Госипитрин, естествено срещащ се флавоноид, намалява индуцираното от желязо невронно и митохондриално увреждане: част 2

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

2.5. Откриване на Gos-Fe(I) комплекси

Правдоподобна хипотеза за обяснение на горните резултати е, че Gos образува преходен комплекс с Fe(ll), който улеснява неговото окисление от кислород. Този преходен комплекс може да достави своите електрони по-лесно от Fe()-цитрат, генерирайки по-стабилен комплекс с Fe(III). Фигура 6А показва типичен спектър на Gos с максимална абсорбция при 276, 332 и 380 nm (черна линия). Добавянето на Fe () предизвиква зависим от концентрацията спад в максималните пикове на абсорбция и появата на нов близо до 500 nm (Фигура 6А). Появата на масив от спектри, произхождащи от спектъра на Gos, беше потвърдена от наличието на изобестична точка при λiso=405 nm （вижте черни точки）, което показва химическо равновесие (комплексообразуване) между свободен и комплексиран Gos. Вмъкването (Фигура 6А) показва образуването на комплекс със стехиометрия 2:1 (Gos-iron). Стехиометрията на такива комплекси Gos-iron се определя по метода на Job, който показва точка на прекъсване при моларно съотношение 0,5.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Допълнителни доказателства за корелацията между желязото и Gos бяха получени чрез IR спектроскопия (Фигура 6B). За свободния Gos и неговия железен комплекс, широколентовата лента, разположена в диапазона от 3000-4000 cm-се разглежда като разтягане на водород- свързани хидроксилни групи поради наличието на водни молекули. Режимът на разтягане v(C=O) на свободния Gos възниква при 1654 cm-I, който е изместен към 1636 cm-I при образуване на комплекс. Този резултат предполага, че Fe(Ⅱ) е свързан с карбонилния кислород [31]. Освен това, наличието на v (Fe-O) разтягаща вибрация при 630 cm-I потвърждава образуването на комплекса желязо-Gos, тъй като свободният Gos не проявява такава лента.

Фигура 6. (A) Ефекти на Fe(II) върху UV-VIS спектъра на Gos (200-600 nm). Инкубационна смес, съдържаща 125 mM захароза, 65 mM KCl, 10 mM HEPES буфер (pH 7,2), 2 mM цитрат и Gos 1,6 μM. Концентрациите на Fe（I） от горните до долните следи бяха {{12 }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64,0.8,0.96 и 1.12 μM. Вмъкване∶ График на Йов за комплекса Gos-Fe（II） при постоянна обща концентрация 【Fe（D）】 плюс 【Gos】=1.6 μM. Черната точка показва изобестичната точка. Стрелките надолу и нагоре показват намаляване и увеличаване на стойностите на абсорбция при 380 и 500 nm, съответно. Експериментите са проведени при 28 градуса. Скоростта на сканиране беше 2 nm/sA базовата линия беше установена с инкубационната смес плюс 1,6 μM Fe（I）.（B）Инфрачервени спектри на Gos и Gos-Fe（I）. Показани са типични примери.

2.6. Gos предотвратява редукция на Fe(III) от аскорбат

Желязното състояние на желязото, стимулирано от Gos, представлява правдоподобен антиоксидантен механизъм, тъй като възпрепятства каталитичната активност на Fe(II). Независимо от това, Fe(III) все пак може да се редуцира отново до желязната си форма чрез естествени редуциращи агенти като аскорбат. Последният може да презареди биологичните системи с Fe(II), който участва в реакциите на Fenton-Haber-Weiss, генерирайки изключително реактивния ·OH радикал. За да проучим тези възможности, използвахме 1,10-фенантролин за измерване на нивата на образуване на Fe（II） от разтвор на Gos （100 μM）, обработен с 2 mM аскорбат и различни концентрации на Fe（II） ({{6} } μM）. Фигура 7 показва, че отсъствието на Gos позволява максимална степен на намаляване на Fe(II) до Fe(II) (черна линия с наклон от 5,85×10-3); този процес обаче беше забавен от присъствието на Gos (1-минутна инкубация, зелена линия) и след 5 минути инкубация с Gos, степента на редукция на Fe(I) от аскорбат намаля почти 3 пъти (червена линия с наклон от 2,04 × 10-3). Този резултат показва капацитета на Gos да инхибира медиираното от аскорбат редуциране на Fe() до Fe(I)

Фигура 7. Gos инхибира Fe(ⅢI)-редукция от аскорбат в отсъствието на митохондрии в черния дроб на плъх. Експериментални условия: 125 mM захароза, 65 mM KCl, 10 mM HEPES буфер (pH7.2), 1 mM цитрат, Gos 100 μM. Експериментите са проведени при 28 градуса. Аскорбат（4 mM） и 5 mM 1,10-фенантролин се добавят след 1 минута или 5 минути инкубация с Gos-Fe(I). Линиите са представителни за три анализа.

2.7. Gos Предпазва от 2-дезоксирибоза окислително разграждане

За да се документира способността на Gos да действа преференциално върху желязото вместо върху свободните радикали, бяха проведени конкурентни проучвания за оценка на ефективността на Gos и два·OH акцептора (DMSO и салицилат) за защита на 2,8 или 28 mM 2-дезоксирибоза от желязо -медиирано окислително увреждане (Фигура 8). ·OH акцепторите при 20 mM защитават 28 mM 2-дезоксирибоза значително по-малко от 2,8 mM2-дезоксирибоза (p<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">

Фигура 8. Ефект на Gos и·OH акцепторите диметилсулфоксид (DMSO) и салицилат върху окислителното увреждане на 2,8 или 28 mM 2-дезоксирибоза, индуцирано от Fe(II)-EDTA плюс аскорбат. Разтворите се инкубират за 30 минути при 37 градуса и съдържат 10 mM фосфатен буфер (рН 7,2), 2-дезоксирибоза (2,8 или 28 mM）, 150 μM EDTA и 50 μM Fe（ⅢI） Реакциите започват чрез добавяне на аскорбат до крайна концентрация от 2 тМ. Стълбчетата показват средно ± SD (n =3) Контролите съдържат само DMSO (0,001 процента), което е концентрацията на разтворителя в Gos пробите. Едностранният t-тест беше използван за *p<0.05, n.s.,="">

3. Дискусия

Желязото, освободено при няколко невродегенеративни състояния, включително исхемичен и хеморагичен инсулт, провокира дерегулацията на хомеостазата на желязото в мозъка, което води до патофизиологията на неврологичното увреждане [4,32-34]. На субклетъчни нива митохондриалното увреждане изглежда участва в медиираната от желязо невронална смърт [10,15,35-38]. Предклиничните доказателства подкрепят предимството на използването на хелатори на желязо, главно дефероксамин мезилат, срещу невродегенерация, включително всички видове инсулт [7,16]. Въпреки това, тяхната висока цена и недостъпност, както и широкият спектър от неблагоприятни ефекти на класическите хелатори на желязо, са довели до използването на естествени хелатори за управление на желязото при дисхомеостаза [39,40].

Cistanche може да подобри имунитета

Защитното действие на Gos е показано върху HT-22 клетки и митохондрии на мозъка на плъх, инкубирани със смес от желязо/цитрат, където открихме силна защита срещу индуцирано от желязо окислително увреждане. Миши хипокампални HT-22 клетки, изложени на претоварване с желязо (24 часа), показват намалена жизнеспособност, която е тясно свързана с ранното разсейване на потенциала на митохондриалната мембрана и намаляването на АТФ (съответно Фигура 2A-C). Това предполага, че митохондриалното увреждане допринася за смъртността на невроните. Наистина, при нашите условия се очаква поне част от Fe (II), качена в невроните, да достигне до органелите, тъй като индуцираната от желязо невронна смърт е предшествана от загуба на митохондриална функция. Следователно е доказано, че претоварването с желязо предизвиква клетъчна смърт на HT-22 хипокампала на мишка и митохондриална фрагментация [41,42]. По същия начин, продължителното излагане на желязо повишава митохондриалните нива на ROS в допаминергичните невробластоми SHSY5Y клетки [43]. Освен това, екстензивен приток на желязо в невроните на хипокампа, както и митохондриално увреждане, бяха потвърдени след излагане на 100 uM двувалентно желязо [36]. Тук наблюдавахме, че индуцираното от Gos запазване на жизнеспособността на хипокампалните неврони, засегнати от желязо, е тясно свързано със запазването на техния потенциал на митохондриалната мембрана и нивата на АТФ.

Както при непокътнати клетки, директното митохондриално излагане на двувалентно желязо провокира обширното подуване на органела, разсейване на мембранния потенциал и загуба на АТФ (съответно Фигура 3A-C). В тази експериментална среда Gos успя да защити претоварени с желязо митохондрии, което се изразява в запазване на гореспоменатите параметри. В този смисъл беше наблюдавано, че митохондриите, натоварени с микромоларна концентрация на желязо, претърпяха отваряне на порите на прехода на митохондриалната пропускливост и разсейване на △Y по начин, който е чувствителен към хелатиране на желязо, но не зависи от каталазното антиоксидантно действие |44]. Интересно е, че се съобщава, че антиоксидантът Mito-Tempo предпазва от увреждане от претоварване с желязо в невроните на хипокампа чрез изчистване на митохондриалния супероксиден анионен радикал и запазване на митохондриалната морфологична цялост и мембранен потенциал [36]. Наскоро описахме антиоксидантните ефекти на този флавоноид и способността му да защитава PC12 клетките срещу смърт, предизвикана от химическа хипоксия [29], където беше заключено, че улавянето на свободните радикали и антиоксидантната способност на Gos е частично включена в защитата срещу медиираната от желязо HT-22 и увреждане на митохондриите. Въпреки това, подобрената ефикасност на Gos срещу медиирана от желязо липопероксидация спрямо медиирана от тертбутил хидропероксид липопероксидация (съответно Фигура 4A, B) силно предполага, че неговият капацитет за взаимодействие с желязо е основният механизъм срещу увреждане, предизвикано от желязо.

За да се характеризира по-нататък взаимодействието Gos-Fe, бяха проведени няколко експеримента без клетки и без митохондрии. Ние наблюдавахме, че когато полифенолът се инкубира съвместно с Fe (II), концентрацията на металните йони намалява, докато има съответно увеличение на скоростта на консумация на кислород (Фигура 5A-C). Тези ефекти предполагат, че Gos премахва Fe(II) от цитратния комплекс и го окислява до желязна форма в процес, който изисква O2 като акцептор на електрони. Следователно Gos насърчава спада на концентрацията на Fe (II), което може да попречи на хидроксилните радикали чрез реакциите на Fenton. Тъй като комплексът Gos-Fe(II) позволява окисляването на съответните редуциращи агенти като аскорбат, което води до образуването/регенерирането на Fe(II), ние успяхме да демонстрираме, че Gos инхибира медиираната от аскорбат редукция на Fe(II) до Fe(II).

Хипотезата, че Gos силно взаимодейства с желязото, също беше потвърдена тук чрез спектроскопски техники и потвърди предишни резултати, при които различни масиви от

Стехиометрията на Gos-iron комплекс се характеризира с масова спектроскопия с йонизация на електрон [45].

Тези резултати доказват защитните ефекти на Gos срещу медиирано от желязо увреждане на невроните, вероятно чрез взаимодействие с железни йони, възпрепятствайки участието му в образуването на каталитични реактивни кислородни видове. Освен това, това предполага образуването на преходен комплекс за пренос на заряд между Fe(Ⅱ) и Gos, ускоряващ Fe(II) окислението и образуването на по-стабилен Fe(III)-Gos комплекс, който не може да участва във фазата на разпространение на липидите пероксидация. Освен това, биологично значим редуциращ агент като аскорбат не е в състояние да редуцира фери желязото в присъствието на Gos, ограничавайки прооксидантната характеристика на някои флавоноиди, участващи в рециклирането на железни йони. [30]. Gos в микромоларни концентрации е по-ефективен от класическите чистачи за предотвратяване на медиираното от желязо окисляване на 2-дезоксирибозата. Тази висока ефикасност може да се припише на образуването на редокс-активен Gos-Fe(II)/(), както по-рано наблюдавахме за други полифеноли, които подобряват ефективността си като антиоксиданти при взаимодействието им с желязото в различни in vitro парадигми на окислително увреждане [ 22, 46-48].

Установено е, че хелатиращите агенти, които съдържат кислород като лиганд (оксо лиганд, O2-), могат да хелатират желязото и да насърчат окисляването на Fe(I), стабилизирането на Fe(II) и следователно да доведат до намаляване на неговия редуциращ потенциал49]. При физиологично рН катехолите лесно образуват термодинамично стабилни бис комплекси с фери желязо, благоприятствани от ниските концентрации на лигандите. Наличието на катехолна част в структурата на Gos предполага подобен механизъм на взаимодействие с желязото, което би могло да обясни постигнатата защита срещу индуцирано от желязо увреждане на невронни клетки и митохондрии. В това отношение ние също по-рано демонстрирахме, че мангиферин и гутиферон А стимулират окислението на двувалентно желязо и възпрепятстват редуцирането на двувалентно желязо [23,24,26-28].

Способността на Gos да хелатира желязото може също да подтикне сигнални пътища, които допринасят за невропротекция. Например, ензимите на домейна на пролил хидроксилазата (PHD), класическият хипоксия индуцируем фактор-lalpha (HIF-1o) модифициращи хидроксилирането ензими при нормоксия, са идентифицирани като критични цели на хелатори на желязо, които са клинично полезни при много неврологични разстройства [50,51]. Това е разбираемо, тъй като PHD зависи от двувалентното желязо като фактор на свързване [52]. Няколко гена, които участват в неврозащитата, се регулират от HIF-la, като eNOS, VEGF и EPO [53]. Освен това, активирането на HIF в резултат на инхибиране на PHD може да предотврати митохондриално увреждане и апоптоза, медиирано от оксидативен стрес, независимо от ролята му на транскрипционен фактор [54].

Фероптозата, наскоро характеризираната зависима от желязото регулирана клетъчна смърт, е предложена като механизъм, чрез който умират невроните, изложени на хеморагично увреждане [8]. Митохондриалната дисфункция наскоро беше свързана със смъртта на фероптозните клетки [55]. Следователно, инхибирането на фероптозата, което спестява митохондриалната функция от увреждане на желязото, също може да бъде правдоподобен механизъм за невропротекция срещу медиирани от желязо неврологични разстройства, защитени от Gos, което би заслужавало допълнително внимание. Трябва да се направят допълнителни изследвания на предполагаемите благоприятни ефекти на Gos върху in vivo животински модели на невродегенерация, свързана с желязо, за да се предложи този флавоноид като терапевтична интервенция срещу увреждане на мозъчната тъкан, предизвикано от дерегулация на желязната хомеостаза.