Каква роля играят активните съставки на Cistanche Tubulosa при болестта на Алцхаймер?

JIANHUA YANG1*, BOWEI JU1,2*, YAO YAN1, HUANHUAN XU1, SHANSHAN WU1, DANDAN ZHU1, DANDAN CAO1 и JUNPING HU2

Резюме.Настоящото проучване имаше за цел да изследва невропротективните ефекти нафенилетаноидни гликозиди(PhGs) върху H2O2- и -амилоиден пептид (A )1-42-индуцирано увреждане на PC12 клетки като in vitro модел наБолест на Алцхаймер (AD). Оптималните условия на индукция бяха установени чрез скрининг на различни времена на инкубация и концентрации. PC12 клетки бяха третирани с 0.5 µM A 1-42 и H2O2 в присъствието на PhGs за 24 часа и жизнеспособността на клетките след това беше оценена чрез МТТ анализ; Измерват се също освобождаването на лактат дехидрогеназа (LDH) и съдържанието на малондиалдехид (MDA). Оптималните условия за създаване наADМоделът беше третирането на PC12 клетки с 0.5 µM A 1-42 за 48 часа или с 25 µM H2O2, разтворен в DMEM с PBS. PhG при концентрации от 5, 25 и 50 µg/ml повишават жизнеспособността и намаляват освобождаването на LDH и MDA от PC12 клетки, увредени с A 1-42 или H2O2. В заключение, моделът на A 1-42- и H2O2-индуцирано PC12 клетъчно увреждане беше успешно установен. Показано е, че PhG имат значителен неврозащитен ефект срещу A 1-42- или H2O2-индуцирано клетъчно увреждане.

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanche tubulosa има много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

Въведение

Болест на Алцхаймер (AD), невродегенеративно разстройство с клиничните характеристики на прогресивна загуба на паметта и увреждане на когнитивната функция (1), е най-честата причина за деменция в световен мащаб (2). Финансовите разходи са огромни поради разпространението на AD (3). Следователно е необходимо спешно да се разработят подходящи средства за управление и превенция наAD.

Патогенезата наADе тясно свързано с натрупването на неврофибриларни възли и сенилни плаки (SP) в засегнатите области на мозъка (4,5). Съобщава се, че амилоидният пептид (A), основният компонент на SPs, има причинна роля в прогресирането наADтъй като има токсичен ефект върху невронните клетки (6). A фрагменти, включително A 1-40, A 25-35 и A 1-42, са генерирани чрез разделянето на амилоиден прекурсорен протеин (7). Установено е, че невротоксичността на A 1-42 е значително по-висока от тази на A 25-35 и A 1-40, а A 1-42 е в състояние да индуцираADмодел (1, 8-10). Оксидативният стрес може да участва в патогенезата наADи е основният механизъм, лежащ в основата на А-индуцирана невротоксичност (11-13). Няколко проучвания предполагат, че A 1-42 причинява вътреклетъчно натрупване на реактивни кислородни видове (ROS), което води до липидно и протеиново окисляване, увреждане на ДНК и активиране на сигнализирането на контролните точки на клетъчния цикъл (1,14,15). Прекомерните количества H2O2 могат да доведат до окислително увреждане и да индуцират апоптоза на PC12 клетки (16). Следователно, насочването към оксидативния стрес може да бъде обещаващ подход за разработването на терапевтични стратегии за инхибиране на А-индуцирана невротоксичност при AD.

Херба (Х.)Цистанче, китайско билково лекарство, което обикновено се използва в континентален Китай за подхранване на бъбреците и попълване на есенцията и кръвта, се използва за лечение на загуба на памет и старчески запек (17). Фенилетаноиден гликозид (PhG), една от основните съставки на H.Цистанче, подобрява увреждането на невроналната апоптоза, причинена от A 25-35 чрез неговите антиоксидантни ефекти (18,19). Предишно проучване идентифицира пет основни компонента от общите PhG, а именноактеозид, 2'-ацетилактеозид,ехинакозид, цистанозиди и изоактеозид (20). Сред тези компоненти,актеозидиехинакозидсе съобщава, че имат неврозащитни ефекти върху A 25-35- или H2O2-индуцирана невротоксичност (21-23). Например, Wu et al (24) предполагат, че актеозид иехинакозид

Ключови думи:фенилетаноидгликозиди, PC12 клетки, H2O2, -амилоиден пептид 1-42, невропротекция, цистанче

Материали и методи

Изготвяне на PhGs. Общите PhGs бяха извлечени от H.Цистанчекакто е описано по-горе (25). Изсушеното на въздух стъбло на H.Цистанчебеше прахообразен и екстрахиран чрез перколация с 80 процента EtOH. Перколатът се изпарява при понижено налягане, последвано от повторно суспендиране в подходящо количество H2O2 (1{{20}}0 µmol/l). Сместа се изолира върху SP-825 колона с макропореста смола (Mitsubishi Chemical, Токио, Япония) и се елуира с 0, 30, 50, 70 и 90 процента EtOH във вода. За да се получи богатата на PhG фракция, 30-50 процента EtOH елуенти бяха концентрирани и изсушени при понижено налягане. Извършена е ултравиолетова (UV) спектрофотометрия за определяне на общия PhG. Съдържанието на ехинакозид и актеозид се определя чрез течна хроматография под високо налягане съгласно предишен протокол (26). Използва се колона Hypersil ODS-2 (4.6x250 mm, 5 µm; Dalian Elite Analytical Instruments, Co., Ltd., Dalian, Китай) и се поддържа при стайна температура. Подвижните фази бяха метилцианиди и вода, съдържаща 0,4 процента фосфорна киселина (v/v; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Дармщат, Германия). Скоростта на потока беше 0.75 ml/min и дължината на вълната беше настроена на 333 nm.

Клетъчна култура и медикаментозно лечение. Клетъчната линия на феохромоцитома на плъх PC12 е предоставена от д-р He Chunhui, Медицинското училище, Медицински университет Синдзян (Урумчи, Китай). Клетките се култивират в модифицирана на Dulbecco среда на Eagle с високо съдържание на глюкоза (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, САЩ), съдържаща 10 процента фетален говежди серум (Sangon Biotech Co. Ltd., Шанхай, Китай) , 100 U/ml пеницилин и 100 U/ml стрептомицин в инкубатор при 37˚C, съдържащ 5 процента CO2 и 95 процента въздух. При достигане на 80 процента сливане, клетките се третират с 0,25 процента трипсин и се пасират.

За да се елиминира намесата на самото лекарство върху растежа на PC12 клетки, беше проведен експеримент за токсичност. Накратко, PC12 клетки (3x104 клетки/ml) се посяват в 96-плаки с ямки при 100 ul/ямка и се инкубират при 37˚C за една нощ. След изхвърляне на супернатанта, 200 µl пълен DMEM беше добавен в празната група, докато клетките в интервенционните групи бяха третирани с PhGs в различни дози (5, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 и 200 µg/ ml). След инкубиране на клетките при 37°C в продължение на 48 часа, към всяка ямка се добавят 20 µl МТТ разтвор (Sigma-Aldrich; Merck KGaA). След инкубиране в продължение на 4 часа, супернатантата се изхвърля и се добавят 150 ul диметилсулфоксид на ямка, последвано от разбъркване в продължение на 10 минути. Стойностите на оптичната плътност (OD) при 490 nm бяха открити с помощта на ELISA четец на плаки.

Индуцирано от 1-42 PC12 клетъчно увреждане. 1-42 пептид, закупен от Bioss Biotech (Пекин, Китай), се разтваря във вода (100 µg/ml). След това сместа се инкубира при 37°C в продължение на 4 дни и се съхранява при 4°C преди употреба.

PC12 клетки се посяват в 96-плаки с ямки (3xl04 клетки в 100 µl на ямка). След култивиране в продължение на 24 часа за прилепване се добавят 50 µl A 1-42 при различни крайни концентрации (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5 или 2 µM), разтворени в DMEM без серум, последвано от инкубиране за 24, 48, 72 или 96 часа. Клетъчната жизнеспособност беше оценена чрез МТТ анализ. Оптималната концентрация на A 1-42 беше 0,5, определена като µM.

PC12 клетки (3xl04 клетки на ямка) бяха третирани с различни дози PhGs (0, 0.5, 5, 25 или 50 µg/ml) в присъствието на 0,5 µM A 1-42 за 24 часа. Клетъчната жизнеспособност беше оценена чрез МТТ анализ.

H2O2-индуцирано PC12 клетъчно увреждане. PC12 клетки се посяват в плаки с 96-ямкови плаки (3xl04 клетки в 100 µl на ямка). След култивиране в продължение на 24 часа за прилепване се добавят 100 µl H2O2 при различни крайни концентрации (0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 и 500 µM), разтворени в DMEM със или без PBS (0,01 mol/l), последвано от инкубиране за 24 часа. Клетъчната жизнеспособност беше оценена чрез МТТ анализ. Оптималната концентрация на H2O2 и разтворител бяха определени за установяване на in vitro модел на AD.

PC12 клетки (3xl04 клетки на ямка) бяха третирани с различни дози PhGs (0, 0.5, 5, 25 и 50 цМ). След култивиране в продължение на 24 часа за прилепване, PC12 клетките бяха третирани със 100 ul H2O2, разтворен в DMEM с PBS в присъствието на PhGs в продължение на 24 часа. Клетъчната жизнеспособност беше оценена чрез МТТ анализ.

Тест за освобождаване на лактат дехидрогеназа (LDH). Клетъчното увреждане беше оценено чрез измерване на LDH активността в супернатантата на PC12 клетки с помощта на LDH комплект съгласно протокола на производителя (кат. № 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Китай). Накратко, двойно дестилирана H2O, 0,2 µmol/ml пирогроздена киселина, матричен буфер и коензим I буфер бяха добавени последователно на 48-ия час след лечението с лекарството. След инкубиране при 37°C за 15 минути се добавя 2,4-динитро-фенилхидразин. След това към всяка ямка се добавят 250 ul от 0,4 М разтвор на NaOH. Супернатантата се събира след инкубиране в продължение на 30 минути при стайна температура. След това се измерва абсорбцията при 450 nm с четец на микроплаки.

Измерване на малонов диалдехид (MDA). MDA се измерва в супернатанта на PC12 клетки с помощта на търговски комплект (кат. № 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) съгласно протокола на производителя. Накратко, дехидратиран алкохол и други реагенти се добавят по ред, последвано от инкубиране във водна баня при 95˚C за 40 минути. Сместа се центрофугира при 1,006 xg и 25˚C за 10 минути след охлаждане. След това супернатантата се използва за определяне на съдържанието на MDA. Впоследствие се измерва абсорбцията с четец на микроплаки при 532 nm.

Оценка на защитните ефекти на ехинакозид и актеозид срещу AD in vitro. PC12 клетки се посяват при плътност от 3xl04 клетки/ямка в 96-плаки с ямки (100 ul/ямка). Клетките се инкубират с лекарства, включително ехинакозид (кат. № 111670-200503; Национални институти за контрол на храните и лекарствата, Пекин, Китай) и ацетонид (кат. № 111530-200505; Национални институти за контрол на храните и лекарствата ) при различни концентрации (0,5, 25 и 50 µg/ml). Впоследствие клетките бяха третирани с A 1-42 или H2O2 в продължение на 24 часа и клетъчната жизнеспособност беше измерена чрез МТТ анализ.

Статистически анализ. Стойностите са изразени като средно ± стандартно отклонение. T-тестът на студента беше използван за междугрупови сравнения. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Чикаго, Илинойс, САЩ). П<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Резултати

Количествено определяне на PhG от H. Cistanches. UV спектрите наPhGsекстрахирани, както и стандартни разтвори наехинакозидиактеозидбяха записани и резултатите показаха, че UV спектрите са последователни (фиг. 1). UV спектрофотометрия

показа, че съдържанието на PhG е 87,6 процента. Резултатите от HPLC показват, че съдържанието на ехинакозид и актеозид е съответно 37,7 и 17,8 процента (фиг. 2).

Определяне на идеалната концентрация на PhG. В сравнение с празната група, PhG при 75, 100, 125, 150, 175 и 200 µg/ml има значителен инхибиторен ефект върху PC12 клетки (P<0.05), while="" phg="" at="" 5,="" 25="" and="" 50="" µg/ml="" showed="" low="" toxicity="" on="" pc12="" cells,="" and="" the="" cell="" viability="" was="">80 процента (фиг. 3). По този начин, PhGs в концентрация от 5, 25 и 50 µg/ml бяха използвани за третиране на PC12 клетки в следващите експерименти, поради това, че не повлияват клетъчната жизнеспособност.

Индуцирано от 1-42 PC12 клетъчно увреждане. В сравнение с тази в контролната група, клетъчната жизнеспособност в 0.5 µM A 1-42 група с нараняване е 63 процента (P<0.05). the="" cell="" viability="" was="" decreased="" by="" aβ1-42="" in="" a="" concentration-dependent="" manner,="" and="" the="" viability="" was=""><50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups="" (fig.="" 4).="" thus,="" treatment="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="" in="" vitro="" ad="">

Определя се също активността на PC12 клетки, третирани с 0.5 µM A 1-42 в присъствието на безопасни дози от PhGs (5, 25 и 50 µg/ml) за 24 часа. В сравнение с моделната група (P<0.01), phgs="" showed="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" rescued="" by="" phgs="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="">

H2O2-индуцирано PC12 клетъчно увреждане. Жизнеспособността на PC12 клетки, третирани с 25 µM H2O2, разтворен в DMEM с PBS, беше 56.43 процента. Жизнеспособността на PC12 клетки, третирани с 200 цМ H2O2, разтворен в DMEM без PBS, беше 71.64 процента (Таблица I). По този начин, PC12 клетки, третирани с 25 µM H2O2, разтворен в DMEM с PBS, бяха избрани като оптимално условие за установяване на AD модела.

В сравнение с контролната група, клетъчната жизнеспособност в моделната група е 48,8 процента (P<0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" phgs="" had="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" dose-dependently="" increased="">

PhGs и жизнеспособността на PC12 клетки, третирани с PhGs при концентрации от 5, 25 и 50 ug/ml, беше 54, 57 и 64 процента, съответно (Таблица II).

PhGs инхибират предизвиканото от нараняване освобождаване на LDH от PC12 клетки. В сравнение с контролната група, съдържанието на LDH в супернатантата на увредените PC12 клетки беше повишено, което беше инхибирано от PhGs по начин, зависим от концентрацията. Този резултат показва, че PhGs имат значителен невропротективен ефект върху PC12 клетки (фиг. 6).

Таблица I. Клетъчна жизнеспособност (проценти) след третиране с H2O2.

Таблица II. Клетъчна жизнеспособност след лекарствена намеса.

инхибирани от PhG по зависим от концентрацията начин. Този резултат показва, че PhGs имат значителен невропротективен ефект върху PC12 клетки (фиг. 7).

PhG и неговите компоненти ехинакозид и актеозид спасяват жизнеспособността на увредените PC12 клетки. В сравнение с моделната група, лечението с актеозид значително повишава жизнеспособността на A 1-42-увредените PC12 клетки в зависимост от дозата. PhGs и ехинакозидът също значително повишават жизнеспособността на A 1-42-увредени PC12 клетки при всички тествани концентрации (Фиг. 8A).

**P<0.05, vs.="" model="" group.="" aβ,="" â-amyloid="" peptide;="" phgs,="" phenylethanoid="" glycosides;="" ech,="" echinacoside;="" as,="">

В сравнение с моделната група, актеозидът значително повишава жизнеспособността на PC12 клетки, третирани с H2O2. PhGs също повишават жизнеспособността на PC12 клетки, третирани с H2O2, докато ефектът не е значителен при концентрации от 5 и 25 µg/ml (Фиг. 8B). В допълнение, ехинакозидът повишава клетъчната жизнеспособност при 25 µg/ml.

В заключение, актеозид, PhGs и ехинакозид упражняват значителни невропротективни ефекти върху PC12 клетки, подложени на нараняване с A 1-42 или H2O2.

Дискусия

Оксидативният стрес е основният механизъм в основата на А-медиираната невротоксичност при AD (11-13). Следователно, насочването към оксидативния стрес може да представлява подход за лечение на AD. В настоящото проучване беше успешно установен in vitro модел на AD, включващ 1-42- и H2O2-индуцирано PC12 клетъчно увреждане. Резултатите от анализите на MTT, LDH и MDA показват, че PhG повишават клетъчната жизнеспособност и намаляват освобождаването на LDH и MDA от PC12 клетки, подложени на нараняване. Може да се заключи, че PhG имат значителни невропротективни ефекти върху PC12 клетки.

За да се намалят ефектите на самите PhGs върху растежа на PC12 клетките и да се предотврати анормална пролиферация, безопасната доза PhGs беше определена в скринингов анализ. Резултатите показват, че PhGs при 75, 100, 125, 150, 175 и 200 µg/ml имат значителен инхибиторен ефект върху PC12 клетки (P<0.05,><0.01), while="" cell="" viability="" remained="">80 процента при концентрации от 5, 25 и 50 µg/ml. По този начин, PhGs в концентрация от 5, 25 и 50 µg/ml са безопасни за PC12 клетки.

Нараняването от A {{0}} е повлияно от определени фактори, включително разтворителя, времето за инкубация и качеството на продукта. В настоящото изследване 1-42 пептид се разтваря във вода (100 µg/ml) и се инкубира при 37˚C в продължение на 4 дни в CO2 инкубатор преди употреба. PC12 клетки бяха третирани с A 1-42 при концентрации от 0,5, 1, 1,5 и 2 цМ. Резултатите показват, че жизнеспособността на клетките е намалена с увеличаването на A 1-42 и жизнеспособността е<50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups.="" thus,="" treatment="" of="" pc12="" cells="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="" ad="" model.="" aβ25-35="" has="" been="" commonly="" used="" to="" establish="" ad="" models="" due="" to="" its="" low="" cost="" and="" simple="" operation="" (27-29).="" the="" neurotoxicity="" of="" aβ1-42="" is="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" aβ25-35,="" and="" aβ1-42="" is,="" therefore,="" the="" optimal="" aβ="" fragment="" for="" establishing="" an="" ad="" model="">

H2O2 е окислител и прекомерният H2O2 може да причини окислително увреждане и да индуцира клетъчна апоптоза (30). В настоящото изследване клетките PC12 бяха третирани с 25-500 µM H2O2, разтворен в DMEM със или без PBS. Резултатите показват, че H2O2, разтворен в DMEM без PBS, причинява анормална пролиферация на PC12 клетки. По този начин, третирането на PC12 клетки с 25 µM H2O2, разтворен в DMEM с PBS, е оптималното условие за установяване на AD модела. Индуцираното 1-42-нараняване е по-голямо от нараняването, предизвикано от H2O2- поради слабата стабилност на H2O2 и ефектите на разтворителя.

Когато клетката е повредена, изтичането на LDH в културалната среда се увеличава значително. Известно е, че ROS причинява производството на MDA. Следователно съдържанието на MDA и LDH отразява количеството на окислителното увреждане. В настоящото проучване индуцираната от увреждане активност на LDH и MDA е намалена с увеличаване на дозите на PhG. Тези резултати показват, че PhGs има значителен невропротективен ефект върху PC12 клетки. МТТ анализът показа, че PhGs проявяват зависим от дозата невропротективен ефект върху PC12 клетки.

В заключение, беше успешно установен in vitro модел на AD, включващ 1-42- и H2O2-индуцирано PC12 клетъчно увреждане. Третирането с PhG повишава клетъчната жизнеспособност и намалява освобождаването на LDH и MDA от PC12 клетки, третирани с A 1-42 или H2O2. PhG имат значителен невропротективен ефект върху A 1-42- или H2O2-индуцирано клетъчно увреждане.

Препратки

1. Qu M, Zhou Z, Xu S, Chen C, Yu Z и Wang D: Свръхекспресията на морталин отслабва индуцираната от бета-амилоид невротоксичност в SH-SY5Y клетки. Brain Res 1368: 336-345, 2011 г.

2. Uzun S, Kozumplik O и Folnegović-Small V: Алцхаймерова деменция: преглед на текущите данни. Collegium antropologicum 35: 1333-1337, 2011.

3. Brookmeyer R, Johnson E, Ziegler-Graham K и Arrighi HM: Прогнозиране на глобалното бреме на болестта на Алцхаймер. Алцхаймер и деменция 3: 186-191, 2007 г.

4. Castellani RJ, Rolston RK и Smith MA: Болест на Алцхаймер. Болест на месец 56: 484-546, 2010 г.

5. Mattson MP: Пътища към и далеч от болестта на Алцхаймер. Nature 430: 631-639, 2004.

6. Gouras GK, Tsai J, Naslund J, et al: Intraneuronal A 42 натрупване в човешкия мозък. Американският журнал за патология 156: 15-20, 2000 г.

7. Shen C, Chen Y, Liu H, et al: Водородният пероксид насърчава производството на A чрез JNK-зависимо активиране на -секретаза. Journal of Biological Chemistry 283: 17721-17730, 2008 г.

8. Shih PH и Wu CH, Yeh CT и Yen GC: Защитни ефекти на антоцианините срещу индуцирано от амилоид-пептид увреждане в Neuro-2A клетки. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59: 1683-1689, 2011.

9. Figueiredo CP, Bicca MA, Latini A, Prediger R, Medeiros R и Calixto JB: Фолиевата киселина плюс -токоферол смекчава невротоксичността, предизвикана от амилоид- - чрез модулиране на активността на митохондриалните комплекси. Журнал за болестта на Алцхаймер: JAD 24: 61-75, 2010 г.

10. Dumont M, Lin MT и Beal MF: Митохондрии и насочени към антиоксиданти терапевтични стратегии за болестта на Алцхаймер. Вестник на болестта на Алцхаймер: JAD 20: S633, 2010 г.

11. Sonnen JA, Breitner JC, Lovell MA, Markesbery WR, Quinn JF и Montine TJ: Медиирано от свободните радикали увреждане на мозъка при болестта на Алцхаймер и неговите трансгенни модели на мишки. Биология и медицина на свободните радикали 45: 219-230, 2008 г.

12. Lin MT и Beal MF: Митохондриална дисфункция и оксидативен стрес при невродегенеративни заболявания. Nature 443: 787-795, 2006.

13. Trushina E и McMurray C: Оксидативен стрес и митохондриална дисфункция при невродегенеративни заболявания. Неврология 145: 1233-1248, 2007.

14. Huang SH, Lin CM и Chiang BH: Защитни ефекти на екстракт от Angelica Sinensis върху индуцирана от амилоид-пептид невротоксичност. Фитомедицина 15: 710-721, 2008.

15. Burhans WC и Heintz NH: Клетъчният цикъл е редокс цикъл: свързване на специфични за фазата мишени с клетъчната съдба. Биология и медицина на свободните радикали 47: 1282-1293, 2009 г.

16. Xue HY, Gao GZ, Lin QY, Jin LJ и Xu YP: Защитни ефекти на аукубин върху HO -индуцирана апоптоза в PC12 клетки. Фитотерапия

18. Liu, Fx Wang, Xw Luo L и Xin H, Na B и Wang Xf: Ефектите на гликозидите на цистанче върху ученето и паметта при индуцирана от бета-амилоиден пептид болест на Алцхаймер при мишки и нейният възможен механизъм. Китайски фармакологичен бюлетин 22: 595, 2006.

19. Bao B, Tang X, Tian H, Tong Y, Wu W и Hong Y: Антиоксидантна активност на екстракти от живи в пустинята Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wright Shanghai J Tradit Chin Med 44: 68-71, 2010 .

20. Jiang Y, Li S, Wang Y, Chen X и Tu P: Разграничаване на Herba Cistanches чрез пръстов отпечатък с високоефективна течна хроматография-диодна матрица за откриване-масова спектрометрия. Journal of Chromatography A 1216: 2156-2162, 2009 г.