Зелен синтез и характеризиране на железни наночастици, синтезирани от воден екстракт от листа на Vitex Leucoxylon и неговите биомедицински приложения

Резюме:Методът на студена екстракция е използван за получаване на водния екстракт отVitex leucoxylonлиста в съотношение 1:10. Железни наночастици (FeNPs) бяха синтезирани с помощта на воден екстракт от листаV. левкоксилонкато редуциращ агент. Фитомедицинският подход беше използван за получаване на FeNP чрез смесване на 1 mL растителен екстракт с 1 mM железен сулфат. Сканираща електронна микроскопия (SEM), инфрачервена спектроскопия с трансформация на Фурие (FTIR), ултравиолетово-видима спектроскопия (UV-Vis) и енергийно-дисперсионна рентгенова спектроскопия бяха използвани за изследване на синтезираните FeNP. Редукционната реакция се показва чрез промяна в цвета на разтвора и образуването на черен цвят потвърждава, че са се образували FeNP. Най-големият пик на абсорбция (max) е открит при 395 nm при UV-Vis спектрален анализ. FTIR спектрите наV. левкоксилонводен екстракт от листа показва промени в някои пикове, а именно 923,96 cm−1 и 1709.89 см−1, с функционални групи карбоксилни киселини, ненаситени алдехиди и кетони, които липсват в FTIR спектрите на FeNPs и са отговорни за образуването на FeNPs. FeNP с диаметри между 45 и 100 nm се наблюдават в SEM изображения. Създаването на FeNPs беше потвърдено от EDX, което показва силен сигнал в областта на металното желязо при 6–8 Kev. XRD разкрива кристална природа и среден диаметър от 136,43 nm.Антиоксидант,противовъзпалително, цитотоксични изаздравяване на раниin vitro тестове съобщават за значителна активност на FeNPs. Кумулативните констатации от настоящото изследване показват, че зеленият синтез на FeNPsповишава неговата биологична активности може да служи катовъзможно средство за заздравяване на кожни раниицитотоксичен агент срещу рак. Необходимо е бъдещо проучване за идентифицирането на механизмите, участващи в синтеза на FeNPs отV. левкоксилони неговите биомедицински приложения.

Ключови думи:Витекс левкоксилон; железни наночастици; SEM; заздравяване на рани; цитотоксичен

CISTANCHE ПОЛЗИ ЗААНТИОКСИДАНТ,ПРОТИВОВЪЗПАЛИТЕЛНО, ЦИТОТОКСИК ИЗАЗДРАВЯВАНЕ НА РАНИ

1. Въведение

Приложението на нанотехнологиите в науката и технологиите за производство на нови материали на ниво наномащаб е бързо развиваща се област [1]. Нанотехнологиите се занимават с производството на материали на атомно ниво, за да придобият отличителни свойства, които могат да бъдат манипулирани за предпочитани приложения. Тази област се разраства бързо с нейните приложения в науката и технологиите за производство на нови материали на наномащабно ниво [2]. Различни промишлени сектори възприеха нанотехнологиите през последните години поради приложенията им в областта на електронните системи за съхранение [3], биотехнологиите [4], магнитното разделяне и предварителната концентрация на целевите аналити, целевото доставяне на лекарства [5] и носителите за гени и лекарства доставка [3,5,6]. Следователно, тези частици имат потенциала да окажат значително въздействие върху обществото в резултат на широкия набор от приложения, за които могат да бъдат използвани. Наночастиците (NP) са маси от частици с размер под сто нанометра и се считат за ключови структурни маси в областта на нанотехнологиите. По-високата активност на NP е както тяхната определяща характеристика, така и качеството, с което са най-забележителни [7]. Органичните и неорганичните НЧ са двете основни класификации, които могат да се приложат към наночастиците. Неорганичните наночастици могат да включват магнитни НЧ, НЧ на благородни метали (като злато и сребро) и полупроводникови НЧ (като титанов диоксид и цинков оксид). Органичните наночастици могат да включват въглеродни НЧ. Неорганичните наночастици привличат огромно внимание, защото предлагат превъзходни свойства на материала заедно с функционална гъвкавост. Те са изследвани като възможни инструменти за медицински изображения, както и за лечение на заболявания поради характеристиките на размера, които притежават [8]. Разнообразните химични, физични и биологични свойства на NP са силно повлияни от различни параметри, включително размер и морфология на наночастиците, както и повърхностно покритие, които обикновено се определят по време на синтеза на наночастици. Загубата на предвидената биологична активност се причинява от намаляване на колоидната стабилност. pH, йонна сила и набор от протеини, които взаимодействат с AgNP при съответните обстоятелства, всички оказват влияние върху колоидната стабилност. В резултат на това правилният избор на техника за синтез е от решаващо значение за получаване на желаните характеристики на частиците за специфични приложения [9].

Понастоящем има голямо разнообразие от NP, които могат да бъдат синтезирани с помощта на различни физични, химични, биологични и хибридни процеси. Според констатациите на голям брой научни изследвания физичните и химичните процеси за производство на наночастици включват използването на органични разтворители, опасни съединения, значителни количества енергия и стабилизиращи агенти, които не са биоразградими [10]. Следователно, в областта на зелените нанотехнологии, синтезът на NP с използване на естествено налични материали като растителни екстракти, различни микроорганизми, техните метаболити и няколко естествени хуминови вещества [11,12] като редуциращи и затварящи агенти става все по-популярен. Методи за синтез, които са щадящи околната среда, са използвани за производството на голямо разнообразие от метални наночастици, включително сребро, злато, желязо, мед и цинк. Разработването на лесни и екологично приемливи методи за синтез на НЧ е един от ключовите фокуси на нанотехнологиите. Биоматериали като микроорганизми и растителни екстракти могат да бъдат използвани в процеса на приготвяне на голямо разнообразие от НЧ [13,14]. Въпреки това, тъй като някои организми са патогени, е опасно да се борави с тях. За да процъфтяват, микроорганизмите трябва да се поддържат в култура и да бъдат подложени на внимателно контролирани условия, включително температура, pH и други параметри. Тъй като елиминира трудоемкия процес на поддържане на микробната култура, синтезът на NP, използвайки растителни части, понякога може да се окаже по-изгоден от други биологични процеси [15]. В резултат на това той привлече много внимание поради присъщите си характеристики, които включват използването на природни ресурси, бързина, екологичност и доброкачественост. Тези привлекателни характеристики са абсолютно необходими за използване в медицински приложения. Наночастиците, произведени чрез зелен синтез, имат размер, който е добре дефиниран и под контрол, те не съдържат замърсители и методът е лесен за мащабиране. Това са някои от допълнителните предимства на зеления синтез [16]. Биологичната активност на синтезираните наночастици до голяма степен се определя и фино регулира от зелените материали, използвани за стабилността и редуцирането на метални йони. Едно от идеалните свойства на NPs трябва да бъде, че трябва да има изключителен капацитет за разграничаване между потенциални мишени (патогени) и клетки на бозайници (приемници) [17].

Поради това водният екстракт от листата на V. leucoxylon е изследван за потенциала му да улеснява образуването на железни наночастици (FeNPs) в настоящото изследване. Желязото е един от елементите, които могат да бъдат намерени в най-голямо изобилие на Земята. Наскоро той беше признат за нов клас важни NPs поради факта, че притежава разнообразие от уникални свойства, включително висока коерцитивност и суперпарамагнетизъм. Катализатор, електронни устройства, съхранение на информация, сензори, технология за доставяне на лекарства, биомедицина, магнитни записващи устройства и почистване на околната среда са само някои от многото интригуващи приложения, които са използвали FeNP [18]. Освен това, според редица изследвания, FeNP могат да бъдат създадени от различни растителни екстракти. Тези растителни екстракти включват листа от Eucalyptus globulus [19], листа от нар [20] и пепел от бананова кора [21]. Растението V. leucoxylon, което беше използвано в настоящото изследване, е член на семейство Verbenaceae. Известно е още като петлистно целомъдрено дърво (Канада: Sengeni, Holenekki, Hollalakki) и може да се намери в района по бреговете на реките във вечнозелени и полувечнозелени гори и влажни широколистни гори покрай потоци. Може да достигне височина до 20 m и се класифицира като скромно до голямо широколистно дърво. По дължината на горите на Западните Гати в Индия може да се намери в големи количества. Съобщава се, че инфузията на екстракт от листа на V. leucoxylon притежава голямо разнообразие от фармакологични действия като противовъзпалителни, антиоксидантни, антипсихотични, антидепресантни, антипаркинсонови и антихиперлипидемични действия [22]. Естествените продукти през цялата история и особено в народната медицина са били използвани за лечение на голямо разнообразие от заболявания и заболявания. Тази практика датира от древни времена. Методите на химията на природните продукти, които съществуват от дълго време, направиха възможно откриването на огромно разнообразие от биоактивни вторични метаболити, които идват от земни и морски източници. Значителен брой от тези естествено срещащи се вещества сега се разглеждат за използване като потенциални фармацевтични продукти [23].

Има голям брой естествено срещащи се химикали и хранителни вещества, които все още не са открити и са полезни за човечеството. Като следствие от това има незабавно търсене на изследвания и разработване на иновативни терапевтични възможности, които могат да бъдат използвани успешно в терапевтични интервенции, като същевременно създават минимално количество неблагоприятни ефекти.

Предложеният в момента процес на зелен синтез за FeNPs е различен и рентабилен. В настоящото изследване беше направен опит да се създадат наночастици при стайна температура без използването на химикали или физически техники. Растението Vitex leucoxylon беше избрано в опит да се синтезират железни наночастици и бяха проведени изчерпателни систематични in vitro модели за оценка на ефективността на железните наночастици. За това растение са публикувани само ограничен брой изследвания върху концепцията за наночастиците и техните биомедицински приложения. В резултат на това решихме, че би било полезно да проведем това изследване със следните цели: скрининг за фитохимикали и измерване на броя на вторичните метаболити във V. leucoxylon; зелен синтез и характеризиране на FeNP от V. leucoxylon; сравнително изследване на антиоксидантни и противовъзпалителни ефекти на V. leucoxylon и неговите FeNP in vitro; in vitro цитотоксична активност на воден екстракт от листа на V. leucoxylon и неговите FeNPs срещу рак на кожата, рак на белия дроб и рак на устата; in vitro активност за заздравяване на рани на воден екстракт от листа на V. leucoxylon и неговите синтетични FeNPs чрез анализ на надраскване.

2. Материали и методи

2.1. Събиране на растителен материал

През месец март 2022 г. пресни листа от V. leucoxylon бяха събрани от горската зона Анши в Западните Гати в окръг Утар Каннада в щата Карнатака в Индия. Листата бяха идентифицирани и удостоверени от д-р Котреша К., Таксономист, Департамент по ботаника, Научен колеж в Карнатака, Дарвад; Карнатака, като се позовава на екземпляра на ваучера, депозиран в Департамента по ботаника, Научен колеж в Карнатака, Дарвад, Карнатака. След като беше събран, пресният растителен листен материал беше измит под течаща чешмяна вода, изсушен на слънце и след това смлян на груб прах с помощта на механична мелница. Прахът се съхранява в контейнери, които се затварят при стайна температура, така че да може да се използва по-късно в процеса на екстракция на суров разтворител.

2.2. Приготвяне на растителен екстракт

Използвайки устройство на Soxhlet, 25 g листа на прах се екстрахират в продължение на 48 часа с 250 mL дестилирана вода. Водният екстракт се концентрира допълнително с помощта на ротационен изпарител и след това се изсушава в ексикатори, преди да се съхранява в затворена бутилка при 4 ◦C до употреба. За синтеза на FeNPs, водният екстракт се използва като редуциращ и стабилизиращ агент.

2.3. Разтворители и реактиви

Всички използвани химикали и разтворители са с аналитично качество и са закупени от Hi-media (Hubli, Индия).

2.4. Фитохимичен анализ

Следвайки процедурата, описана от Deepti et al. (2012), суровият воден екстракт от листа V. leucoxylon е тестван качествено за наличието на различни фитохимични съставки като флавоноиди, алкалоиди, феноли, гликозиди, стероли, лигнини, сапонини, антрахинони, танини и редуциращи захари [24].

2.5. Синтез на железни наночастици

Първо, 1 mL воден екстракт от листа на V. leucoxylon се добавя към 10 mL 0,05 mM FeSO4 воден разтвор и сместа се разклаща. При стайна температура и в тъмна среда се провежда целият процес на реакционната смес. Реакцията на окисление/редукция беше ясно видима, след като безцветната реакционна смес беше инкубирана и реагира за необходимото време [25]. За да се отстранят всякакви следи от воден екстракт от прясно синтезираните FeNPs, които бяха оставени да изсъхнат на прах след центрофугиране при 10,000 rpm за десет 10 минути по време на желания реакционен период, водната смес, съдържаща FeNPs, беше центрофугирана втори път и се редиспергира в двойно дестилирана вода и се изсушава [26].

2.6. Характеризиране на FeNPs

Няколко метода, като ултравиолетово-видима спектроскопия (UV-Vis), инфрачервена спектроскопия с трансформация на Фурие (FTIR), сканираща електронна микроскопия и енергийно дисперсионна рентгенова спектроскопия, рентгенова дифракция (XRD), анализатор на размера на частиците и зета потенциал, бяха използвани, за да се характеризират FeNPs.

2.6.1. Анализ, базиран на UV-видима спектроскопия

Първо, 1 mL аликвотна част от колоиден разтвор на FeNPs в кварцови кювети се оценява с помощта на UV-видима спектроскопия (U-3310, Hitachi, Токио, Япония), като се използва дестилирана вода като еталон и 0.05 mM FeSO4 като празна проба, за валидиране на редукцията на фери йони в колоидния разтвор [27].

2.6.2. Базиран на FTIR анализ

Функционалните групи (групи), които са били свързани на повърхността на желязото и са участвали в синтеза на FeNPs, са идентифицирани с помощта на FTIR спектроскопия (S700, Nicolet, MA, USA), [28]. След 72 часа инкубация, FeNPs се изолират чрез многократно центрофугиране (3–4 пъти) на реакционните смеси при 10, 000 rpm за 15 минути. Супернатантата се заменя с дейонизирана вода и пелетата се съхранява като прах. След изсушаване, FeNPs бяха подложени на FTIR анализ, използвайки процеса на пелетиране с калиев бромид в съотношение 1:100.

2.6.3. Анализ, базиран на сканираща електронна микроскопия

Сканираща електронна микроскопия (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, USA) беше използвана за изследване на наночастиците и установяване на тяхната повърхностна форма. Субстратите бяха приготвени върху чист 5 mm × 5 mm Si субстрат, отцепен от пластина с диаметър 100 mm. Субстратът се оставя да реагира в продължение на 2 часа до 6 часа и пробата се приготвя чрез центрофугиране на колоиден разтвор при 10,000 rpm за 5 минути. Пелетата беше изсушена след повторно центрофугиране много пъти, след което беше повторно диспергирана в дейонизирана вода и процедурата беше повторена. Накрая беше получена сухата пелета, която беше допълнително подложена на структурна характеристика чрез SEM анализ съгласно процедурата, описана от Националния институт за стандарти и технологии, NIST -2007 [29].

2.6.4. Енергийна дисперсионна рентгенова снимка

След изсушаване върху покрита с въглерод медна решетка, редуцираните FeNPs бяха анализирани с помощта на EDX (JSM-IT 500, Jeol, Бостън, Масачузетс, САЩ), което също позволи определянето на елементния състав.

2.6.5. Зета потенциал

Наблюдения на NPs Дзета потенциалът е полезен инструмент за получаване на допълнителна представа за стабилността на колоидните NPs. Амплитудата на зета потенциала дава намек за възможната стабилност на колоида. Според Meléndrez et al. (2010), частиците се считат за стабилни, ако техните стойности на зета потенциал са или по-положителни от плюс 30 mV, или по-отрицателни от 30 mV [30]. Този факт трябва да се вземе под внимание. Лазерният зета метър беше използван, за да се получат показания на повърхностните зета потенциали (Malvern zeta seizer 2000, Malvern, UK). Течните проби от наночастиците, общо 5 милилитра, се разреждат с 50 милилитра двойно дестилирана вода и 2 mm на квадратен метър натриев хлорид се използват като суспендиращ електролитен разтвор. След това pH се модифицира, докато достигне желаното ниво. Пробите се разбъркват общо 30 минути. След разклащане на контейнера се отбелязва рН в равновесие и се определя зета потенциалът на металните частици. За целите на определяне на повърхностния потенциал на FeNPs беше използван зета потенциал. Във всеки случай посочената стойност е средната стойност на резултатите от три отделни измервания. Когато стойностите на зета потенциала варират от по-високи от плюс 30 mV до по-ниски от 30 mV, се определят критериите за стабилност на NPs [31].

2.6.6. Анализатор на размера на частиците

За да се определи размерът на частиците на пробата, беше извършен тест за PSA върху нея, след като тя беше лиофилизирана и след това диспергирана с помощта на ултразвуков апарат (SZ-100, Horiba, Киото, Япония).

2.6.7. Рентгенов дифракционен анализ (XRD).

Синтезираните железни наночастици от воден екстракт от листа на V. leucoxylon бяха подложени на XRD анализ (Smart Lab SE, Ригаку, Токио, Япония), за да се определи природата, както и средният размер на наночастиците.

2.7. Определяне на антиоксидантната активност чрез използване на in vitro методи

2.7.1. Тест за намаляване на железните йони на антиоксидантната мощност (FRAP)

Според Oyaizu (1986), с малка модификация, е оценена редуциращата способност на железните йони [32]. За 30 min при 50 ◦C, 2,5 mL от 20 mM фосфатен буфер и 2,5 mL от 1 процент калиев ферицианид се добавят към 2,5 mL екстракт от листа на V. leucoxylon и неговите синтезирани FeNPs, смесени с комбинацията. След инкубационния период сместа беше допълнена с 2,5 mL от 10 процента w/v трихлорооцетна киселина и 0,5 mL от 0,1 процента w/w железен хлорид преди да бъде инкубирана за допълнителни 10 минути. Накрая се използва UV-V спектрофотометър за откриване на абсорбцията при 700 nm. Като стандарт се използва аскорбинова киселина. Всяка проба беше тествана три пъти.

2.7.2. Тест за поглъщане на водороден пероксид

Въз основа на способността на водния екстракт от листа на V. leucoxylon и неговите синтетични FeNPs да поглъщат водороден пероксид, беше оценена антиоксидантната активност на тези съединения. Първо, {{0}}.6 mL фосфатен буфер (рН—7,4), съдържащ 4 mM H2O2, се добавят към 0,5 mL стандартна аскорбинова киселина при известна концентрация, както и епруветки, съдържащи растителни екстракти при различни концентрации вариращи от 100 µL до 500 µL (pH—7,4). Използвайки фосфатен буфер и празен разтвор без водороден пероксид, ние оценихме абсорбцията на разтвора при 230 nm след 10 минути. Фосфатният буфер беше използван за създаване на контролата вместо пробата или стандарта [33]. Всяка проба беше тествана три пъти. Подходът на формулата беше използван за изчисляване на процента на инхибиране.

2.7.3. DPPH Почистване на свободните радикали

Анализ Екстрактът от листа на V. leucoxylon и синтезираните FeNPs бяха тествани за тяхната способност да улавят свободните радикали, като се използва DPPH радикал като реагент [34]. Пробите се комбинират с разтвор на DPPH радикал (60 М) в етанол (100 uL) при различни концентрации (w/v). UV-Vis спектрофотометър се използва за измерване на абсорбцията на сместа при 517 nm след 30 минути инкубиране на тъмно при стайна температура. Като стандарт за експеримента се използва аскорбинова киселина. Следното уравнение беше използвано за определяне на DPPH почистващата активност на всяка проба:

където Ac представлява абсорбцията на контролната реакция, която се извършва чрез смесване на 100 L етанол със 100 L от DPPH разтвора, и At представлява абсорбцията на тестовата проба. Експериментите бяха проведени в триплети. IC50 стойността се изчислява за всяка проба. По-високо ниво на свободна радикална активност се показва от реакционната смес с по-ниска абсорбция.

2.7.4. Анализ на фосфомолибден (PM).

Общата антиоксидантна активност се определя с помощта на стандартната техника на Prieto et al., 1999. Всяка епруветка, съдържаща 3 mL дестилирана вода и 1 mL разтвор на молибдатен реагент, получи воден екстракт от листа на V. leucoxylon и неговите FeNPs в различни концентрации, вариращи от 100 µL до 500 µL. Тези епруветки се инкубират в продължение на 90 минути при 95 ◦C. Абсорбцията на реакционната смес се измерва при 695 nm, след като тези епруветки се регулират до стайна температура за 20-30 минути след инкубацията. Референтният стандарт е аскорбинова киселина [35].

2.8. Оценка на in vitro противовъзпалителната активност

Противовъзпалителният ефект на водния екстракт от листа на V. leucoxylon и неговите генерирани FeNPs беше оценен с помощта на метода за денатуриране на протеини, очертан от Elias et al., 1988, с леки модификации [36]. Като стандартно лекарство се използва диклофенак натрий. Реакционна смес, съдържаща 2 mL известна концентрация на произведени FeNP (100 g/mL) със стандартен диклофенак натрий (100 g/mL) и 2,8 mL фосфатно буфериран физиологичен разтвор (pH 6,4) се смесва с 2 mL прясно кокоше яйце албумин (1 mM) и се инкубира при 27 ± 1 °C за 15 min. Денатурацията се индуцира чрез поставяне на реакционната смес във водна баня при 70 ◦C за 10 минути. След охлаждане се измерва абсорбцията при 660 nm, като се използва двойно дестилирана вода като празна проба. Всеки тест беше проведен три пъти. Следната формула беше използвана за изчисляване на процентното инхибиране на денатурацията на протеина:

където, At=абсорбция на тестовата проба; Ac=абсорбция на контрола.

2.9. Определяне на цитотоксична и противоракова активност на железни наночастици с помощта на МТТ анализ

Беше оценен ефектът на V. leucoxylon и неговите синтезирани FeNP върху жизнеспособността на нераковите фибробластни клетки L292 и неговата противоракова активност върху рак на кожата (A375), рак на белия дроб (A549) и рак на устната кухина (KB-3-1). използвайки стандартния МТТ анализ, според Carmichael et al., (1987) [37]. Всички клетъчни линии са получени от Националния център за клетъчни науки (NCCS), Пуна, Индия. Стойностите на процентно инхибиране на клетъчния растеж (IC50) бяха получени с помощта на криви доза-отговор за всяка клетъчна линия и следната формула беше използвана за изчисляване на процентното инхибиране на растежа. Превръщането на МТТ в лилав формазанов продукт от митохондриална дехидрогеназа на здрави клетки е в основата на този експеримент [38].

2.10. In Vitro изследване на зарастване на рани чрез използване на тест за надраскване

Способностите за разпространение и миграция на клетки от клетъчна линия L292, причинени от проби с известни концентрации на растителен екстракт и железни наночастици, бяха изследвани в настоящото изследване [39]. Плаки с животински клетъчни култури с DMEM среда, допълнена с 10 процента FBS и 2 процента Pen-Strep антибиотик (Дармщат, Германия) бяха използвани за започване на процеса на клетъчно култивиране. Стерилен пластмасов връх на пипета беше използван за надраскване на монослойния конфлуент от клетки, след като те нараснаха до приблизително 50 000 клетки на mL. PBS разтвор се използва за отстраняване на всички нежелани клетъчни остатъци. Като отрицателна контрола бяха използвани нетретирани клетки, докато стандартната аскорбинова киселина беше използвана като положителна контрола за полимерни проби с известна концентрация. През следващите 24 часа клетките се държат при 37 ◦C с 5% CO2. За изследване на относителната клетъчна миграция и затваряне на раната, надрасканите клетъчни слоеве се инкубират и изобразяват на интервали, вариращи от 0 h до 6 h до 12 h и 24 h. Измерването на MagVision Software (X64, 2016, Magnus, Ню Делхи, Индия) калибриране при 4 × резолюция беше използвано за количествено определяне на разстоянието на празнината. За да се определи скоростта на затваряне на раната и миграция, беше използвана формулата, показана по-долу:

по отношение на следното: A0h=площ на раната, измерена веднага след одраскване; ATh=площ на раната, измерена след h часа; Rm=скорост на миграция (µm/h); Wf=начална ширина на раната (µm); и T=време на миграция (час).

2.11. Статистически анализ

Данните са представени като средно стандартно отклонение и стандартна грешка и всеки експеримент е проведен три пъти. Софтуер SPSS версия 20 беше използван за извършване на еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) на разликите в средните резултати, които съществуваха между групите.

Питай за още:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/телефон: плюс 86 15292862950

МАГАЗИН:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop