Контакт: emily.li@wecistanche.com

Клинична ефикасност и транскриптомичен анализ на гранули Congrong Shujing (苁蓉舒痉颗粒) при пациенти с болест на Паркинсон със синдром на дефицит на есенция Shen (бъбрек)

CHEN Shi-ya1, XIAO Shao-jian1, LIN You-ning1, LI Xi-yu1, XU Qian2,

YANG Sha-sha2, HUANG Lian-hong3,4 и CAI Jing1,2

АБСТРАКТЦел: Да се ​​оцени клиничната ефикасност и безопасност наCongrong Shujing гранули(苁蓉舒痉颗粒, CSGs) при лечение на пациенти сболестта на Паркинсон(PD) и китайската медицина (CM) синдром на Шен (Бъбрек) дефицит на есенция и за изследване на потенциалния механизъм, включващ ефикасност чрез подход за секвениране на транскриптоми. Методи: Допустимите пациенти с PD със синдрома на дефицит на есенция Shen бяха разпределени на случаен принцип в група за лечение или контролна група чрез таблица с произволни числа и бяха лекувани съответно с CSGs, комбинирани със западна медицина (WM) или плацебо, комбинирано с WM. И двата курса на лечение са продължили 12 седмици. ЕдинниятБолестта на ПаркинсонРезултатът от скалата за оценка (UPDRS), резултатът от PD Question-39 (PDQ-39), резултатът от скалата за синдром на CM и употребата на лекарства от всички пациенти бяха оценени преди и след лечението. Безопасността е оценена чрез клинични лабораторни тестове и електрокардиографии. Кръвни проби от 6 пациенти във всяка група бяха събрани преди и след изпитването и използвани за транскриптомичен анализ чрез генен онтологичен анализ и Киото Енциклопедия на гените и анализ на пътя на геномите. Диференциално експресираните гени бяха валидирани с помощта на обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция. Резултати: Общо 86 пациенти с ПД бяха избрани от третата свързана народна болница на Фуджианския университет по традиционна китайска медицина между януари 2017 г. и декември 2017 г. Накрая 72 пациенти завършиха изпитването, включително 35 в групата на лечение и 37 в контролната група. В сравнение с контролната група след лечението, пациентите в групата на лечение показват значително понижение на UPDRS под-Ⅱ резултата, PDQ-39 резултата, резултата на CM синдром и еквивалентната доза на леводопа (P<0.05). during="" the="" treatment="" course,="" no="" significant="" changes="" were="" observed="" in="" safety="" indicators="" between="" the="" two="" groups="" (p="">0.05). Предложен е възможен механизъм на клинична ефикасност, който включва регулиране на процеси, свързани с клетъчния метаболизъм и пътища, свързани с рибозомите. Показано е, че лечението с CSG засяга съответните генни локуси за PD, включително AIDA, ANKRD36BP2, BCL2A1, BCL2L11, FTH1P2, GCH1, HPRT1, NFE2L2, RMRP, RPS7, TGFBR1, WIPF2 и COX7B. Заключения: CSG, комбинирани с WM, могат да се използват за лечение на пациенти с PD със синдром на CM на дефицит на есенция Shen с добра безопасност. Бяха предложени възможният механизъм на действие и съответните генни локуси. (Регистрационен номер ChiCTR-IOR-16008394)

КЛЮЧОВИ ДУМИ Congrong Shujing гранули, болестта на Паркинсон, рандомизирано контролирано проучване, РНК-секвениране, транскриптомика, китайска медицина

болестта на Паркинсон(PD) е невродегенеративно заболяване, което се среща както при популациите на средна възраст, така и при възрастните. Разпространението, заболеваемостта и свързаното с това икономическо бреме непрекъснато се увеличават. В общата популация изчисленото разпространение на PDn в индустриализираните страни е 0.3 процента. През 2030 г. се очаква броят на пациентите с PD да достигне 4940,000 в Китай и 8670,000 в световен мащаб. Относителният риск от смърт при пациенти с PD е около два пъти по-висок в сравнение с общата популация. Настоящите схеми на лечение обаче не могат да възпрепятстват прогресирането на състоянието. С прогресирането на заболяването клиничната ефективност на режима на лечение често намалява и ежедневното функциониране и социалното участие са значително компрометирани.) По този начин дългосрочните грижи за пациенти с ПД носят значителна икономическа тежест за индивидите, семействата и обществото.

Леводопа, "златният стандарт" за лечение на PD, обикновено е ефективен за 3-5 години. След това пациентите обикновено изпитват сериозни двигателни усложнения, включително феномен на края на дозата, сутрешна скованост, замръзване и дискинезия. Лечение на PD скитайски лекарства(CMs) могат да подобрят клиничните симптоми на пациентите и съответните странични ефекти, като по този начин подобрят качеството на живот на пациентите с PD.

Гранули Congrongjing(苁蓉精颗粒, CRJ) се състои главно отHerba Cistanchesи Polygonatum sibiricum, който произлиза от известната класическа CM рецепта Dihuang Decoction (地黄饮子), която се използва за лечение на PD. В нашите предишни експериментални проучвания благоприятните ефекти на CRJ бяха потвърдени. Данните показват, че Polygonatum sibiricum иHerba Cistanches, основният компонент на CRJ, подобрява експресията на допамин, намалява съдържанието на свързани апоптозни фактори (caspase-3, FasL), повишава експресиите на невротрофични фактори и намалява апоптозата на допаминергичните нервни клетки. Проучването също така показа, че CRJ защитава допаминергичните неврони чрез регулиране на апоптозата и невротрофичния фактор, получен от глиални клетки. Всички тези споменати по-горе предполагат, че CRJ е безопасно и ценно терапевтично лекарство за лечение на PD.

Въз основа на нашия клиничен опит и експериментални изследвания, CRJ беше модифициран чрез добавяне на Radix Paeoniae Rubra, Cortex Moutan и Salvia miltiorrhiza Bge., като по този начинCongrong Shujing гранули(苁蓉舒痉颗粒, CSGs) бяха съставени. Това проучване наблюдава клиничната ефикасност на CSG при лечение на пациенти с PD със синдром на CM на дефицит на есенция Shen (бъбрек) и генетичните промени в иРНК на периферната кръв на пациентите. За да се изследва основният механизъм на действие на CSG при лечението на PD, беше използван подход за секвениране на РНК (RNA-seq) за цялостен анализ на генните транскрипти на пациентите преди и след изпитването и за идентифициране и валидиране на диференциално експресирани гени (DEGs) .

МЕТОДИ

Диагностични критерии

Диагностичните критерии на западната медицина (WM) се отнасят до най-новите диагностични стандарти за PD, публикувани от Международното общество за паркинсон и двигателни разстройства през 2015 г. Диагностичните критерии на CM за синдрома на дефицит на есенция Shen се отнасят до свързаните стандарти, публикувани от China Press of Traditional Chinese Лекарство.

Критерии за включване и изключване

В проучването бяха включени пациенти, които отговарят на горните диагностични критерии на WM, както и на критериите за диференциране на синдрома на CM за дефицит на есенция Shen, на възраст 50–80 години, имаха скала за стадий на Hoehn-Yahr (HY) от 4 и подписани писмени информирани съгласия . Пациенти, които са били диагностицирани със сериозни заболявания, включително тежка органна дисфункция, психични или неврологични заболявания, тежки инфекции, тумори, енцефалит или алергична конституция, получили са лечение с CM за PD в рамките на 3 месеца или са участвали в други клинични изпитвания през последните 3 месеца, са били изключени.

Критерии за отпадане и прекратяване

Пациентите, които доброволно са се оттеглили от изпитването или не са успели да се свържат с тях, се считат за отпаднали. Пациенти, които са преживели тежки неблагоприятни ефекти или внезапни тежки заболявания и усложнения и не са били в състояние да продължат изпитването, имали са лошо съответствие от субекта, получили са по-малко от 80 процента или повече от 120 процента от определените дози за лечение, нарушили са протоколите на изпитването, предоставили са непълна информация, че повлияха на оценката на ефикасността, бяха изключени от проучването.

Участници

Бяха записани отговарящи на условията амбулаторни и хоспитализирани пациенти с ПД от третата свързана народна болница на Фуджианския университет по традиционна китайска медицина. Експерименталният план, информираното съгласие и формулярите за докладване на случаи получиха писмено одобрение от Комитета по медицинска етика на Трета свързана народна болница към Фуджианския университет по традиционна китайска медицина (№ 2017KS-6-1) и бяха регистрирани в Китайския клиничен Регистър на изпитванията (регистрационен номер ChiCTR-IOR-16008394).

Оценка на размера на извадката

Размерът на извадката е изчислен въз основа на данните, представени в предишното проучване, и методът за оценка на размера на извадката• 414 • Chin J Integr Med 2020 Jun;26(6):412-419 е установен от Статистическата работа на Китайските клинични изпитвания Група. Използвайки формулата за проектиране на съдържанието на извадката на напълно рандомизиран дизайн и като се има предвид процент на отпадане от 20 процента, беше определено, че групата за лечение и контролната група трябва да включват съответно 43 субекта.

Рандомизиране, прикриване на разпределението и заслепяване

В това проучване е използван напълно рандомизиран двойно-сляп метод. Софтуерът SPSS беше използван за произволно разпределяне на субектите към двете групи и за генериране на произволно номерирана таблица. Фармацевтите раздаваха лекарства според таблицата. Субектите, лекарите и рецензентите бяха заслепени за определянето на субектите и лекарствата.

лекарства

Всяка доза CSGs беше съставена от екстракта наHerba Cistanches6 g, Polygonatum sibiricum 12 g, Salvia miltiorrhiza Bge. 15 g, Radix Paeoniae rubra 12 g и Cortex Moutan 10 g. Плацебото се състои от 5 процента Radix Bupleuri с нишесте, декстрин и др. Неговият външен вид, миризма и вкус са подобни на тези на CSG. Както CSG (партида № 16004691), така и плацебо (партида № 16004728) бяха осигурени от Beijing Kangrentang Pharmaceutical Co., Ltd. (Пекин, Китай) и разпространени от Фармацевтичния отдел на Третата свързана народна болница на Традиционния университет на Фуджиан Китайска медицина.

Лечение

Субектите в групата на лечение са лекувани с WM в комбинация с CSGs, докато субектите в контролната група са лекувани с WM в комбинация с плацебо. WM бяха избрани според насоките. Сред тях най-често използваните лекарства са Madopar (партиден номер H10930198, Shanghai Roche Pharmaceutical Co. Ltd., Китай) и Sifrol (Boehringer Ingelheim Pharma GmbH, Германия). Съгласно предоставените насоки, по време на лечението, първичните лекари ще коригират дозировката на лекарството въз основа на състоянието на пациента. Всяка доза от CSG и плацебо беше разделена на два равни пакета, взети 0, 5 часа след закуска и вечеря, съответно, в продължение на 12 последователни седмици.

Измерване на резултатите

За измерване на резултатите, включително скали за оценка на употребата на лекарства и свързани индекси, субектите от двете групи бяха оценени от обучени лекари както преди проучването, така и 3 месеца след прилагането на първоначалната доза.

Измерване на първичния резултат

Унифицираната скала за оценка на болестта на Паркинсон (UPDRS) е съставена от точки Ⅰ (психично поведение, активно поведение и емоции), Ⅱ (ежедневни дейности), Ⅲ (моторно изследване) и Ⅳ (моторни усложнения). Колкото по-висок е резултатът, толкова по-тежко е състоянието.

Вторични измервания на резултатите

Включени вторични мерки за резултатБолестта на ПаркинсонВъпрос -39 (PDQ-39) резултат, (21) CM Syndrome Scale резултат и употреба на наркотици на WM. PDQ-39 оценява качеството на ежедневния живот на пациентите с ПД, като оценява техните действия, емоции, ежедневие и социална подкрепа. Скалата за синдром на CM оценява свързаните синдроми на CM на пациенти с PD, така че да се оцени тежестта на заболяването (Приложение 1). Дозировката на WM се изчислява като еквивалентна доза на леводопа (LED). За лекарства, свързани с лечението на PD и неговите усложнения, които не са включени във формулата на LED (т.е. бензхексол хидрохлорид), са направени съответните забележки.

Оценка на безопасността

Клиничните лабораторни тестове, включващи 3 основни процедури (кръв/урина/изпражнения), чернодробна функция (аспартат трансаминаза (AST) и аланин аминотрансфераза (ALT)) и бъбречна функция (азот на урея в кръвта (BUN) и серумен креатинин (Cr)), както и като електрокардиография (ЕКГ) на пациентите са оценени преди и след изпитването. Всички нежелани събития са записани с подробности за времето, степента на тежест, симптомите, продължителността, предприетите мерки и резултатите.

Статистически анализ

SPSS версия 24.0 (SPSS Inc., Чикаго, Илинойс, САЩ) беше използвана за статистически анализ. Данните от измерванията с нормално разпределение бяха изразени като средно ± стандартно отклонение (x–± s), докато данните с ненормално разпределение бяха изразени като медиана и интерквартилен диапазон. Преброяването беше изразено като абсолютни числа и проценти. Когато се сравняват данните от измерванията между групите, t-тестът за две проби се прилага, ако данните/трансформираните данни следват нормално разпределение. В други случаи беше приложен тестът за ранг-сума от две извадки. Когато се сравняват данните от измерванията преди и след опита, беше приложен t-тест за сдвоена извадка, ако данните/трансформираните данни следват нормално разпределение, докато беше приложен тестът за ранг-сума за сдвоена извадка. За сравнение на данните от преброяването беше използван тестът Хи-квадрат. П<0.05 was="" considered="" statistically="">

Експерименти за секвениране на транскриптоми

RNA-seq Кръвни проби от 6 пациенти във всяка група бяха избрани на случаен принцип преди и след опита и RNA беше извлечена, пречистена и оценена. За да завърши конструирането на библиотеката с проба за секвениране, общата РНК претърпя отстраняване на рРНК, фрагментиране, синтез на сДНК на първата верига, синтез на сДНК на втора верига, поправка на терминала, добавяне на А в 3' края, свързване на ставите и обогатяване. Конструираната библиотека беше валидирана от Qubit® 2.0 флуорометър и Agilent 2100. Секвенирането беше извършено след валидиране на библиотеката.

Биоинформатичен анализ

За биоинформатичен анализ, необработените показания, получени от анализа на последователността, първо бяха пречистени, за да се получат висококачествени и чисти показания. Впоследствие алгоритъм за сплайсирано картографиране на His at 2 (версия 2.04) беше използван за геномно картографиране на чистите четения. Броят на прочитанията беше преобразуван във фрагменти на кило-база екзонов модел на милион (FPKM) картографирани прочитания с помощта на Stringtie (версия 1.3.0) ​​и съкратената средна стойност на методите на М стойности за стандартизиране на генната експресия. След това, кратната промяна в диференциалната генна експресия беше изчислена от FPKM. Гени с aq стойност 0.05 и foldchange 2 се считат за DEG. Към DEG от съответната група с клинична ефикасност, анализ на обогатяване на функцията на генната онтология (GO) и пътека на Киото Енциклопедия на гените и геномите (KEGG)

беше приложен анализ на обогатяването. След коригиране на критериите за вариация, бяха избрани DEG на всяка група преди и след опита, които бяха локусите на генния ефект наCistanche deserticolaекстракт. Избраните гени бяха допълнително валидирани чрез полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT-PCR).

РЕЗУЛТАТИ

Условия за завършване на пробния период

A total of 86 PD patients were selected from the Third Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine between January 2017 and December 2017, 43 patients in each group. Finally, 72 patients completed the trial following the protocol, including 35 in the treatment group and 37 in the control group. The study flow diagram is presented in Figure 1. Between groups, no statistically significant difference was observed in age, disease stage, and H-Y stage (P>0.05, Таблица 1).

Сравнение на UPDRS резултатите между двете групи

There was no significant difference between the two groups before treatment in UPDRS total score and subsection score (P>0.05). В сравнение с резултатите преди лечението, UPDRS общият резултат и под-Ⅱ резултатът са значително намалени в групата на лечение след лечението (P<0.05). moreover,="" when="" compared="" with="" the="" control="" group="" after="" treatment,="" the="" updrs="" sub-ⅱ="" score="" was="" significantly="" decreased="" in="" the="" treatment="" group=""><0.05). however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" updrs="" total="" score="" between="" the="" two="" groups="" after="" treatment="" (p="">0.05, Таблица 2).

Сравнение на резултатите от PDQ-39, резултатите от CM синдром и употребата на лекарства между двете групи

There was no significant difference between the two groups before treatment in PDQ-39 scores, CM syndrome scores, and drug dosage (P>0.05). В сравнение с преди лечението, резултатите от PDQ-39, резултатът от CM синдром и LED бяха значително намалени в групата на лечение след лечението (P<0.05). moreover,="" when="" compared="" with="" the="" control="" group="" after="" treatment,="" the="" pdq-39="" score,="" cm="" symptom="" score="" and="" led="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" treatment="" group=""><0.05, table="">

Оценка на безопасността

During the trial, 2 cases in the treatment group with adverse events were observed. Both adverse reactions were light in grade and occurred on day 4 after the start of the trial, with symptoms of internal heat, thirsty, and dryness heat. One of them was not willing to continue the trial and dropped out. One week after terminating the CM granules, the symptoms reduced and then disappeared. Regarding the other subject, after Paeoniae Rubra and Salvia Miltiorrhiza were added to the CSGs, symptoms reduced after 4 days and disappeared. No changes were observed in the clinical laboratory tests and ECG that were directly related to the trial. In addition, no statistically significant differences were observed between the two groups in any of the indices before and after the trial (P>0.05).

Сравнение на генома

От шестте проби във всяка група, обхватът на броя на прочитанията в референтния ген беше 74452867–117774869. Съотношенията на картографиране на пробните транскриптомни последователности бяха 87,30 процента –96,14 процента.

Функционален анализ на DEG GO Анализ на DEG
DEG от групата на лечение преди и след изпитването бяха групирани в 47 функционални групи (Фигура 2). В допълнение, DEG между лекуваната група и контролната група след опита бяха групирани в 35 функционални клъстера (Фигура 3). DEG са свързани главно с клетъчната регулация и метаболитните процеси.

KEGG анализ на обогатяване на DEG
Анализ на обогатяване на пътя с помощта на публичната база данни на KEGG за DEG от съответната група с клинична статистическа значимост на P<0.05 of="" the="" efficacy="" evaluation="" indices="" above="" suggested="" that pd-related="" degs="" were="" likely="" to="" be="" enriched="" in="" the="" following="" 4="" signaling="" pathways:="" (1)="" ribosome-related signaling="" pathways,="" (2)="" endocytosis-related="" signaling="" pathways,="" (3)="" foxo="" signaling="" pathways,="" and="" (4)="" were="" identified.="" moreover,="" 1="" up-regulated="" gene="" and="" 12="" down-regulated="" genes="" were="" identified="" in="" the="" control="" group.="" according="" to="" the="" quantitative="" analysis="" of="" degs,="" 13="" highly="" degs="" related="" to="" csgs="" had="" an="" effect="" in="" the="" pd="" patients="" screened,="" including="" aida,="" ankrd36bp2,="" bcl2a1,="" bcl2l11,="" fth1p2,="" gch1,="" hprt1,="" nfe2l2,="" rmrp,="" rps7,="" tgfbr1,="" wipf2,="" and="">

RT-PCR анализ
Гените, споменати по-горе, бяха валидирани с помощта на RT-PCR анализ. Сред тях AIDA, ANKRD36BP2, BCL2A1, GCH1, HPRT1, NFE2L2, RMRP, RPS7 и COX7B бяха регулирани нагоре гени, докато TGFBR1 беше регулиран надолу (Приложение 3). Освен това няма значителна разлика в промяната на другите три гена.

ДИСКУСИЯ

Общо 95 процента от пациентите с ПД са на възраст между 40 и 70 години. Възрастта на началото е предимно около 50 години и честотата нараства с възрастта. В предишни проучвания се предполага, че активните съставки в CSGs намаляват свързаното с окисляването увреждане на PD и намаляват апоптозата на допаминовите неврони. Резултатите от това изпитване показват, че CSG намаляват дозировката на лекарството и подобряват качеството на живот на пациентите с PD. В това проучване общо 72 от 86 субекта са завършили изпитването. Степента на завършване беше само 83,7 процента, което беше относително ниско в сравнение с други подобни клинични изпитвания. Причините може да включват двата набора от изчерпателни тестове на субектите преди и след изпитването, сложни въпросници и редовно 3-месечно проследяване повторни посещения за коригиране на дозата. Необходими са допълнителни усилия за подобряване на съответствието на субектите и степента на завършване на изпитванията.

Има обаче още въпроси, на които трябва да се отговори. Могат ли CSG да заместят лекарства, като допамин, в ранния етап на лечение на PD и да забавят приема на лекарства? До кой стадий на PD CSG имат значителен ефект върху намаляването на дозата на лекарството? Могат ли CSG да удължат ефективния период на лекарството? За да се отговори на тези въпроси, са необходими по-нататъшни усилия, включително допълнителни казуси, по-дълги периоди на лечение, удължено проследяване след лечението, повишена подробна тежест и стратификация по възраст и по-изчерпателен статистически анализ.

Въз основа на наблюдението на ефективността на CSG при лечението на пациенти с PD, в това проучване ние изследвахме възможния механизъм на клиничната ефикасност на CSG и свързаните с тях гени чрез RNA-seq технология. Получени са транскриптът, резултатите от анализа на GO функцията, свързани с клиничната ефикасност, резултатите от анализа на пътя на KEGG и действащите генни локуси при лечението на CSGs при PD. Въпреки това ще са необходими допълнителни усилия за идентифициране на първичния път, който участва в активността на CSG, активните съставки и мономери в CSG за лечение на PD и съответните симптоми на генни локуси, върху които CSG действат. Бъдеще
проучванията трябва да се съсредоточат върху интегрирането на теориите на CM с биоинформатиката и съвременната молекулярна биология, за да се изследват ефектите и механизмът на действие на подсилващата терапия на Shen върху лечението на PD.

В обобщение, констатациите показват, че CSGs са ефективни за подобряване на качеството на живот, облекчаване на симптомите на CM и намаляване на дозата на лекарството при пациенти с PD със синдром на дефицит на есенция Shen. По време на изпитването не са наблюдавани сериозни странични ефекти. Нашето проучване показа, че CSG могат да бъдат потенциално ново лекарство за лечение на PD. Необходими са обаче по-голям размер на извадката, многоцентрови проучвания, за да се потвърдят тези открития, което е в рамките на бъдещия ни изследователски план.

Извлечено от: Клинична ефикасност и транскриптомичен анализ на гранули Congrong Shujing (苁蓉舒痉颗粒) при пациенти с болест на Паркинсон със синдром на дефицит на есенция Shen (бъбрек) от CHEN Shi-ya1 и др.

------Chin J Integr Med 2020 юни;26(6):412-419