HPLC за едновременно определяне на четири фенилетанол гликозидни компонента в парчета отварка от Cistanche Herba и екстракти от Cistanche Tubulosa

Резюме: Целта на това изследване е да установи aвисокоефективна течна хроматография (HPLC)метод за едновременно определяне на четири фенилетанол гликозида вCistanches Herba отвара парчетаиЕкстракти от Cistanche tubulosa. При хроматографските условия е използвана колона Inertsil ODS{{0}} (250 mm × 4,6 mm, 5 µm), с подвижна фаза, състояща се от ацетонитрил - 0.1% мравчена киселина разтвор, използващ градиентно елуиране. Скоростта на потока беше зададена на 1.0 mL/min, температурата на колоната беше поддържана на 30 градуса, а дължината на вълната на откриване беше 330 nm с инжекционен обем от 1{ {27}} µL. Линейността на площта на пика с концентрации варира от 2,53 до 201,60 µg/mL за различни гликозиди, с коефициенти на корелация (r) по-големи от 0,9993. Границите на откриване (LOD) и количествено определяне (LOQ) бяха съответно между 0,2249 до 1,1004 µg/mL и 0,3101 до 0,8161 µg/mL. Методът демонстрира добра прецизност, стабилност и повторяемост със стойности на RSD под 3,0%. Средните нива на възстановяване варират от 97,70% до 100,95%, което показва точността и ефективността на метода за едновременното количествено определяне на тези компоненти в пробите.

Ключови думи:Високоефективна Течна хроматография,Цистани Херба, парчета отвара,Екстракти от Cistanche tubulosa, фенилетанол гликозиди, определяне на съдържанието.

ХЕТИАН ДИЧЕНСТАЯ ЗА МИКРОБНИ ГРАНИЦИ

Cistanche, известен също като Rou Cong Rong и Desert Ginseng, принадлежи към семейство Orobanchaceae и се използва в традиционната медицина заради месестите си стъбла, покрити с люспи. Той паразитира в корените на растения Chenopodiaceae като Haloxylon и Tamarix и се среща предимно в сухите райони на Вътрешна Монголия, Цинхай, Синдзян и Нинся в Китай. За първи път е посочена в класическия билков текст „Шеннонг Бенкао Дзин“ като билка от най-висок клас. Cistanche има сладък и солен вкус, топъл е по природа и се свързва с меридианите на бъбреците и дебелото черво. Известно е със своите ползи за укрепване на бъбреците и ян, овлажняване на червата и облекчаване на запек, защита на черния дроб, против стареене, борба с умората и повишаване на имунитета. Клинично често се използва за лечение на състояния като бъбречен ян дефицит, кръвен дефицит, запек, безплодие при жени, слаби колене и гръб и влошаване на паметта. Cistanche е почитан като "Женшена на пустинята" и "ценно лекарство".

Растението съдържа фенилетанол гликозиди, иридоидни терпени, алкалоиди, лигнани и други компоненти, като ехинакозидът и актеозидът са представителни фенилетанол гликозиди, известни с ефектите си за подобряване на ян, против стареене, антиоксидантни свойства и подобряване на паметта. Тези компоненти са основната основа за лечебните ефекти на Cistanche и също така са ключови индикатори за оценка и контрол на качеството в изданието от 2020 г. на Китайската фармакопея.

Има съобщения за определяне на съдържанието на фенилетанол гликозид във видове Cistanche с помощта на високоефективна течна хроматография (HPLC), но те са ограничени до сурови материали и срезове Cistanche. Понастоящем няма национални стандарти за екстракт от Cistanche tubulosa и не е докладвано за определяне на съдържанието му. Нашите предварителни изследвания установиха, че Cistanche tubulosa от Xinjiang съдържа главно четири представителни фенилетанол гликозида: ехинакозид, изоактеозид, актеозид и тубулозид А. Това проучване установи HPLC метод за едновременно определяне на тези четири компонента както в парчета отвара от Cistanche, така и в екстракти от Cistanche tubulosa, с цел по-добра оценка на качеството на парчетата отвара от Cistanche и подпомагане на установяването на стандарти за качество за неговите екстракти. Докладът е следният.

1 Инструменти и реактиви

1.1 Инструменти

• LC-20AT високоефективен течен хроматограф, включително детектор с диодна матрица (Shimadzu, Япония)

• Електронен баланс AB135-S (Mettler Toledo, Швейцария)

• KQ-500DE ултразвукова почистваща машина (Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.)

• Система за свръхчиста вода Aike (Chengdu Tangshi Corning Science and Technology Development Co., Ltd.)

1.2 Реактиви

• Стандартни вещества на пинорезинол диглюкозид (Партиден номер S-003-01904003), Изомукронулатол 7-O-глюкозид (Партиден номер Y-073-11803024), Мукронулатол 7-O-глюкозид (Партиден номер M{ {6}}) и тубулозид A (Партиден номер G-066-11812016), всички закупени от Beijing Inlay Technology Development Co., Ltd., с чистота над 98%.

• Ацетонитрил и метанол с хроматографски клас, мравчена киселина с аналитичен клас, водата беше свръхчиста.

• Четири партиди парчета отвара от Cistanches Herba (код S1, S2 от Вътрешна Монголия; код S3, S4 от Синдзян) бяха закупени от четири аптеки в Урумчи.

• Екстрактите от Cistanche tubulosa (код S5, ензимно-инактивирана суха водна екстракция на срез; код S6, ензимно-инактивирана суха срезна алкохолна екстракция; код S7, ензимно-инактивирана суха срезна алкохолна екстракция със смола) бяха закупени от Xinjiang Hetian Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co. ., ЕООД

2 Методи и резултати

2.1 Хроматографски условия

• Хроматографска колона: колона Inertsil ODS-3 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm)

• Подвижна фаза: Ацетонитрил (A) - 0.1% воден разтвор на мравчена киселина (B) с градиентно елуиране (от 17% A до 20% A за 0-12 min, 20% A до 22% A над 12-30 min, 22% A до 17% A за 30-35 min)

• Скорост на потока: 1.0 mL/min

• Дължина на вълната на детекция: 330 nm

• Температура на колоната: 30 градуса

• Инжекционен обем: 10 µL

  

Физико-химична лаборатория Hetia Dichen

2.2 Приготвяне на разтвор

• Смесен стандартен разтвор: Претеглете точно всеки от четирите стандарта и прехвърлете в отделни мерителни колби от 10 mL, допълнете обема с 50% метанол, за да получите единични стандартни разтвори с концентрации от 1,008, 1,011, 1,012 и 1,012 mg/L съответно за Пинорезинол диглюкозид, Тубулозид А, Мукронулатол 7-О-глюкозид и Изомукронулатол 7-О-глюкозид. Измерете подходящо количество от всяко, комбинирайте в мерителна колба от 10 mL, доведете до обема с 50% метанол, разбъркайте добре, за да приготвите смесен стандартен разтвор с концентрации съответно 201,60, 50,55, 101,20 и 50,60 µg/mL, и филтрирайте през 0,45 µm мембранен филтър.

• Примерен разтвор: Приблизително 1.0 g прах от отвара от Cistanches Herba (прекаран през сито № 4) се претегля точно и се прехвърля в 1{{10}}0 ml кехлибарена мерителна колба . Добавете точно 50 mL 50% метанол, претеглете, ултразвуково екстрахирайте за 40 минути с мощност 250 W и честота 35 kHz, охладете, претеглете отново и допълнете загубената маса с 50% метанол. Разбъркайте добре, филтрирайте и съберете филтрата. Прекарайте през 0,45 µm мембранен филтър, за да получите разтвора на пробата Cistanches Herba. По подобен начин пригответе разтвора на пробата от екстракт от Cistanche tubulosa, като използвате приблизително 0,2 g от екстракта на прах.

1. Ехинакозид 2. Тубулозид А 3. Актеозид 4. Изоактеозид А. Смесен референтен разтвор Б. Тестови разтвор на парчета отвара от Cistanches Herba C. Тестови разтвор на екстракт от Cistanche Tubulosa

2.3 Методологичен преглед

Тест за пригодност на системата: Бяха взети проби от подходящи обеми от три разтвора от раздел 2.2 при хроматографските условия, описани в раздел 2.1, и бяха записани хроматограми. Резултатите показват, че теоретичният брой на блюдото за пика на ехинакозида трябва да бъде не по-малко от 3000, със степени на разделяне, по-големи от 1,5, което показва добро разделяне на базовата линия. Вижте фигура 1 за подробности.

Оценка на линейността: Точни обеми на смесения референтен разтвор от раздел 2.2 (0.5, 1.0, 2.5, 5.0 и 10.0 mL ) се прехвърлят в мерителни колби от 10 ml, довеждат се до обем с 50% метанол, разбъркват се добре и се използват за създаване на серия от смесени референтни разтвори. Точно 10 µL от тези разтвори бяха инжектирани при хроматографските условия на раздел 2.1. Записват се пикови площи и се извършва линейна регресия, като се използват концентрациите на компонентите (X, µg/mL) като независима променлива и пикови площи (Y) като зависима променлива. Регресионните уравнения и диапазонът на линейност могат да бъдат намерени в таблица 1.

Граници на откриване и количествено определяне: Бяха взети точни обеми от смесения референтен разтвор от раздел 2.2, съответно разредени и анализирани при хроматографските условия на раздел 2.1. Концентрациите, съответстващи на съотношенията сигнал/шум от 3:1 и 10:1, бяха използвани съответно като граници на откриване и количествено определяне. Резултатите са представени в таблица 1.

Тест за прецизност: Подходящ обем от смесения референтен разтвор от раздел 2.2 беше анализиран шест последователни пъти при хроматографските условия от раздел 2.1. RSD стойностите за пиковите площи на ехинакозид, тубулозид А, актеозид и изоактеозид са съответно 1,31%, 0,91%, 1,58% и 0,58% (n {{12} }), което показва добра прецизност на инструмента.

Тест за стабилност: Разтворите на тестовите проби бяха приготвени и оставени на стайна температура за 0, 2, 4, 6, 8, 12 и 24 часа, преди да бъдат анализирани при условията на раздел 2.1. RSD стойностите за пиковите площи на ехинакозид, тубулозид А, актеозид и изоактеозид са съответно 1,84%, 2,18%, 1,05% и 1,55% (n=7), което показва, че тестовите разтвори са стабилни при стайна температура температура до 24 часа.

Тест за повторяемост: Проба (ID: S2) беше претеглена точно и разделена на шест части. Всяка порция се приготвя като разтвор на тестова проба съгласно метода в раздел 2.2 и се анализира при хроматографските условия на раздел 2.1. Средното съдържание на ехинакозид, тубулозид А, актеозид и изоактеозид е 0.779%, 0.020%, 0.155% и 0.074%, съответно , със стойности на RSD от 1,21%, 3,12%, 2,65% и 2,96% (n=6), което демонстрира добра повторяемост на метода.

Тест за възстановяване: Беше взето известно количество проба (ID: S2) и разделено на девет порции. Всяка част беше добавена с ниски, средни или високи концентрации на отделните референтни разтвори, приготвени съгласно метода в раздел 2.2, и анализирани при хроматографските условия на раздел 2.1. Бяха записани пикови площи и бяха изчислени нивата на възстановяване. Резултатите са показани в таблица 2.

HPLC лаборатория Hetian DiChen

2.4 Определяне на примерно съдържание

Подходящите обеми от всяка партида проби бяха приготвени като тестови разтвори съгласно метода в раздел 2.2, след което бяха анализирани при хроматографските условия на раздел 2.1. Всяка проба беше тествана трикратно, пиковите площи бяха записани и съдържанието на пробите беше изчислено. Резултатите са показани в таблица 3.

3 Дискусия

В това изследване беше използван детектор с диодна матрица и бяха извършени сканирания на смесените референтни разтвори и разтвори на тестови проби в диапазона на дължината на вълната от 200 до 450 nm. Резултатите показват, че ехинакозидът и актеозидът показват максимална абсорбция при 330 nm, тубулозид А при 331 nm и изоактеозид при 327 nm. Освен това, позовавайки се на изданието от 2020 г. на Китайската фармакопея, което определя дължина на вълната на откриване от 330 nm за ехинакозид и актеозид, беше наблюдавано, че много компоненти имат значителни хроматографски пикове и високи стойности на реакция при 330 nm, което води до избора на 330 nm като крайната дължина на вълната на измерване.

От резултатите от определянето на съдържанието на парчета отвара от Cistanches Herba беше установено, че ехинакозидът има най-високо съдържание както в Cistanche tubulosa, така и в пустинния Cistanche, следван от актеозид, докато тубулозид А и изоактеозид имат относително по-ниско съдържание. Имаше значителна променливост в съдържанието на четирите фенилетанол гликозидни компонента и тази променливост също беше изразена между различни партиди от едно и също място или различни места. Тази вариация може да се дължи на фактори като географската среда, температурата, климата и процесите на събиране на суровините, които влияят върху натрупването на химически съставки в растенията. Докато химичните компоненти на Cistanche, произхождащи от различен произход, са сходни, концентрациите на тези компоненти варират, което води до разлики в техните ефекти. Следователно е подходящо да се избират суровини въз основа на тяхната ефикасност, за да се постигнат по-добри клинични резултати.

В обобщение, методът, установен в това проучване, е прост, бърз, точен и ефективен. Може да се използва за едновременно определяне на четири фенилетанол гликозидни компонента в парчета отвара от Cistanches Herba и екстракти от Cistanche tubulosa. Резултатите от определянето на съдържанието могат да отразяват нивата на качество на различни партиди и различни екстракти от едно и също или различни места, осигурявайки теоретична основа за установяване на съответните стандарти за качество.

Раздел. 2 Резултати от теста за възстановяване (n=9)

Раздел. 3 Резултати от определяне на съдържанието на четири фенилетаноидни гликозида в пробите (%,n=3)

Cistanche Ползи

Препратки:

1. 中文 (китайски): 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［M］．北京:中国医药科技出版社,2020:{ {1}}.
   英文 (английски): Национална фармакопейна комисия. Фармакопея на Китайската народна република (том 1) [M]. Пекин: China Medical Science and Technology Press, 2020: 140-141.

2. 中文 (китайски): 朱乃亮,徐荣,吴海峰,等. 荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉指纹图谱比较研究［J］. 中国药学杂志,2016,51(13):1116-1119.
   英文 (английски): Zhu Nailiang, Xu Rong, Wu Haifeng и др. Сравнително изследване на пръстовите отпечатъци на Cistanche deserticola и Cistanche tubulosa [J]. Китайски фармацевтичен вестник, 2016, 51(13): 1116-1119.

3. 中文 (китайски): 闫暾, 齐海平, 李旻辉, 等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉的对比［J］. 包头医学院学报, 2019,35(1):120-121.
   英文 (английски): Yan Tun, Qi Haiping, Li Minhui и др. Сравнение на Cistanche deserticola и Cistanche tubulosa [J]. Journal of Baotou Medical College, 2019, 35 (1): 120-121.

4. 中文 (китайски): 吴波,顾少菊,傅玉梅,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉通便与补肾壮阳药理作用的研究［J］. 中医药学刊,2003,21(4):539-548.
   英文 (английски): Wu Bo, Gu Shaoju, Fu Yumei и др. Проучване на слабителното и тонизиращо бъбречно-ян ефектите на Cistanche deserticola и Cistanche tubulosa [J]. Journal of Chinese Medicine and Pharmacy, 2003, 21(4): 539-548.

5. 中文 (китайски): 范亚楠,黄玉秋,贾日柱,等. 肉苁蓉炮制前后对衰老模型大鼠抗衰老及免疫功能的影响［J］. 中华中医药学刊, 2017, 35(11):2882-2885.
   英文 (английски): Fan Yanan, Huang Yuqiu, Jia Tianzhu и др. Ефекти на Cistanche deserticola преди и след обработката върху анти-стареенето и имунната функция при стареещи моделни плъхове [J]. Китайски вестник за традиционна китайска медицина и фармация, 2017, 35(11): 2882-2885.

6. 中文 (китайски): 吴波,付玉梅. 肉苁蓉总苷对亚急性衰老小鼠抗脂质过氧化作用的研究［J］. 中国药理学通报, 2005, 21(5):639.
   英文 (английски): У Бо, Фу Юмей. Проучване на антилипидния пероксидационен ефект на Cistanche гликозиди върху подостро стареене на мишки [J]. Китайски фармакологичен бюлетин, 2005, 21(5): 639.

7. 中文 (китайски): 胡余明,胡怡秀,刘秀英,等. 苁蓉总苷对正常小鼠学习记忆功能的影响研究［J］. 中国预防医学杂志, 2007, 8(4): 370-373.
   英文 (английски): Hu Yuming, Hu Yixiu, Liu Xiuying и др. Проучване на ефекта на гликозидите Cistanche върху функцията на ученето и паметта при нормални мишки [J]. Китайски вестник за превантивна медицина, 2007, 8(4): 370-373.

8. 中文 (китайски): 屠鹏飞,姜勇,郭玉海,等. 发展肉苁蓉生态产业推进西部荒漠地区生态文明［J］. 中国现代中药,2015,17(4):297-301.
   英文 (английски): Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai и др. Разработване на екологична индустрия Cistanche deserticola за насърчаване на екологичната цивилизация в западните пустинни райони [J]. Modern Chinese Medicine, 2015, 17(4): 297-301.

9. 中文 (китайски): 覃文婷,宿美凤,雒晓梅,等. 定性分析不同产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷类及多糖类成分［J］. 辽宁中医药大学学报, 2018, 20(7):77-81.
   英文 (английски): Qin Wenting, Su Meifeng, Luo Xiaomei и др. Качествен анализ на фенилетаноидни гликозиди и полизахариди в Cistanche deserticola от различен произход [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2018, 20(7): 77-81.

10. 中文 (китайски): 王力伟,曹瑞,房永雨,等. 超高效液相色谱-串联3重4极杆质谱联用法测定肉苁蓉中有效成分的含量［J］. 中药材, 2017, 40 (2): 295-300.
    英文 (английски): Wang Liwei, Cao Rui, Fang Yongyu и др. Определяне на активни компоненти в Cistanche deserticola чрез свръхефективна течна хроматография-тандемна тройна квадруполна масспектрометрия [J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2): 295-300.

11. 中文 (китайски): 初侨,席兴军,杨丽. 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷闪提工艺研究［J］. 食品研究与开发,2015,36(16):49-52.
    英文 (английски): Chu Qiao, Xi Xingjun, Yang Li. Проучване на технологията за флаш екстракция на ехинакозид и вербаскозид в Cistanche deserticola [J]. Изследване и развитие на храните, 2015, 36(16): 49-52.

12. 中文 (китайски): 余逸凡. 肉苁蓉属植物化学成分及药理活性研究进展［J］. 化工管理, 2019 (13): 111-112.
    英文 (английски): Ю Ифан. Напредък на изследванията върху химичните съставки и фармакологичните дейности на Cistanche [J]. Химическо управление, 2019 (13): 111-112.

13. 中文 (китайски): 王小新,骆婷婷. 肉苁蓉对小鼠抗疲劳及记忆力的影响［J］. 内蒙古中医药, 2014, 33 (22): 102–103.
    英文 (английски): Wang Xiaoxin, Luo Tingting. Ефект на Cistanche deserticola върху умората и паметта при мишки [J]. Inner Mongolia Journal of Traditional Chinese Medicine, 2014, 33(22): 102-103.

14. 中文 (китайски): 随家宁, 李芳婵, 郭勇秀, 等. 肉苁蓉化学成分,药理作用研究进展及其质量标志物预测分析［J］. 辽宁中医药大学学报,2021,23(1):191-196.
    英文 (английски): Sui Jianing, Li Fangchan, Guo Yongxiu и др. Напредък на изследванията върху химическите съставки и фармакологичните ефекти на Cistanche deserticola и прогнозен анализ на неговите маркери за качество [J]. Вестник на Университета за традиционна китайска медицина в Ляонин, 2021 г., 23 (1): 191-196.

15. 中文 (китайски): 刘涛, 殷松娜, 栾昕. 肉苁蓉对卵巢早衰大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响［J］. 中国临床药理学杂志, 2019, 35(23):3084-3087.
    英文 (английски): Liu Tao, Yin Songna, Luan Xin. Ефект на Cistanche deserticola върху имунните фактори и свързаните с апоптоза протеини при плъхове с преждевременна овариална недостатъчност [J]. Китайски вестник по клинична фармакология, 20