Хипотермия, предизвикана от окскарбазепин след преходна исхемия на предния мозък, упражнява терапевтична неврозащита чрез преходен рецепторен потенциал Ванилоиден тип 1 и 4 при гербили, част 3

4. Материали и методи

4.1. Експериментални животни

Използвани са мъжки джербили (общ брой=252) на възраст 6 месеца (телесно тегло 63–78 g). Песчанките са отгледани в Центъра за експериментални животни на Националния университет Кангуон (Чунчхон, Корея).

Гербилите са много сладки животинки. Те живеят в пустинни райони, умеят да копаят пещери и имат силни инстинкти за съхранение и намиране на храна. Сред тези малки момчета мъжките джербили имат особено добра памет, което кара хората да искат да знаят техните тайни.

Първо, когато мъжките джербили търсят храна, те използват поредица от сигнали като забележителности и терен, за да определят посоката. Чрез дългогодишно наблюдение и практика те са създали собствена „географска информационна система“. Обратно, женските гербили имат по-лоша памет за тези сигнали, особено в постоянно променяща се среда.

Второ, мъжките джербили също показват силна памет, когато се бият с естествени врагове. Според учените, когато гербилите са застрашени, те бързо ще влязат в дупката и ще се опитат да избягат. Но когато са изправени пред същата заплаха, мъжките гербили ще запомнят начина на атака на естествените врагове и ще ги избягват, увеличавайки шансовете си за оцеляване.

И накрая, паметта на мъжките джербили се крие и в тяхното социално поведение един към друг. Всеки гербил има своя уникална миризма. Когато срещнат други гербили, те ще използват обонянието си, за да идентифицират идентичността и статуса на другия. Тази способност за памет не само позволява на гербилите да установят относително стабилна социална връзка, но също така е важна гаранция за тяхното възпроизводство.

В обобщение, връзката между мъжките джербили и паметта е неразделна. В процеса на търсене на оцеляване и размножаване в природата, те разчитат на силната си памет, за да се адаптират постоянно към околната среда и да се самоусъвършенстват. Като хора трябва да се учим от тези малки момчета и постоянно да усъвършенстваме паметта си, за да се адаптираме по-добре към този постоянно променящ се свят. Вижда се, че трябва да подобрим паметта си и Cistanche може значително да подобри паметта, защото може също да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивата на ацетилхолин и растежни фактори, които са много важни за паметта и ученето. В допълнение, Cistanche може също така да подобри притока на кръв и да насърчи доставянето на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно храна и енергия, като по този начин подобрява жизнеността и издръжливостта на мозъка.

Щракнете върху Know, за да увеличите мощността на паметта

За това проучване експерименталният протокол беше одобрен (одобрение № KW-200113-1; дата на одобрение, 18 февруари 2020 г.) от Институционалния комитет за грижа и използване на животните.

Изследователският протокол се придържаше към насоките, предложени в „Текущи международни закони и политики“ на Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, публикувано от The National Academies Press (8-мо издание, 2011 г.).

4.2. Експериментални групи, индукция на tFI и лечение с HyT и OXC

За да се докажат защитните ефекти на OXC срещу исхемично увреждане след tFI при гербили, гербилите бяха разделени на шест групи: (1) фалшива група + носител (n=24); (2) tFI + група носител (n {{5) }}); (3) фалшива+HyT група (n=24); (4) tFI+HyT група (n=60); (5) фалшиво+OXC (200 mg/kg) група (n=24); и (6) tFI+OXC група (n=60).

Седем и пет джербила в трите tFI групи бяха използвани за Western blot анализ и хистологично изследване, съответно на 30 минути, 12 часа, 1 ден, 2 дни и 4 дни след tFI операцията, а в трите фиктивни групи, седем и пет гербили бяха използвани 30 минути и 4 дни след фиктивната операция за минимизиране на броя. В този експеримент tFI беше разработен, както е описано по-горе [34].

Накратко, гербилите бяха анестезирани с 2,5% изофлуран (в 32% кислород и 68% азотен оксид). Под анестезия двете общи каротидни артерии бяха изолирани от каротидната обвивка и запушени с клипси за аневризма (Yasargil FE 723K) (Aesculap, Tuttlingen, Германия ) за пет минути.

Перфектното спиране на кръвоснабдяването на мозъка беше потвърдено чрез наблюдение на артериалния кръвен поток в двете артерии на ретината (клонове на вътрешни каротидни артерии) с помощта на офталмоскоп (HEINE K180®) от Heine Optotechnik (Herrsching, Германия).

Телесната температура преди и по време на операцията във всички групи беше контролирана при нормотермия (37 ± 0.2 ◦C) с помощта на термометрично одеяло. След пет минути оклузия клипсите бяха отстранени.

В това проучване е извършена фиктивна операция, като са били подложени на същата tFI хирургия без оклузия на общите каротидни артерии. HyT в двете фиктивни+HyT и tFI+HyT групи е контролиран (подобно на промяната в телесната температура при tFI+ OXC група) чрез охлаждане на цялото тяло с лед за шест часа.

Телесната температура на двете фалшиви+OXC и tFI+OXC групи беше записана за шест часа след незабавно интраперитонеално инжектиране на 200 mg/kg OXC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) след tFI операцията.

Дозировката на OXC е избрана въз основа на предишно проучване, съобщаващо, че 200 mg/kg OXC ефективно защитава срещу клетъчна смърт в мозъка след [36]. За да се регистрира промяната на телесната температура, телесната температура се измерва в ректума всеки час след tFI, в продължение на период от 6 часа при стайна температура на околната среда (около 22 ◦C).

Песчанките получиха време за възстановяване от четири дни след tFI, тъй като пирамидалните клетки, разположени в областта CA1 на хипокампа, започват да умират четири дни след tFI [30,34,62].

4.3. SMA тест

Тестът SMA беше проведен, за да се изследват промените в хиперактивността във всички групи. Накратко, както е описано по-рано [63], SMA тестът е направен на Ден 1 след tFI, тъй като локомоторната активност достига най-високата точка на Ден 1 след исхемично увреждане след tFI.

Гербилите от всички групи получиха адаптация към околната среда за два часа и бяха поставени в открита полева клетка (ширина 44 cm; дължина 44 cm; височина 30), получена от Ugo Basile SRL (Gemonio, Италия), в която две успоредни хоризонтални бяха инсталирани инфрачервени лъчи 4 × 8 от пода за един час. SMA беше записан с помощта на Photobeam Activity System-Home Cage от San Diego Instruments (Сан Диего, Калифорния, САЩ).

Движението (траектория и общо изминато разстояние) беше открито чрез прекъсване на масива от инфрачервени лъчи, произведени от фотоклетки.

SMA се наблюдава непрекъснато в продължение на един час и данните се събират с помощта на AMB анализатор от IPC Electronics (Cumbria, UK).

Събирането на данни беше инициирано 15 минути след привикване в клетката на открито. Накрая, получените резултати бяха оценени като разстоянието (в метри) на движение в периода на теста (един час).

4.4. Тестове на когнитивните функции

4.4.1. RAMT

За да се сравни пространствената памет във всички групи, RAMT беше извършено според предишни проучвания [38,44]. За този тест беше използван радиален 8-раменен лабиринт от Stoelting Co (Wood Dale, IL, USA).

Лабиринтният инструмент се състоеше от централна платформа и осем рамена (широчина на всяко рамо 5 cm; височина 9 cm; дължина 35 cm). Джербилите са били обучавани веднъж на ден в продължение на три дни преди.

А именно, пелетна храна, получена от DBL Co (Chungbuk, Корея), беше поставена в крайната част на всяко рамо и всеки гербил беше поставен върху централната платформа. След това гербилът потърси храната.

След фиктивната или tFI операция, истинският тест се провежда веднъж на ден в продължение на четири дни, започвайки един ден след операцията.

За анализа беше оценен броят на грешките, като една грешка се появяваше всеки път, когато песчанката влезе в ръка, която вече е била посетена преди. Тестът приключи, когато песчанката изяде храната.

4.4.2. PAT

За да се сравни краткосрочната памет между групите, PAT беше проведено съгласно докладвани по-рано методи [64,65] с някои модификации. Накратко, гербилите бяха тествани с помощта на системата за избягване на Gemini (GEM 392) от San Diego Instruments (SanDiego, CA, USA), която се състои от две (тъмни и светли) отделения, които комуникират помежду си чрез вертикално плъзгаща се врата.

Експерименталните сесии бяха проведени в две фази: тренировъчна сесия и истинска тестова сесия, извършена един ден преди и четири дни след tFI или фиктивната операция.

Истинският тест беше извършен 20 минути след тренировъчната сесия чрез измерване на латентното време (секунди) по време на престоя в тъмната стая. А именно, в тренировъчната сесия на песчанката беше позволено да изследва двете отделения свободно за една минута, докато портата беше отворена .

След това, когато песчанката влезе в тъмното отделение, вратата беше затворена и гербилът беше подложен на електрически удар (0,5 mA) от стоманена решетка на пода за пет секунди.

В реалната тестова сесия, на ден 4 след tFI, гербилът беше поставен в светлото отделение и времето на латентност в светлото отделение преди влизане в тъмното отделение беше записано.

4.5. Уестърн блот анализ за TRPV1 и TRPV4

За да се изследват нивата на експресия на TRPV1 и TRPV4 в хипокампалния CA1 на гербил, техниката Western blot беше извършена съгласно описаните по-рано методи [66,67].

Накратко, съгласно определения график (30 минути, 12 часа, 1 ден, 2 дни и 4 дни след фиктивна или tFI операция), на джербилите (n=5 за всяка група) е дадена анестезия за евтаназия чрез интраперитонеална инжекция с 200 mg/kg пентобарбитал натрий (JW Pharm.Co., Ltd., Сеул, Корея).

След това мозъците им бяха събрани и хомогенизирани с 50 mM буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS, pH 7,4), съдържащ 0.1 mM етилен гликол-бис (аминоетил етер)-N, N, N{{ 11}}, N0-тетраоцетна киселина (EGTA) (pH 8.0), 10 mM етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA) (pH 8.0), 0.2% Nonidet P{{17 }}, 15 mM натриев пирофосфат, 100 mM -глицерофосфат, 2 mM натриев ортованадат, 50 mM NaF, 150 mM NaCl, 1 mM фенилметилсулфонил флуорид (PMSF) и 1 mM дитиотреитол (DTT).

След това пробите бяха центрофугирани и супернатантите бяха взети, за да се определят протеиновите нива, като се използва комплект за анализ на Micro BCA от Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) с говежди серум албумин от Pierce Chemical Co (Rockford, IL, USA).

Аликвотни части, включващи 20 µg общ протеин, се варят в зареждащ буфер, 150 mM Tris (рН 6,8), съдържащ 6% натриев додецил сулфат (SDS), 3 mM DTT, 0,3% бромофенол синьо и 30% глицерол.

Пробите се разделят чрез електрофореза с 10% SDS-полиакриламиден гел (PAGE). След това геловете се прехвърлят в нитроцелулозни мембрани от Pall Co (East Hills, NY, USA) при 350 mA и 4 ° C за 90 минути.

За да се блокира неспецифичното оцветяване, мембраните се инкубират в 5% обезмаслено мляко за 60 минути при стайна температура. След това те са реагирали имунно с всяко първично антитяло: заешко анти-TRPV1 (разредено 1:1000) (Abcam, Кеймбридж, Обединеното кралство), заешко анти-TRPV4 (разредено 1:1000) (Abcam) и заешко анти- - актин (разреден 1:2000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) при 4 ◦C за 7 h.

Впоследствие те реагираха с магарешки анти-заешки IgG, конюгирани с пероксидаза от хрян (HRP) (разреден 1: 4500) (Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния, САЩ) при стайна температура за 1 час.

И накрая, хемилуминесцентен комплект на базата на алуминол от Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, САЩ) беше използван за подобряване на визуализацията.

Както е описано по-рано [68], имуноблотите на TRPV1 и TRPV4 бяха анализирани с помощта на софтуера Scion Image от Scion Crop (Frederick, MD, USA). Лентите бяха сканирани и беше извършен денситометричен анализ. Нивата на протеин се нормализират спрямо съответното ниво на -актин.

4.6. Изготвяне на хистологични срезове

За имунохистохимични и хистопатологични изследвания, гербили (n=7 за всяка група) бяха умъртвени съгласно определения график (30 минути, 12 часа, 1 ден, 2 дни и 4 дни след tFI или фиктивна операция).

Както беше описано по-рано [34], гербилите бяха дълбоко анестезирани с пентобарбитал натрий (200 mg/kg) (JW Pharmaceutical, Сеул, Корея). Под анестезия, гербилите се промиват транскардиално с 0.1 М фосфатен буфер физиологичен разтвор (рН 7.4) и се фиксират с 4% параформалдехид (в 0.1 М фосфатен буфер, рН 7.4).

Впоследствие мозъците им бяха получени и постфиксирани с помощта на същия фиксатор за шест часа. След това мозъчните тъкани бяха нарязани (25 µm дебелина на короналните равнини) в акриостат (Leica, Wetzlar, Германия).

4.7. Хистохимично оцветяване с помощта на CV

За да се изследва морфологичното и невронно увреждане в хипокампуса на всяка група, беше извършено оцветяване с крезил виолет (CV), както описахме по-рано [69]. Накратко, крезил виолетов ацетат (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) се разтваря при 1.0% (w/v) в дестилирана вода и ледена оцетна киселина (0).28 %) се добавя към този разтвор. Секциите бяха оцветени и монтирани с канадски балсам (Канто, Токио, Япония).

4.8. FJ B оцветяване

Извършено е FJ B оцветяване, за да се изследва невронална дегенерация (смърт или загуба). Съгласно публикуваната процедура [34], подготвените мозъчни срезове се накисват в 1% натриев хидроксид, незабавно се прехвърлят в 0.06% калиев перманганат и незабавно реагират с 0,0004% флуоро-нефрит B (Histochem , Джеферсън, Арканзас, САЩ).

Срезовете бяха измити за кратко и поставени върху предметно стъкло (около 50 ◦C) за реакция с FJ B. За да се оцени терапевтичният ефект на OXC срещу tFI, броят на FJ B+ клетките беше преброен в областта CA1 съгласно метод, публикуван в [ 70].

Накратко, цифрови изображения на FJ B + клетки бяха заснети от пет секции на гербил с помощта на епифлуоресцентен микроскоп (Carl Zeiss) (Oberkochen, Германия) при 450–490 nm дължина на вълната. Клетките се преброяват в 250 µm2, което включва SP, в центъра на CA1 региона, като се използва система за анализ на изображение (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Scottsdale, AZ, USA).

4.9. Имунохистохимия

За да се изследват промените в имунореактивността на NeuN, TRPV1 и TRPV4 в областта CA1, беше извършена обща имунохистохимия. Накратко, съгласно публикуван метод [34], подготвените мозъчни срезове се инкубират с първични антитела - миши анти-NeuN (разредени, 1:1100) (Chemicon, Temecula, Калифорния, САЩ), миши анти-TRPV1 (разредени, 1:500) (Abcam, Cambridge, UK) и заешки анти-TRPV4 (разреден, 1:500) (Abcam, Cambridge, UK).

След това тези инкубирани срезове се инкубират в съответните вторични антитела (разредени, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Бърлингейм, Калифорния, САЩ) и се развиват с използване на Vectastain ABC (разреден, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Бърлингейм, Калифорния , САЩ). Накрая, тези имунореагирали срезове имат цвят след визуализация с 3,3'-диаминобензидин.

Броят на NeuN+ клетките се преброява както следва. Цифрови изображения на NeuN + клетки бяха заснети от пет секции на гербил с помощта на светлинен микроскоп (AxioM1) (Carl Zeiss, Германия).

Клетките се преброяват по същия начин като FJ B+броя на клетките. За да се оцени плътността на структурите TRPV1+ и TRPV4+, съответните зони в региона CA1 бяха използвани в пет секции на животно. Изображенията на структурите TRPV1+ и TRPV4+са заснети с помощта на светлинен микроскоп AxioM1 (Carl Zeiss) (Германия).

Плътностите на структурите TRPV{{0}} и TRPV4+ бяха оценени като относителна оптична плътност (ROD). За тази цел изображенията бяха трансформирани до средното ниво на сивото. ROD беше представен като процент с помощта на Adobe Photoshop (версия 8.0) и софтуера NIH Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.10. Статистически анализ

Представихме данните като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на GraphPad Prism (версия 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, Калифорния, САЩ). Разликите в средните стойности между експерименталните групи бяха статистически анализирани чрез двупосочен анализ на дисперсията (ANOVA) с тест за множествено сравнение на post hocBonferroni, за да се изяснят свързаните с tFI разлики между всички групи. Статистическата значимост беше разгледана при p < 0. 05.

Авторски принос: Концептуализация: M.-HW и T.-KL; Методология, J.-CL и DWK; Софтуер, H.-IK и MCS; Валидиране, JHA, IJK и JHP; Разследване, J.-CL, H.-IK и M.CS; Data Curation, JHC, IJK и JHP; Писане - Подготовка на оригинална чернова, H.-IK и J.-CL; Писане-преглед и редактиране, M.-HW; Надзор, S.-SL; Администриране на проекти, M.-HW; Funding Acquisition, S.-SL и T.-KL Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities forResearch (FOUR, 4220200913807), финансиран от Националната изследователска фондация (NRF) на Корея и от Програмата за основни научни изследвания чрез Националната изследователска фондация на Корея (NRF) финансиран от Министерството на образованието (NRF-2020R1I1A1A01070897).

Декларация на институционалния съвет за преглед: Джербилите са отгледани в Центъра за експериментални животни на Националния университет Кангуон (Чунчон, Корея). За това проучване експерименталният протокол беше одобрен (номер на одобрение, KW-200113-1; дата на одобрение, 18 февруари 2020 г.) от Институционалния комитет за грижа и използване на животните.

Изследователският протокол се придържаше към насоките, предложени в „Текущи международни закони и политики“ на Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, публикувано от The National Academies Press (8-мо издание, 2011 г.).

Изявление за информирано съгласие: Не е приложимо.

Изявление за наличност на данни: Данните, представени в това проучване, са достъпни при поискване от съответния автор.

Благодарности: Авторите оценяват Hyun Sook Kim и Seung Uk Lee за тяхната техническа помощ в това проучване.

Конфликти на интереси: Авторите са декларирали, че няма финансов конфликт на интереси.

Съкращения

CA1: подполе Cornu Ammonis 1; ЦНС, централна нервна система; CV, крезил виолет; DG, зъбна извивка; FJ B, флуоро-нефрит B; HyT, хипотермия; NeuN, невронни ядра; OXC, окскарбазепин; PAT, тест за пасивно избягване; ROD, относителна оптична плътност; SMA, спонтанна двигателна активност; SO, stratum oriens; SP, стратум пирамидален; SR, stratum radiatum; tFI, преходна исхемия на предния мозък; TRPV1, преходен рецепторен потенциален ванилоид тип 1.

Референции

1. Бусто, Р.; Дитрих, WD; Глобус, МЯ; Валдес, И.; Шайнберг, П.; Ginsberg, MD Малки разлики в интраисхемичната мозъчна температура критично определят степента на исхемично невронно увреждане. J. Cereb. Метаб на кръвния поток. 1987, 7, 729–738. [CrossRef][PubMed]

2. Махер, Дж.; Hachinski, V. Хипотермия като потенциално лечение на церебрална исхемия. Cerebrovasc. Мозъчен метаб. Rev. 1993, 5,277–300.

3. Медицинска сестра, С.; Corbett, D. Невропротекция след няколко дни на лека хипотермия, предизвикана от лекарства. J. Cereb. Метаб на кръвния поток. 1996, 16,474-480. [CrossRef]

4. Фишър, М.; Feuerstein, G.; Howells, DW; Hurn, PD; Кент, ТА; Savitz, SI; Lo, EH; Group, S. Актуализация на предклиничните препоръки на академичната индустрия за терапия на инсулт. Удар 2009, 40, 2244–2250. [CrossRef]

5. Лиу, Л.; Yenari, MA Терапевтична хипотермия: Невропротективни механизми. Отпред. Biosci. 2007, 12, 816–825. [CrossRef]

6. Lyden, PD; Krieger, D.; Йенари, М.; Dietrich, WD Терапевтична хипотермия за остър инсулт. Вътр. J. Stroke 2006, 1, 9–19. [CrossRef][PubMed]

7. Klassman, L. Терапевтична хипотермия при остър инсулт. J. Neurosci. Nurs. 2011, 43, 94–103. [CrossRef]

8. Гройсман, Л.И.; Емануел, бакалавър; Ким-Тенсер, Масачузетс; Sung, GY; Mack, WJ Терапевтична хипотермия при остър исхемичен инсулт. Neurosurg. Фокус 2011, 30, E17. [CrossRef] [PubMed]

9. Шваб, С.; Георгиадис, Д.; Berrouschot, J.; Schellinger, PD; Graffagnino, C.; Mayer, SA Осъществимост и безопасност на умерена хипотермия след масивен хемисферичен инфаркт. Удар 2001, 32, 2033–2035. [CrossRef]

10. Кац, LM; Йънг, AS; Франк, JE; Wang, Y.; Park, K. Регулираната хипотермия намалява мозъчния оксидативен стрес след хипоксична исхемия. Brain Res. 2004, 1017, 85–91. [CrossRef]

11. Лю, К.; Хан, Х.; Geng, X.; Джан, Дж.; Ding, Y. Фармакологична хипотермия: потенциал за бъдеща терапия на инсулт? неврол. Res.2016, 38, 478–490. [CrossRef]

12. Ма, Дж.; Wang, Y.; Wang, Z.; Li, H.; Wang, Z.; Chen, G. Невропротективни ефекти на лекарствено-индуцирана терапевтична хипотермия при заболявания на централната нервна система. Curr. Drug Targets 2017, 18, 1392–1398. [CrossRef]

13. Калабрези, П.; Cupini, LM; Centonze, D.; Pisani, F.; Bernardi, G. Антиепилептичните лекарства като възможна невропротективна стратегия при мозъчна исхемия. Ан. неврол. 2003, 53, 693–702. [CrossRef]

14. Танака, Т.; Litofsky, NS Антиепилептични лекарства при педиатрична травматична мозъчна травма. Експерт преп. Neurother. 2016, 16, 1229–1234 [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com