуване на формат за интегриране на данни за генотип. BMC Res. Бележки 2014, 7. [CrossRef]

18. Маккарти, С.; Das, S.; Kretzschmar, W.; Delaneau, O.; Ууд, AR; Teumer, A.; Kang, HM; Fuchsberger, C.; Данечек, П.; Шарп, К.; et al. Референтен панел от 64 976 хаплотипа за импутиране на генотип. Нац. Женет. 2016, 48, 1279–1283. [CrossRef]

19. Shabalin, AA Matrix eQTL: Ултра бърз eQTL анализ чрез големи матрични операции. Биоинформатика 2012, 28, 1353–1358. [CrossRef]

20. Фюрер, Т.; Хеър, Д.; Бегеман, Б.; Zamboni, N. Високопроизводително, точно масово метаболомно профилиране на клетъчни екстракти чрез масова спектрометрия с инжектиране на потока по време на полет. анален Chem. 2011, 83, 7074–7080. [CrossRef]

21. Калафати, Л.; Курцелис, И.; Schulte-schrepping, J.; Вергинис, П.; Mitroulis, I. Вроденото имунно обучение на гранулопоезата насърчава антитуморната активност. Cell 2020, 183, 771–785.e12. [CrossRef]

22. Cheng, SC; Quintin, J.; Cramer, RA; Шепардсън, KM; Саид, С.; Кумар, В.; Giamarellos-Bourboulis, EJ; Мартенс, ПВР; Rao, NA; Aghajanirefah, A.; et al. MTOR- и HIF-1 -медиирана аеробна гликолиза като метаболитна основа за трениран имунитет. Science 2014, 345, 1250684. [CrossRef]

23. Мурлаг, SJCFM; Rodriguez-Rosales, YA; Gillard, J.; Fanucchi, S.; Theunissen, K.; Новакович, Б.; de Bont, CM; Негиши, Й.; Фок, ЕТ; Калафати, Л.; et al. BCG ваксинацията предизвиква дългосрочно функционално препрограмиране на човешки неутрофили. Cell Rep. 2020, 33. [CrossRef]

24. Forrester, SJ; Кикучи, ДС; Hernandes, MS; Xu, Q.; Griendling, KK Реактивни кислородни видове в метаболитно и възпалително сигнализиране. Circ. Рез. 2018, 122, 877–902. [CrossRef]

25. Бренън, MS; Матос, МФ; Li, B.; Хроновски, X.; Гао, Б.; Juhasz, P.; Роудс, KJ; Scannevin, RH диметилфумарат и моноетилфумарат проявяват диференциални ефекти върху KEAP1, активирането на NRF2 и изчерпването на глутатиона in vitro. PLoS ONE 2015, 10, e0120254. [CrossRef]

26. Кауфман, Е.; Sanz, J.; Dunn, JL; Хан, Н.; Мендонса, LE; Pacis, A.; Целепис, Ф.; Pernet, E.; Dumaine, A.; Grenier, J.-C.; et al. BCG обучава хемопоетичните стволови клетки да генерират защитен вроден имунитет срещу туберкулоза. Cell 2018, 172, 176–190.e19. [CrossRef]

Anaisa V. Ferreira 1,2,*, Valerie ACM Koeken 1,3,4, Vasiliki Matzaraki 1, Sarantos Kostidis 5, Juan Carlos Alarcon-Barrera 5, L. Charlotte J. de Bree 1, Simone JCFM Moorlag 1, Vera P Муритс 1, Борис Новакович 6,7, Мартин А. Гиера 5, Михай Г. Нетеа 1,8 и Хорхе Домингес-Андрес.

1 Катедра по вътрешна медицина и Radboud Center for Infectious Diseases (RCI), Radboud University Nijmegen Medical Center, 6500 HB Nijmegen, Холандия;

Valerie.Koeken@radboudumc.nl (VACMK); Vasiliki.Matzaraki@radboudumc.nl (VM);

Charlotte.deBree@radboudumc.nl (LCJdB); Simone.Moorlag@radboudumc.nl (SJCFMM);

Vera.Mourits@radboudumc.nl (VPM); Mihai.Netea@radboudumc.nl (MGN).

2 Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4050-313 Порто, Португалия.

3 TWINCORE, съвместно предприятие между Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI) и Хановерското медицинско училище (MHH), 30625 Хановер, Германия.

4 Център за индивидуализирана инфекциозна медицина (CiiM), Отдел по компютърна биология за индивидуализирана инфекциозна медицина, съвместно предприятие между Центъра за изследване на инфекциите Хелмхолц (HZI) и Медицинското училище в Хановер (MHH), 30625 Хановер, Германия.

5 Център за протеомика и метаболомика, Медицински център на университета в Лайден (LUMC), 2333 ZA Leiden, Холандия; s.kostidis@lumc.nl (SK); jcalarcon_barrera@lumc.nl (JCA-B.);m.a.giera@lumc.nl (MAG)

6 Епигенетични изследвания, Детски изследователски институт Мърдок, Парквил, VIC 3052, Австралия;boris.novakovic@mcri.edu.au.

7 Катедра по педиатрия, Университет на Мелбърн, Мелбърн, VIC 3052, Австралия.

8 Отдел за геномика и имунорегулация, Институт за живот и медицински науки (LIMES), Университет на Бон, 53115 Бон, Германия.

* Кореспонденция: anaisa.validoferreira@radboudumc.nl (AVF); Jorge.dominguezandres@radboudumc.nl (JD-A.); Тел.: плюс 31-2436-16636 (JD-A.).

For more information:1950477648nn@gmail.com