Материали и методи

6. Тестове за клетъчно поемане

Интернализацията на EVs в клетките се наблюдава чрез първо оцветяване на LEVs и SEVs с липофилен DiI (MOP-D -3911) (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ). След третиране на клетки с оцветени EV за 1, 3, 6, 12, 24 и 48 часа, растежната среда се отстранява и клетките се фиксират с 4% параформалдехид (Wako, Япония). Добавя се Hoechst 33342 (Invitrogen) и клетките се инкубират в продължение на 15 минути при стайна температура за оцветяване на ядрата (синьо). Накрая клетките се промиват с PBS, съдържащ 1% говежди серумен албумин, и се наблюдава флуоресценция (червено и синьо) под флуоресцентен микроскоп (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия). Най-малко три полета бяха избрани и анализирани с помощта на софтуера ImageJ.

7. Измерване съдържанието на меланин

За да се оцени съдържанието на меланин, B16BL6 меланомни клетки първо се инокулират в 24-ямкови плаки (5 × 104 клетки/ямка) в обем от 500 μL. След 24 часа инкубация клеткитебяха третирани само със 100 nM -MSH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) или 50 μL LEVs и SEVs при 1, 5 и 10 µg/mL за 48 часа. След третиране клетките се промиват с PBS и след това се инкубират с 2,5 процента трипсин (Gibco, Thermo Fisher Scientific) за изолиране. Клетъчните микросфери се разтварят в 1n разтвор на натриев хидроксид (Sigma-Aldrich), съдържащ 1 процент DMSO (Sigma-Aldrich) за 1 час при 80 градуса. Клетъчните лизати се прехвърлят в 96-плака с ямки и съдържанието на меланин се определя чрез измерване на абсорбцията при 405 nm с помощта на ензимен маркер (BioTek). Съдържанието на меланин се определя с помощта на стандартна крива на меланин, конструирана от 0-100 µg/mL разтвор на синтетичен меланин (Sigma-Aldrich) (извънклетъчните везикули фигурират както следва). Съдържанието на меланин се изчислява чрез сравнение с контролите.

8. Анализ на тирозиназната активност

TYR активността се измерва с помощта на L-DOPA оксидазна активност. Клетките B16BL6 бяха инокулирани в -MEM среда, съдържаща 100 nM Sigma-Aldrich -MSH (500 μL) и култивирани при плътност от 1 × 105 клетки/ямка в 24-плаки за култура на ямки. След третиране на клетки с 50 μL LEVs и SEVs при концентрации от 10, 50 и 100 µg/mL в продължение на 24 часа, клетките се промиват с PBS и се лизират с 1% Triton X -100 (Sigma-Aldrich). Лизираните клетки се инкубират при - 80 градуса за 30 минути и след това се лиофилизират и съхраняват при RT за 10 минути. Получените проби се избистрят чрез центрофугиране при 12, 000 × g за 15 минути, след което се добавят 2 mg/mL L-DOPA (Sigma-Aldrich) и се инкубират при 37 градуса за 1 час. След това се измерва абсорбцията при 490 nm с помощта на ензимен маркер (BioTek). След това се измерва абсорбцията при 490 nm с помощта на BioTek.

Щракнете тук, за да получитеползите от Cistanche при избелване на кожатаикакви са ефектите на Cistanche tubulosa

9. Western blot анализ

Нивата на протеин, свързани с антимеланогенния път, се определят вътреклетъчно чрез Western blot анализ на екстракти от цели клетки. Обем от 500 μL B16BL6 миши меланомни клетки се инокулира в 24-ямкови плаки (1 × 105 клетки/ямка). Клетките се лизират чрез инкубиране в RIPA буфер (Thermo Fisher Scientific) в продължение на 20 минути в присъствието на смес от протеазен инхибитор (Roche, Германия) и се третират с 50 μL от 10, 50 и 100 μ g / mL EVs за 24 часа. Клетъчните лизати се центрофугират при 17 709 g за 15 минути и концентрацията на протеин в получените лизати се определя с помощта на комплект за анализ на BCA (Thermo Fisher Scientific). Равни количества протеин (10-20 ug/проба) бяха заредени в ямките на Bolt 4-12 процента Bis-Tris Plus гелове (Invitrogen) и електротрансферирани към PVDF (поливинилиден флуорид) мембрани (GE Healthcare, Чикаго, Иллинойс, САЩ). Мембраните се промиват с Tris-буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 0,2 процента (обем/обем) тен -20 (TBST), затварят се с TBST, съдържащ 5 процента (тегло/обем) обезмаслено мляко (Gibco, Thermo Fisher Scientific) за 1 час при стайна температура и след това се инкубира при 4 градуса в първичен разтвор на антитяло, разреден с 1 процент (w/v) обезмаслено мляко. Инкубацията се извършва една нощ. Използваните първични антитела включват анти-TRP-1 (1:1000), анти-TRP-2 (1:1000) и анти-MITF(1:1000) антитела от Abcam, Cambridge, UK; анти-TYR (1:500) антитела от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Анти - -актиново антитяло (1:500; Santa Cruz) се използва за стандартизация на ниво протеин. Първичните антитела бяха открити с белязано с пероксидаза от хрян (HRP) вторично антитяло от Genetex (Ървайн, Калифорния, САЩ). Мембраните се промиват с TBST и се инкубират в продължение на 1 час при RT с 1:2000 разреждане на вторичното антитяло в TBST. Сигналът, генериран след промиване на мембраната с TBST и инкубиране с реагент за подобрена хемилуминесценция (ECL) (GE Healthcare), беше открит с помощта на ImageQuant 350 гел образна система (GE Healthcare).

10. Електронномикроскопско откриване на вътреклетъчно производство на меланин

Клетките се обработват с LEV или SEV и се инкубират в продължение на 48 часа. След третирането клетките се фиксират чрез инкубиране с 200 тМ какодилатен буфер, съдържащ 8 процента глутаралдехид и 20 процента параформалдехид (Wako). След като се дехидратират с етанол, се приготвят ултра-тънки срезове с помощта на микротом Leica EM UC7 (Leica) и се събират върху 200-мрежеста медна решетка. Срезовете се оцветяват с 1% уранил ацетат и оловен цитрат и изображенията се получават с трансмисионен електронен микроскоп JEOL JEM 1010 (JEOL) при 80 kV.

Екстракт от цистанче

11. Измерване на избелващия ефект с помощта на модел на човешка кожа

Моделът на човешка кожа derm-me (Tego Science, Сеул, Корея) беше използван за тестване на избелващия ефект на LEVs. Човешка кожна тъкан беше третирана с 10 μ g/mL лев за 7 дни като отрицателна контрола. Концентрацията на арбутин е 70 µg/mL. Човешка кожна тъкан се разтваря в 1 N NaOH и абсорбцията при 405 nm се измерва с помощта на ензимен маркер (BioTek), за да се определи съдържанието на меланин. На 7-ия ден пигментацията на кожата беше сравнена чрез микроскопски анализ на оцветени по Fontana - Mason проби. За оцветяването по Fontana-Masson пробите от кожата се фиксират за една нощ при стайна температура в 4% параформалдехид (Waco), нарязват се на секции и се поставят в парафинов восък. След това вградените в парафин секции се нагряват в пещ при 60 градуса за 1 час, за да изсъхнат. След това срезовете се накисват три пъти в ксилен, два пъти в 95 процента етанол и два пъти в 100 процента етанол и след това се промиват с дестилирана вода. Оцветяването по Fontana-Masson се извършва с помощта на разтвор на амонячно сребро при 56 градуса и се промива с дестилирана вода. След това слайдовете се фиксират в 0,2% разтвор на златен хлорид и се потапят в 5% разтвор на натриев тиосулфат при стайна температура. Накрая предметните стъкла се дехидратират в пресен алкохол.

12. Статистически анализ

Данните, получени от експериментите, са изразени като средно ± SEM. Проведохме експерименти с четири партиди активност, съдържание на меланин и TYR активност (допълнителна фигура S3). Еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) и тест на Dunnett бяха извършени с помощта на GraphPad Prism (GraphPad Prism Software Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ). p < разлики; 0.05, p < 0.01, p < 0,001 се считат за статистически значими.

Екстракт от Cistanche tubulosa

Дискусия

За разлика от повечето еукариотни клетки, растенията имат сложна клетъчна стена, която представлява важна бариера за движението на екзозомите. В резултат на това растителните клетки освобождават екзозоми чрез серия от мултивезикуларни тела, слети с плазмената мембрана. Секреторните продукти, освободени от растителните секрети, се отлагат в периплазмената празнина, съседна на плазмената мембрана; докато се натрупват, те генерират налягане, което позволява на секрета да премине бариерата на клетъчната стена. В резултат на това секретираният материал, включително екзозомите, може да бъде освободен без нужда от енергия. EV, получени от растения, са подобни по размер или по-големи от естествено срещащите се екзозоми на животински клетки и са подобни на тези, наблюдавани в екзозомна течност на слънчоглед (50-200 nm) и EVs на Arabidopsis (50-300 nm). Ефективността на клетъчното усвояване се счита за ключов фактор за ефикасността, тъй като мишените на много терапевтични агенти са разположени вътреклетъчно. Следователно, ние определихме оптималното време и концентрация на усвояване от меланомни клетки и наблюдавахме бърз трансфер на LEVs и SEVs към меланомни клетки в рамките на 12 часа.

TYR е гликопротеин, който катализира превръщането на l-тирозиназата в L-DOPA, ограничаващата скоростта стъпка в синтеза на меланин. И двата EV показват антимеланогенен ефект, но антимеланогенният ефект на LEV е значително по-голям от този на SEV.

Производството на меланин се регулира от -MSH-MC1R и е известно, че инхибирането на PKC намалява пигментацията на кожата и косата. Въпреки това, много генетични, биохимични и фармакологични изследвания предполагат, че сигналният път -MSH-MC1R е основен двигател на меланогенезата. Въпреки че нашите експерименти не показаха директно взаимодействие между MITF и TYR, беше демонстрирано, че LEV инхибират меланогенезата чрез намаляване на експресията на MITF чрез UV-зависимия -MSHMC1R път, което от своя страна намалява експресията на TYR, TRP-1, и TRP-2. Ние предполагаме, че протеините от семейството на TRP са индиректно свързани един с друг, но може да са необходими допълнителни експерименти, за да се демонстрира пряко взаимодействие между тях. Освен това реконструираните модели на човешка кожа показват, че UV-индуцираният синтез на меланин и съдържанието на меланин се инхибират ефективно от LEV.

Cistanche dulcis

Заключение

Нашите открития предполагат, че LEV са кандидати за нови антимеланогенни лекарства, които намаляват меланогенезата чрез инхибиране на експресията на протеини, свързани с меланин. Резултатите потвърждават, че LEV намаляват MITF и по този начин регулират надолу TRPs в B16BL6 меланомни клетки. лева и арбутин инхибират TRY съответно с 66 процента и 67 процента. Съдържанието на меланин в третираната с LEVs реконструирана кожа е намалено с 43 процента и 28 процента в сравнение съответно с нетретираната отрицателна контрола и арбутин като положителна контрола.

Въз основа на ранните открития, ние вярваме, че получените от растения EV могат да бъдат полезни като антимеланогенен агент за разработването на естествена козметика. Необходими са по-нататъшни изследвания в бъдеще, за да се разработят EVs с растителен произход като ефективна съставка за подобряване на кожата и е необходимо да се демонстрира безопасността на EVs с растителен произход върху модели на човешка кожа. Нашите резултати показват, че EV може да се използва за намаляване на меланина и по този начин да изсветли кожата. Въпреки това, EV може да има токсични ефекти върху кожата и трябва да се извършат други експерименти като тестове за алергия или тестове на Ames.

ПРЕПРАТКИ

[1] Nosanchuk JD, Nimrichter L, Casadevall A, et al. Роля за везикуларен транспорт на макромолекули през клетъчните стени в гъбичната патогенеза. Commun Integr Biol. 2008; 1 (1): 37–39.

[2] Robinson DG, Ding Y, Jiang L. Неконвенционална протеинова секреция в растенията: критична оценка. Протоплазма. 2016; 253 (1): 31–43.

[3] Paiva EA. Как секреторните продукти преминават през растителната клетъчна стена, за да бъдат освободени? Нова хипотеза, включваща циклични механични действия на протопласта. Ан Бот. 2016; 117 (4): 533–540.

[4] Hood JL, Scott MJ, Wickline SA. Максимизиране на колоидната стабилност на екзозомата след електропорация. Анална биохимия. 2014; 448 (1): 41–49.

[5] Rutter BD, Innes RW. Извънклетъчните везикули, изолирани от апопласта на листата, носят протеини, реагиращи на стрес. Физиология на растенията. 2017; 173 (1): 728–741.

[6] Luan X, Sansanaphongpricha K, Myers I, et al. Инженерни екзозоми като рафинирани биологични наноплатформи за доставка на лекарства. Acta Pharmacol Sin. 2017; 38 (6): 754–763.

[7] Videira IF, Moura DF, Magina S. Механизми, регулиращи меланогенезата. Сутиен Dermatol. 2013; 88 (1): 76–83.

[8] Park HY, Lee J, Kapasi S, et al. Локалното приложение на инхибитор на протеин киназа С намалява пигментацията на кожата и косата. J Invest Dermatol. 2004; 122 (1): 159–166.

[9] Yamanishi DT, Graham M, Buckmeier JA, et al. Диференциалната експресия на гени на протеин киназа С в нормални човешки неонатални меланоцити и метастатични меланоми. Карциногенеза. 1991; 12 (1): 105–109.

[10] Borovansky J, Riley PA. Меланини и меланозоми: биосинтеза, биогенеза, физиологични и патологични функции. Хобокен, Ню Джърси: Wiley-Blackwell; 2011 г

[11] D'Mello S, Finlay G, Baguley B, et al. Сигнални пътища в меланогенезата. Int J Mol Sci. 2016; 17 (7): 1–18.