Хипогликемични и хиполипидемични ефекти на антоцианини от боровинки чрез AMPK активиране: In Vitro и in Vivo изследвания, част 1

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:Боровинките са богати на биоактивни антоцианини, с високо ниво на малвидин, което се свързва с антиоксидантни ползи, които допринасят за намаляване на риска от диабет. Целта на това проучване беше да се изследват хипогликемичните и хиполипидемичните ефекти на екстракта от антоцианин от боровинки (BAE),малвидин(Mv), малвидин-3-глюкозид (Mv-3-GLC) и малвидин-3-галактозид (Mv-3-gal) както в клетъчна линия на човешки хепатокарцином HepG2, така и във високо- диета с мазнини, комбинираща индуцирани от стрептозотоцин диабетни мишки. Лечението с висока глюкоза значително повишава чернодробния оксидативен стрес до 6-кратно и намалява жизнеспособността на HepG2 клетките. Предварителната обработка с BAE, Mv, Mv-3-glc и Mlv-3-gal значително смекчи тези щети чрез понижаване на реактивните кислородни видове (ROS) с 87, 80, 76 и 91 процента и увеличаване на жизнеспособността на клетките съответно с 88,79,73 и 98 процента. Тези предварителни обработки също така ефективно инхибират хипергликемия и хиперлипидемия, съответно чрез намаляване на нивата на експресия на ензими, участващи в глюконеогенезата и липогенезата и засилване на тези, участващи в гликогенолизата и липолизата, чрез аденозин монофосфат-активирана протеин киназа (AMPK) сигнален път в HepG2 клетки. За да се определи ролята на AMPK в индуцираната от BAE реакция на метаболизма на глюкозата и липидите in vivo, дози от 100 mg/kg (екстракти от боровинки антоцианин - ниска концентрация, BAE-L) и 400 mg/kg (екстракти от антоцианин от боровинки - висока концентрация , BAE-H) се прилагат на ден на мишки с диабет в продължение на 5 седмици. Лечението с BAE има значително (P<0.05) effect="" on="" body="" weight="" and="" increased="" the="" ampk="" activity,="" achieving="" the="" decrease="" of="" blood="" and="" urine-glucose,="" as="" well="" as="" triglyceride="" and="" total="" cholesterol.="" this="" research="" suggested="" that="">антоцианинидопринесе за индуцирания от екстракт от боровинкихипогликемияи хиполипидемични ефекти при диабет и BAE може да бъде обещаваща функционална храна или лекарство за лечение на диабет.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

1. Въведение

Захарният диабет (ЗД) е добре известно заболяване, което обикновено се характеризира с неспособност да се поддържат нормални нива на кръвната захар. Това хронично метаболитно разстройство причинява сериозни вреди на човешкото здраве и налага тежко финансово бреме на световните здравни системи [1]. Това заболяване се класифицира в два основни типа въз основа на причината за дисрегулация на кръвната захар. ЗД тип 1 се причинява от автоимунно разрушаване на бета-клетките, което води до невъзможност за производство на инсулин, докато диабет тип 2 се характеризира с инсулинова резистентност инсулиновите рецептори, които имат намалена функция, не позволяват на клетките да реагират адекватно на повишаването на кръвната захар.

Cistanche може да подобри имунитета

В допълнение към хипергликемия, диабетиците са склонни да иматхиперлипидемияи двете състояния могат да доведат до увреждане на органи и тъкани чрез повишен гликоксидативен стрес [2]. Производството на инсулин и увреждането на инсулиновите рецептори са сред факторите, които причиняват хипергликемия при диабетици. В черния дроб свръхекспресията на глюконеогенезата и гликогенолизата освобождава отново глюкоза в кръвния поток [3], докато в тънките черва свръхекспресията на глюкозен транспортер 2 (GLUT2) причинява увеличаване на глюкозния транспорт [4]. Хиперлипидемията, причинена от свръхекспресията на липогенезата в мастната тъкан [5], може също да причини нарушено стимулирано от инсулин усвояване на глюкоза и синтез на гликоген, което води до инсулинова резистентност и по този начин допринася за прогресирането на диабета 6]. Дългосрочните усложнения, свързани с диабета, засягат различни органи и включват хипертония, атеросклероза, ретинопатия, нефропатия, язви на краката и периферна невропатия [7].

Понастоящем няма лечение за диабет, но неговите ефекти могат да бъдат облекчени [8]. За хора, диагностицирани с диабет тип 1, комбинация от регулиране на диетата и подходящ прием на инсулин според консумираните въглехидрати е обичайното лечение. Настоящите предизвикателства за диабетици тип 1 включват неспособност или трудности при определяне на общите въглехидрати и подходящата доза инсулин; обаче почти идеаленгликемиченнива са възможни предвид технологичния прогрес, включително инсулиновите помпи [9]. За пациенти, страдащи от диабет тип 2, лечението може да бъде по-сложно, включително комбинации от регулиране на диетата, упражнения, инсулин и други лекарства с различни механизми на действие, които работят за понижаване на кръвната захар [10]. Общата диетична препоръка е да се следва диета с ниско съдържание на въглехидрати [11,12].

Боровинката е един от плодовете, които пациентите с диабет могат да консумират и може да намали риска от захарен диабет тип 2 (T2DM) [13,14]. Боровинките са богати на голямо разнообразие от съединения, полезни за човешкото здраве, включително минерали, фибри, органични киселини, фенолни киселини и флавоноиди, включително флавоноли и антоцианини [15,16]. Типичните антоцианинови профили обаче включват галактозидите, глюкозидите и арабинозидите на делфинидин, малвидин, цианидин, петунидин и пеонидин [17], като малвидинът и делфинидините обикновено имат основен принос за общото съдържание на антоцианин [18,19]. В наше предишно проучване [20] малвидинът е най-разпространеният антоцианидин, открит в екстракта от плодове на боровинки от заешко око, заедно с делфинидин, цианидин, петунидин и пеонидин, което е в съгласие с други автори, които също установяват, че малвидинът има важен принос за общото съдържание на антоцианин в различни видове боровинки [17,21].

Антоцианините от боровинки могат да подобрят инсулиновата чувствителност чрез антиоксидантен капацитет и чрез други регулаторни взаимодействия, тъй като техните ефекти не могат да бъдат обяснени изцяло с първото [13,22]. Проучванията също така откриват ползите от антоцианините от боровинки за други проблеми, свързани с диабета. В in vitro проучване, Huang et al. [23] установяват, че антоцианините от боровинки имат противовъзпалителни и антиоксидантни ефекти върху клетките на човешката ретина при условия на висока глюкоза. Клетките, изложени на висока глюкоза, имат 64 процента жизнеспособност, докато когато са изложени на екстракт от антоцианин от боровинки, малвидин, малвидин-глюкозид или малвидин-галактозид, тяхната жизнеспособност е 7-9 процента, 83 процента, 91- процента или { {11}} процента съответно. От друга страна, Song et al. [24] установяват, че антоцианините от боровинки намаляват оксидативния стрес и възпалението в ретината на плъхове с диабет. На плъхове с диабет са дадени 20, 40 и 80 mg/kg антоцианини от боровинки перорално в продължение на 12 седмици. Плъховете с високи дози антоцианини от боровинки имат по-ниска кръвна глюкоза, по-висок антиоксидантен капацитет и по-слабо възпаление в ретината и по-ниски реактивни кислородни видове в сравнение с тези без антоцианини от боровинки.

Въпреки че антоцианините от боровинки осигуряват ползи за здравето на черния дроб и други органи за диабетици, хипогликемичните и хиполипидемичните действия на екстракта от антоцианин от боровинки (BAE) в човешките чернодробни клетки са неясни. В настоящото проучване се спекулира, че BAE, както и Mv, Mv-3-glc и Mv-3-gal, имат хипогликемична и хиполипидемична активност в човешки хепатокарциномни клетки (HepG2) и мишки и че те може да поддържа глюколипидната хомеостаза, като по този начин облекчава развитието на диабет.

2. Материали и методи

2.1. Химикали и реактиви

Brightwell rabbiteye боровинки (Vaccinium ashei са събрани от Fujiabian Orchard Picking (Nanjing, Китай) и техните антоцианинови екстракти след това са получени и съхранявани на тъмно при {{0}} градуса. Реагентът 3- (4,5 диметилтиазол-2-ил)-2,5 дифенил-2Н-тетразолиев бромид (MTT) и стандартните малвидин (Mv), малвидин-3-глюкоза (Mv{ {11}}glc) и малвидин-3-галактоза (Mv-3-gal) са осигурени от Sigma Aldrich (Шанхай, Китай). HepG2 първични клетки, комплект за анализ на протеин на бицинхонинова киселина (BCA) и подобрен реагентите за хемилуминесценция (ECL) Western blotting са получени от CW Biotechnology (Пекин, Китай). Фетален волски серум (FBS), модифицираната среда на Dulbecco Eagle (DMEM) и пеницилин-стрептомицин са закупени от Gibco (Окланд, Нова Зеландия). BioFroxx стрептозотоцин (STZ) е закупен от Saiguo Biotech (Гуанджоу, Китай) Комплектът за откриване на дихлоро-дихидро-флуоресцеин диацетат (DCFH-DA) е закупен от Beyo-time Institute of Technology (Shan гхай, Китай). Говежди серумен албумин (BSA) е придобит от Shyuanye (Шанхай, Китай). Фуражите с високо съдържание на мазнини и захар (мазнини 35,5 процента, протеини 20 процента, въглехидрати 36,4 процента, 0,1 процента целулоза) и нормалните фуражи (мазнини 4,5 процента, протеини 23 процента, въглехидрати 31,9 процента, 3,7 процента фруктоза и 5,3 процента целулоза) за мишки са получени от Xietong Bioengineering Co., Ltd (Nanjing, Китай). Комплектите за анализ на инсулин, триглицериди (TG), общ холестерол (TCHD, глутатион пероксидаза (GSH-Px) и супероксид дисмутаза (SOD) са закупени от Jiancheng Bioengineering Research Institute (Nanjing, Китай). AndyGene human Forkhead Box O1 (FOXO1) , глюкозо-6-фосфатаза (G6Pase), гликоген синтаза-фосфорилиране (p-GS), гликоген синтаза киназа-3 бета-фосфорилиране (p-GSK3), глюкозен транспортер 2 (GLUT2), ацетил коензим А карбоксилаза (ACC), хормон-чувствителна триглицеридна липаза (HSL), 3-хидрокси-3-метилглутарил-коензим редуктаза (HMGCR) и комплекти за ензимно-свързан имуносорбентен анализ с инсулин на гладно (ELISA) бяха закупени от Bluegene Biotech (Шанхай, Китай) Всички химикали и реагенти, използвани в това изследване, са с чисто аналитично качество.

2.2. Антитела

Първични антитела срещу GS, p-GS (Ser641), стеролов регулаторен елемент-свързващ протеин-1c(SREBP-1c) и фосфоенолпируват карбоксикиназа (PEPCK) бяха получени от Abcam (Кеймбридж, Обединеното кралство) . Първични антитела срещу аденозин монофосфат-активирана протеин киназа алфа (AMPKa), p-AMPK a (Thr172), пероксизомен-пролифератор-активиран рецептор-y-коактиватор-1 (PGC-1), ACC, p- ACC (Ser79) и вторични антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян (HRP), бяха закупени от Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Антитяло срещу глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) е закупено от Nanjing Beidi Biomed Technology (Nanjing, Китай), докато антитяло срещу -актин е закупено от Sigma Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Първичните антитела се използват при разреждания 1:1000, докато разрежданията 1:4000 се използват за вторични антитела.

2.3. Приготвяне на екстракт от антоцианин от боровинки (BAE)

Екстракцията на антоцианини от боровинки беше извършена с помощта на нашия предишен метод на Huang et al. [25]. Замразените заешки боровинки се държат на стайна температура до размразяване. След това те бяха разбити при 10 000 rpm за 30 s, като се използва T18 основен ULTRA-TURRAX хомогенизатор (IKA Works Guangzhou, Китай). След това количество от 250 g боровинки се накисва в разтвор от 1000 mL метанол, съдържащ 1% НС1, за 24 часа. След това екстрактът се събира след центрофугиране при 5000 × g за 15 минути. След изпаряване на разтворителя при 40 градуса във вакуум, остатъкът се екстрахира с 1:1 (v/v) етилацетат три пъти. Водната фаза, съдържаща антоцианини, се събира и концентрира с помощта на вакуумно изпаряване, за да се получи суровият антоцианинов екстракт. Екстрактът беше допълнително пречистен с AB-8 макропореста смола (Sigma Aldrich, Шанхай, Китай). За да се отстранят фруктозата и протеина, екстрактът се подлага на колонна хроматография върху 1000 g AB-8 макропореста смола за 24 h абсорбция и след това се елуира с двойно дестилирана вода. Антоцианиновата фракция се елуира с 80 процента етанол, съдържащ 1 процента разтвор на НС1, концентрира се във вакуум и след това се изсушава с помощта на сушилня за замразяване Eyela FDU-1200 (Tokyo Rikakikai, Япония), за да се получи екстракт от антоциан от боровинки (BAE) прах.

2.4. Клетъчна култура и лечения

Клетъчните линии HepG2, получени от специфичен човешки хепатоцелуларен карцином, имат висок дял на специфични за черния дроб протеини. Поради тази причина те обикновено се използват като лабораторни модели за изследвания на човешки чернодробни клетки [26]. HepG2 клетките се отглеждат в DMEM, съдържаща нормална D-глюкоза (5,5 mM), допълнена с 10 процента FBS и 1 процент пеницилин-стрептомицин и държани при 37 градуса С и 5 процента CO2 атмосфера инкубатор (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). След достигане на 70-80 процента сливане, HepG2 клетките бяха субкултивирани. Четири часа преди експеримента, HepG2 клетките бяха успокоени в редуцирана серумна среда. След предварителна обработка с 5 ug/mL Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal или BAE в продължение на 24 часа, клетките бяха изложени на нормални (5,5 mM) или високи (30 mM) концентрации на глюкоза до имитират нормални и диабетни състояния. Клетките бяха подготвени за Western Blot анализ и супернатантите бяха събрани за ELISA анализ.

2.5. Животни и експериментален дизайн

C57BL/6J здрави мъжки мишки (20 ± 2 g) от GemPharmatech (Nanjing, Jiangsu, Китай) се държат в стандартни лабораторни условия, включително постоянна температура от 25 градуса и 12- h ден и нощ редуване. Подкомитетът за изследователска грижа и използване на животните към Академията на селскостопанските науки в Дзянсу е одобрил преди това всички експериментални процедури върху животни. Диета с високо съдържание на мазнини и стрептозотоцин (STZ) са използвани за индуциране на T2DM в животинските модели съгласно метода, използван от Islam and Loots [27]. Всички мишки бяха хранени с диета с високо съдържание на мазнини и захар, с изключение на контролната група, която консумираше нормална диета. След 4 седмици, мишките бяха гладни в продължение на 12 часа и инжектирани интраперитонеално със 100 mg/kg STZ, разтворен в буферен разтвор на натриев цитрат (рН 4.2-4.5). Една седмица след индуцирането на STZ бяха взети кръвни проби от опашната вена на мишките, които са гладували цяла нощ. Мишките, които показват диабетни симптоми, включително полиурия, полидипсия и хипергликемия (ниво на кръвната захар на гладно > 11,1 mmol/L), са разпознати като T2DM и използвани за бъдещи изследвания. За да се провери стабилността на модела на T2DM, всички мишки бяха хранени с нормална диета в продължение на една седмица. Нормалните мишки бяха използвани като контролна група. След това мишките с диабет бяха разделени на случаен принцип в три групи: модел, BAE с ниска доза (100 mg/kg) и BAE с висока доза (400 mg/kg). В продължение на 6 последователни дни, интрагастрално приложение на същия обем разтворител (100 μL), 100 mg/kg или 400 mg/kg BAE бяха дадени на контролната група, моделната група, ниската доза BAE и високата доза BAE съответно. На седмия ден се измерва телесното тегло и кръвната захар на гладно. Същото интрагастрално приложение продължава 5 седмици. След това мишките бяха гладни за една нощ и бяха събрани кръвни проби за приготвяне на серум от долната празна вена и съхранени при -20 градуса. След вземане на кръвни проби, всички мишки бяха анестезирани и умъртвени. Тъканите на черния дроб, далака, бъбреците и тимуса на мишките бяха отстранени, претеглени и съхранени при -80 градуса за по-нататъшни експерименти.

2.6. Откриване на жизнеспособността на клетките

Клетъчната жизнеспособност се определя по метода МТТ. Пет ug/mL Mv, Mv{{0}}glc, Mv-3-gal или BAE бяха използвани за предварителна обработка на клетки в продължение на 24 часа. След това клетките бяха третирани с 5 mM или 30 mM глюкоза за 24 часа и към клетките бяха добавени 10 μL 0,5 процента (5 mg/mL) МТТ, които след това бяха култивирани отново. След 4 часа разтворът на МТТ се отстранява и се добавят 100 μL диметилсулфоксид (DMSO), преди сместа да се разклати бавно в продължение на 10 минути, за да се разтвори клетъчният кристал. Абсорбцията при 490 nm беше измерена на четец на микроплаки StatFax-2100 (Awareness Tech-nology Inc., Plam, FL, USA), за да се получат стойностите на оптичната плътност (OD). Клетки, култивирани с нормални нива на глюкоза (5,5 mmol/L) бяха използвани като контролна група, докато ямки без клетки бяха използвани като празна проба. Следната формула беше използвана за определяне на клетъчната жизнеспособност: Клетъчна жизнеспособност (процент)=(пробна група OD стойност-празна група OD стойност)/(контролна група OD стойност-празна група OD стойност)x 100 процента.

2.7. ROS флуоресцентна визуализация

Реактивните кислородни видове (ROS) в HepG2 клетки бяха оценени с помощта на комплекта за откриване на DCFH-DA. След първоначално лечение с 5 ug/mL Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal или BAE за 24 часа, което по-късно беше последвано от лечение с 5 mM или 30 mM глюкоза за 24 часа, клетките бяха промити с PBS и след това 10 цМ DCFH-DA бяха добавени към всяка ямка и оставени да реагират за 20 минути при 37 градуса. Клетките отново бяха промити старателно с PBS и след това група от тези клетки беше незабавно наблюдавана под IX53 обърнат флуоресцентен микроскоп (Olympus, Токио, Япония) при 530 nm емисия и 485 nm филтри за възбуждане. Изображенията са представени с 200 × увеличение. След дисоциация се събира друга група клетки и тяхната флуоресценция се записва от многорежимен четец на микроплаки Synergy H4 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, САЩ). Беше отбелязан общият интензитет на флуоресценция на клетките във всяка ямка и генерирането на ROS беше измерено като пъти на контролата.

2.8. ELISA

Използвани са комплекти ELISA за количествено определяне на протеини, участващи в глюконеогенезата (FOXO1, G6Pase, p-GS), гликогенолизата (p-GSK3), транспортера на глюкоза (GLUT2), липогенезата (ACC и HMGCR) и липолизата (HSL) в супернатантите на HepG2 клетки. Количеството на GLUT2 в черния дроб на мишки също се определя. Комплектът за анализ на BCA протеин се използва за количествено определяне на общия клетъчен протеин на супернатантата. Абсорбцията при 450 nm беше измерена при 37 градуса на четец за микроплаки StatFax-2100 (Awareness Technology Inc., Plam, FL, USA), за да се определят протеиновите нива.

2.9. Western blotting анализ

Уестърн блотинг беше извършен върху HepG2 лизати, за да се измери нивото на протеин на AMPK, p-AMPK, глюконеогенеза (PGCl, PEPCK, гликогенолиза (GS, p-GS) и липолиза (ACC, p-ACC, SREBP{{4} }c) в клетките. Беше извършено също Western blotting за определяне на количествата AMPK, p-AMPK върху черния дроб на мишки, индуцирани от диабет. Или GAPDH, или -Actin беше използван като контрола на натоварване. LAS-3000 изображение система (Fuji, Токио, Япония) беше използвана за наблюдение на протеиновите ленти и тяхната плътност беше количествено определена с помощта на софтуера Bio Profile 1D plus plus (Vilbert Lour-mat, Marne La Vallee, Франция).Всички данни бяха изразени като кратна промяна на контролът.

2.10. Кръвна захар на гладно и тест за глюкозен толеранс

Кръвната захар на гладно се измерва веднъж седмично за период от 5 седмици след 12- h период на гладуване. За тест за глюкозен толеранс, мишките бяха гладни в продължение на 16 часа и бяха хранени с 2 g/kg 20 процента глюкоза （200 μL）интра-стомашно (ig), за да се определи кръвната глюкоза при 0 ,0.5,1,1.5 и 2h. Кръвта се събира от вената на опашката и нивата на глюкозата се измерват с помощта на глюкометър (Sinocare, Changsha, Китай). Нивото на глюкозата в урината на мишки, които са получили ig, също се измерва за период от пет седмици.

2.11. Оценка на серумните биохимични индекси и ензимната активност в черния дроб на мишки

Измерва се количеството инсулин, триглицеридите и общия холестерол в серума, докато ензимната активност на SOD и GSH-PX се оценява с помощта на търговски комплекти съгласно протокола на производителя. Абсорбцията при 500 nm за триглицеридите (TG) и общия холестерол (TCH) и 450 nm за останалите (инсулин, SOD и GSH-PX) беше измерена при 37 градуса на четец на микроплаки StatFax-2100 (Awareness Technology Inc., Плам, Флорида, САЩ).

2.12. Статистически анализ

Всички данни са представени като средна стойност ± стандартно отклонение (SD) от поне три независими експеримента. Цифрите са получени с помощта на GraphPad Prism версия 8 (GraphPad Software, Inc., Калифорния, САЩ). Бяха извършени еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA), t-тестове или тест за множество сравнения на Sidak, за да се определят статистическите разлики между различните групи. Разликите се считат за значителни при P<>

Тази статия е извлечена от https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.102100 Получено на 21 юли 2021 г.; Получено в преработен вид на 9 август 2021 г.; Приет на 11 август 2021 г