Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Подобряване на производството на фенилетаноидни гликозиди чрез гъбичен елиситор в култура на клетъчна суспензия на Cistanche deserticola

Куй-тао Лу¹,∗ & Xing-guo Mei²

Ключови думи Cistanche deserticola, гъбичен елиситор,фенилетаноиден гликозид, растителна клетъчна култура

Резюме
Когато на 15-ия ден от растежа се появи елиситор отFusarium solaniсе добавя при 40 mg l^-1 да сеCistanche deserticolaклетъчни суспензионни култури, съдържанието на ехинакозид, актеозид и общфенилетаноидни гликозиди(PeGs) в култивирани клетки всички се увеличават през следващите 27 дни с над 100 процента до 15 mg g^-1сухо тегло, 9 mg g-1 сухо тегло и 57 mg g^-1 сухо тегло, съответно. Крайната биомаса (1,3 mg суха маса ml^-1) не беше засегнат.

Cistanche deserticola

Въведение

Cistanche deserticolaмамо (Orobanchaceae), местна билка от Китай, се използва широко в традиционната медицина за различни лечения, включително употреба като успокоително средство или усилвател на имунния отговор (Hsu et al. 1995, Chang et al. 1995).Фенилетаноидни гликозиди(PeG) са основните биоактивни метаболити вCistanche deserticola(Xiong et al. 2000) и са съставени от много компоненти като ехинакозид, актеозид, цизактеозид, изоактеозид, 2-ацетилактеозид, цистанозид A и османтузид B (Wang et al. 2000). С нарастващото търсене на тези продукти и бързия спад наCistanche deserticolaрастения, клетъчната култура би била привлекателно алтернативно средство за производство. Много елиситори (особено гъбични елиситори) могат да подобрят производството на метаболит в растителна клетъчна култура (Wang et al. 2001). Li et al. (1998) установиха, че гъбичен елиситор на Fusarium solani изолиран от кореновата система и на дветеCistanche deserticolaи неговият гостоприемник, Halaxylon ammodendron, може да подобри съдържанието на аминокиселини в калусите наCistanche deserticolaНо промените в съдържанието на PeGs в тази калусна линия не са споменати в тяхното проучване. В тази статия ефектите на елиситор от F. solani върху биосинтезата на общите PeG и два основни биоактивни PeG (ехинакозид и актеозид) и върху промените в клетъчния растеж са изследвани в суспензионната култура наCistanche deserticola.

Материали и методи

Растителни клетъчни култури
Калусът е индуциран от люспи наCistanche deserticolaи се поддържа в среда B5 на Gamborg (1968), допълнена с 0.5 mg индол-3-оцетна киселина l^-1, 2 мг кинетин л^-1,и 1 г казеинов хидролизат л^-1. рН се коригира до 6 преди стерилизация. Всички експерименти бяха проведени в 250 ml колби за разклащане, всяка съдържаща 100 ml среда на ротационен шейкър (120 rpm и 25 градуса) на тъмно. Инокулумът беше около 100 g пресни тегл^-1.

ефективно съдържание на Cistanche deserticola--фенилетаноиден гликозид

Приготвяне на гъбичен елиситор

Разделянето на гъбичен щам, Fusarium solani, и подготовката на гъбичен елиситор се извършват, както е описано по-горе (Li et al. 1998, Yu et al. 2001). Различни количества (въглехидратни еквиваленти) гъбичен елиситор бяха добавени към културите от разклащащата се колба на 15-ия ден (общият период на култивиране беше 42 дни).

Натрупване на биомаса и тест за жизнеспособност
Клетките от разклащаща се колба се промиват с дестилирана вода и се сушат чрез замразяване до постоянно тегло. Така се определя сухото тегло. Клетъчната жизнеспособност (процент на жизнеспособни клетки в клетъчна популация) се определя чрез редукция на 2,3,5-трифенил тетразолиев хлорид (Towill & Mazur 1975).

фенилетаноиден гликозиднаcistanche deserticola

Определяне на съдържанието на ехинакозид, актеозид и общфенилетаноидни гликозиди(PeGs)
Екстракцията на PeGs се извършва съгласно метода на Du & Liu (1993). ЛиофилизираноCistanche deserticolaклетките се екстрахират със 70 процента (v/v) етанол. Етаноловата фракция се концентрира, обезмаслява се с наситен с вода етилацетат и след това се излугва с наситен с вода п-бутанол. Фракцията на n-бутанола се концентрира, разтваря се във вода, зарежда се в колона с макропорна смола (AB-8, химически продукт на университета Нанкай, Тиендзин, Китай) и се елуира последователно с вода и метанол. Метаноловата фракция се събира и общото съдържание на PeGs се определя чрез използване на ехинакозид като стандарт при 334 nm. Ехинакозидът и актеозидът се определят чрез използване на колона Nova Pak C18 (250 × 4,6 mm) в HPLC система (вода) с UV детектор (334 nm).

Резултати

Ефект на гъбичния елиситор върху натрупването на биомаса и общата биосинтеза на PeGs Ефектите на гъбичния елиситор върху клетъчната биомаса и общото натрупване на PeGs зависят от добавената доза (въглехидратни еквиваленти). Както е показано на Фигура 1, по-ниските дози елиситор са благоприятни за сухото тегло наCistanche deserticolaклетки. Пикът беше с елиситора при 20 mg l^-1(давайки 1,76 mg сухо тегло ml^-1).
Общото натрупване на PeGs беше значително повишено от гъбичния елиситор между 20 mg l^-1и 80 mg l^-1. Елиситор при 40 mg l-1 получава най-висок добив (57 mg g^-1), което е над два пъти по-голямо от това, получено в контролната култура без еликситор. По-нататъшният експеримент използва гъбичния елиситор при 40 mg1^-1.

Фиг. 1. Сухо клетъчно тегло и общо натрупване на PeGs в суспензионна клетъчна култура наCistanche deserticolaв отговор на различни дози гъбичен елиситор. Към средата беше добавен гъбичен елиситор на 15-ия ден. Пробите са взети след още 27 дни. ▲, Крайно сухо клетъчно тегло; ◆, общото съдържание на PeG. Стойностите са средни стойности на трикратни резултати, а лентите за грешки представляват стандартни отклонения.

Времеви ход на клетъчния растеж и биосинтеза на PeGs
Фигура 2 показва времевия ход на клетъчната жизнеспособност и биосинтеза на PeGs (ехинакозид и актеозид) на суспензионни клетки, след като културите са били подложени на 40 mg l^-1гъбичен елиситор на 15-ия ден. В следващите 27 дни култура, ехинакозид и актеозид, двата основни биоактивни PeG вCistanche deserticola, и двете се увеличиха значително. На 39-ия ден са постигнати максимални натрупвания, достигащи 14,7 mg g^-1сухо тегло и 8,9 mg g^-1 сухо тегло, съответно. Не се наблюдава значителна разлика в клетъчната жизнеспособност между третираните с елиситор култури и контролата.

Фиг. 2. Клетъчна жизнеспособност и биосинтеза на ехинакозид и актеозид в суспензионна клетъчна култура наCistanche deserticolaслед третиране с 40 mg l^-1гъбичен елиситор. Гъбичният елиситор беше добавен към средата на 15-ия ден◆, третиран с ехинакозид с елиситор; ◇, ехинакозид-контрол; ●, третиран с актеозид с елиситор;○,

актеозид-контрол; ▲, клетъчна жизнеспособност-обработена с елиситор;△ , клетъчна жизнеспособност-контрол. Стойностите са средни стойности на трикратни резултати, а лентите за грешки представляват стандартни отклонения.

Дискусия

Много компоненти, получени от гъби (фрагменти от клетъчна стена, полизахариди, олигозахариди, гликопротеини и т.н.) са използвани като различни гъбични елиситори при производството на вторични метаболити с много видове растителни клетки. В тази статия хомогенатът (основно съставен от полизахариди) от гъбен щам Fusarium solani, изолиран от кореновата система наCistanche deserticolaи Halaxylon ammodendron е доказано, че е ефективен стимулатор за биосинтеза на PeGs в клетъчната култура наCistanche deserticola. Използването на този стимулатор за стимулиране на синтеза на PeGs в клетките беше не само значително, но беше изложено скоро след предизвикването. Това заключение е в съгласие с някои предишни проучвания върху растителни клетъчни култури (Wang et al. 2001).

В предишното проучване на Li et al. (1998), когато към културалната среда беше добавен гъбичен елиситор от F. solani, калус, индуциран от семената наCistanche deserticolaможе да остане жив в последващата дългосрочна субкултура и производството на иридоиди може да бъде подобрено. Той показва, че култивираните клетки могат да синтезират вторични метаболити на резистентност към болести, когато бъдат атакувани от микроорганизми. Въпреки че иридоидите не бяха определени в нашия експеримент, ние показахме, че полизахаридите от F. solani могат да се използват като ефективни гъбични стимулатори при производството на PeGs сCistanche deserticolaклетки.

ефективно съдържание на Cistanche deserticola--фенилетаноиден гликозид

От: ' Подобряване нафенилетаноидни гликозидипроизводство от гъбичен елиситор в култура на клетъчна суспензия наCistanche deserticola“ от Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-Guo Mei²

----Biotechnology Letters 25: 1437–1439, 2003 г. © 2003 Kluwer Academic Publishers. Отпечатано в Холандия.

Препратки

Chang Y, Wu H, Wang SN, Cheng HC (1995) Изследване на силните ефекти наCistanche deserticolaMa., Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. и Cistanche tubulosa (Schenk) R Wight. Китай Дж. Чин. Матер. Med. 26: 143–146.
Du NS, Liu JL (1993) Определяне нафенилетаноидни гликозидивCistanche deserticolaчрез спектрофотометрия с макровезикуларна смола. Нац. произв. Рез. Развивайте се. 5: 30–33.

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Изисквания от хранителни вещества на суспензионни култури от соеви коренови клетки. Exp. Cell Res. 50: 151–158.

Hsu WH, Chu SH, Sheng LC, Yuan KW, Mao CN (1995) Изследване на химическите съставки и фармакологичните ефекти наCistanche deserticolaмамо и Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. Брадичка. Традиция. Билка. Наркотици 26: 143–146.

Li S, Wu X, Dong XC, Zheng X, Zheng JH, Lou ZC (1998) Ефект на елиситора на Fusarium solani върху съдържанието на аминокиселини вCistanche deserticolaкалус. China J. Northwest Pharm. 13: 247–248.
Towill LE, Mazur P (1975) Изследвания на редукцията на 2,3,5-трифенилтразолиев хлорид като тест за жизнеспособност на растителни тъканни култури. Мога. J. Bot. 53: 1097–1102.
Wang CG, Wu JY, Mei XG (2001) Подобряване на производството и екскрецията на таксол в клетъчна култура на Taxus Chinensis чрез предизвикване на гъбички и обновяване на средата. Приложение Microbiol. Биотехнология. 55: 404–410.
Wang YM, Zhang SJ, Luo GA, Hu YN, Hu JP, Liu L, Zhu Y, Wang HJ (2000) Анализ нафенилетаноиден гликозидв екстракт от билка Cistanchis чрез LC/ESI-MS/MS. Acta Pharm. грях. 35: 839–842.
Xiong QB, Yasuhiro Tezukay, Takuji Kaneko, Li HY, Le Quan Tran, Koji Hase, Tsuneo Namba, Shigetoshi Kadota (2000) Инхибиране на азотен оксид от фенилетаноиди в активирани макрофаги. Евро. J. Pharm. 400: 137–144.
Yu LJ, Lan WZ, Qin WM, Xu HB (2001) Ефекти на салициловата киселина върху мембранно-липидната пероксидация, предизвикана от гъбични елиситори и производството на таксол в клетъчни суспензионни култури на Taxus Chinensis. Proc. Biochem. 37: 477–482.