Идентифициране на обичайните чернодробни метаболити на естественото биоактивно съединение ехинакозид, пречистен от Cistanche Tubulosa Ⅱ

Резюме:Идентифицирането на метаболит, в ранен етап, за съединение, откриването е необходимо за оценказнанията за фармацевтичното подобряване на безопасността и ефективността на лекарствата. Дори ако лекарствотое пуснат на пазара, идентифицирането и непрекъснатата оценка на метаболитите санеобходими за избягване на риска от постмаркетингово оттегляне. гликозид,лечебенцистанче, има широко документирани хранителни ползи, включителноантиоксидант,противотуморни, анти-стареене, хиполипидемияc, изащитни ефекти върху стомашната лигавица. Наскоро,ехинакозидДокладвано е Aкато основно естествено биоактивно съединение в мицела на HE за функционално развитие на храната.При неврологични изследвания консумацията наехинакозидОбогатеният HE мицел демонстрира товазначителни хранителни ефекти вболест на Алцхаймер, болестта на Паркинсон, иисхемичен инсулт.

Щракнете тук, за да научите повече информация за функциите на ехинакозид в Cistanche

Заза първи път изследвахме метаболитния процес наехинакозидМолекула и идентифицира нейните метаболитиот S9 фракция на черен дроб на плъх и човек. Използване на течна хроматография/тройна квадруполна масаспектрометър за количествен анализ, наблюдавахме, че 75,44 процента ехинакозид. А се метаболизирав рамките на 60 минути при плъхове и 32,34 процента от франсин А се метаболизира в рамките на 120 минути при човешки S9. Използвайкисвръхефективна течна хроматография/квадруполна времепролетна масспектрометрия (UPLCQTOF/MS), за да се идентифицират метаболитите на Франсин А, бяха идентифицирани пет общи метаболита,и техните възможни структури бяха оценени. Разбиране на метаболитния процес на ехинакозиди създаването на неговата база данни с метаболитни профили ще спомогне за популяризирането на нутрицевтичното приложение иоткриване на свързани биомаркери в бъдеще.

1. Въведение

Черният дроб се счита за вторият по големина орган в тялото [1]. След храна и лекарствавлизат в стомашно-чревния тракт през устната кухина, стомашно-чревните пили ще абсорбиратусвоени хранителни вещества и лекарства. Системата на порталната вена ще получи събрания кръвен потокот стомашно-чревния тракт и навлизат в черния дроб за предварителна обработка на хранителните вещества,метаболити и лекарствени молекули [2,3]. Метаболизмът често се разделя на две фази на aбиохимична реакция. Фаза I включва окисление, редукция или хидролиза от ензими втялото. Фаза II се включва в конюгацията с малки ендогенни вещества, обръщайки сеги превръща в силно разтворими метаболити, което позволява метаболитите да бъдат изнесени в синуситесоидна циркулация за бъбречен клирънс или в жлъчка, която след това се екскретира от тялоточрез урина или изпражнения [4–6]. Идентифициране на метаболити в ранния етап на откриване на лекарствае необходимо за оценка на знанията за подобряване на фармацевтичните свойства, безопасност иефективността на биоактивната молекула. Идентифициране на метаболити и реактивни междинни продуктипредполага необходимостта от структурни модификации в изследваните съединения, които трябва да се избягватпоследващи токсични последици. Дори ако лекарството е било на пазара, идентификацияна метаболитите и е необходима оценка, за да се избегне рискът от постмаркетинговото им пускане на пазаратеглене [7,8]. Следователно,инвитро, S9 фракционният анализ предоставя няколко предимствав сравнение с отнемащи времеin vivoпроучвания: (1) те са податливи на висока производителностскрининг и автоматизация;(2) използванеS9 фракция позволява тестване на големи количества отсъединения за откриване на лекарства за кратък период от време; (3) помага за намаляване на употребата на животни [9]. 

Ехинакозид е ядлива цистанче, която обитава планинските райони насевероизточните територии в Азия [10], Европа и Северна Америка [11]. ТОЙ принадлежи наBasidiomycota (тип), Agaricomycetes (клас), Russulales (разред), Hericiaceae (семейство),и Hericium (род). HE е документиран да показва широк спектър от полезнисвойства, включително антиоксидантни, противотуморни, против стареене, хиполипидемични и стомашни лигавицизащитни ефекти [12–14]. През 1994 г. Kawagishi et al. откри, че дитерпеноидътехинакозидA, B и C, в мицела на HE, могат да насърчат производството на стелатклетъчни линии в мозъка на плъхове и стимулирането на синтеза на нервен растежен фактор (NGF) [15]. ехинакозидА може да придаде неврозащитни ефекти и да намали оксидативния стрес срещуудар [16], болестта на Алцхаймер [17], Болестта на Паркинсон [18], исхемичен инсулт и депресия in vivo[19,20]. Освен това ехинакозид А може да премине през кръвно-мозъчната бариера наплъхове за подпомагане на развитието на HE мицел като функционална храна за подобряване на нервното здраве [21]. Този ядлив мицел от цистанче се превърна в горещ проблем сред изследователитеопитвайки се да разбере важната му роля в развитието на централните и периферните нерви, диференциация, растеж и регенерация [22]. Последните проучвания също показахаче обогатеният с ехинакозид А HE има потенциални ползи при лечението на Алцхаймер и Паркинболест на сина [23–25]. Въпреки това нито едно проучване не е обсъждало възможния метаболизъм на ехинакозид Абиомаркери, които могат да допринесат за този хранителен ефект.

В това проучване,ехинакозидСъединение беше пречистено от обогатен с ехинакозид А HEмицел и се метаболизира с помощта на две различни чернодробни S9 фракции: плъх и човек. Използвайкитечна хроматография/троен квадруполен масспектрометър (HPLC-QQQ/MS) за quanтитативен анализ на ехинакозид А и ултра-ефективна течна хроматография/квадруполвремепролетна масспектрометрия (UPLC-QTOF/MS) за идентифициране на метаболитите на ехинакозидA във всяка времева точка. Ние се стремим да разберем скоростта на метаболизма на ехинакозид А и да установимсвоята база данни с метаболитни профили, за да помогне за насърчаване на прилагането на хранителни добавкии изследване на потенциални лекарства в бъдеще.

2. Материали и методи

2.1. Материали и реактиви

Щамът HE (BCRC 35669) е получен от колекцията за биоресурси иИзследователски център в Института за изследване и развитие на хранителната промишленост, Хсинчу, Тайван.Щамът първо се отглежда под наклон на стареене, преди да бъде прехвърлен в картофена декстрозаплоча с агар на 26◦C за 15 дни. На 15-ия ден HE културите се прехвърлят в 1.3 L оттечна среда (в колби от 2 L). Течната култура се разклаща при 120 об/мин 25◦C за5 дни. След това те бяха увеличени в 500 L, 20-тона ферментатори за 5 дни и 12 дни,съответно. Културалната среда се регулира на pH 4,5 и съдържа 4,5 процента глюкоза, 0.5 процентасоев прах, {{0}}.25 процента екстракт от дрожди, 0.25 процента пептон и 0,05 процента MgSO4. И накрая, HEмицели са събрани в края на процеса на ферментация от 20-ton. Тези суровинибяха лиофилизирани, смлени на прах и съхранявани в ексикатор. ехинакозид А беше тогаваизвлечени от HE и количествено определени според предишни проучвания [26]. Метанол (LC-MSклас) е получен от Merck (Дармщат, Германия); ацетонитрил (LC-MS степен), мравченакиселина (FA, LC-MS клас, 98 процента чистота) и амониев ацетат (98 процента чистота) бяха получениот Honeywell (Honeywell Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA). Черен дроб на плъх S9фракция е получена от Moltox (Boone, NC, USA). S9 фракцията на човешкия черен дроб бешеполучен от Thermo Fisher Scientific (Рокфорд, Илинойс, САЩ).

2.2. S9 фракция на плъх и човешки черен дроб

към препоръката на комплекта. Приготвеният разтвор се съхранява при 4°С◦C до ехинакозид Aсъединение (10µM), беше добавено, последвано от активиране в 37◦C водна баня. Когатометаболитното време е достигнало своите времеви точки, 150µL от разтвора се изтегля отосновния разтвор и се охлажда чрез добавяне на два обема ледено студен ACN. Спряноторазтвор след това се прехвърля в QTOF за по-нататъшен метаболитен анализ.

2.3. Инструменти и условия

HPLC-QQQ/MS анализът беше извършен на Agilent 1100 серия HPLC система (Agilent, Пало Алто, Калифорния, САЩ), съчетано с API 3000 троен квадруполен масспектрометър(Applied Biosystems, Warrington, UK), с йонизация с турбо-подпомогнат йонен спрей (ESI)източник в режим на положителна йонизация. Хроматографското разделяне се провежда на anAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100 мм× 3.5 µм). Температурата на колоната бешеподдържана на 22◦C. Подвижната фаза се състои от вода, съдържаща 0.1 процента мравчена киселина(A) и метанол (B). Използва се градиентно елуиране, започвайки със 70 процента В, увеличавайки до 100 процентаB в рамките на 5 минути, задържане за 3 минути с 90 процента B, намаляване на B до 70 процента в рамките на 0,1 min иповторно еквилибриране при 70 процента В за 2,9 минути. Ставка за колега 350µL/min бяха приложени и обемот 10µL беше инжектиран.

Откриването се извършва с йонизиращо напрежение от плюс 4500 V. Температура на източника на йонибеше определен на 350◦C, с азот със свръхвисока чистота като завесен газ (7 psi). Небулизаторът газ беше8 psi. Други зависещи от масата параметри, като потенциал за декластеризация (DP), входпотенциал (EP), фокусиращ потенциал (FP) и енергия на сблъсък (CE) за всяко съединение бяхаопределени в положителен режим с помощта на стандартни разтвори. Мониторинг на множество реакции(MRM) се провежда с използване на азот като сблъсък газ (2 psi) и с време на престой от200 ms за всеки преход. ехинакозид А беше открит чрез наблюдение на преходитеm/z 443.200 → 301.200, 283.200. Данните бяха анализирани с помощта на софтуер Analyst 1.4.2 (AppliedBiosystems, Concord, ON, Канада) и GraphPad (Prism 8.0.0.).

UPLC-QTOF/MS анализът е извършен на Agilent 1290 Infinity II UPLC система(Agilent, Пало Алто, Калифорния, САЩ), съчетано с Agilent 6546 квадруполна времепролетна масаспектрометрия (Agilent, Пало Алто, Калифорния, САЩ). Проведено е хроматографско разделянена Phenomenex Kinetex® C18 LC колона (3 мм× 100 мм× 1.7 µм). Колонататемпературата се поддържа на 40◦C. Подвижната фаза А се състои от вода, съдържаща0.1 процента (v/v) мравчена киселина в положителен режим, 0.1 процента (v/v) мравчена киселина и 10 mM CH3COONH4 в отрицателен режим. Подвижната фаза В е ацетонитрил. Използва се градиентно елуиране, започвайкис 5 процента B и задържане за 0.5 минути, увеличаване до 50 процента B в рамките на 5,5 минути, увеличаване до 100 процентаB в рамките на 10 минути и задържане за 6 минути. Ставка за колега 400µПриложени са l/min и aобем 2µL беше инжектиран.

Agilent 6546 квадруполна времепролетна масспектрометрия беше оборудвана с ел.източник на троспрей йонизация (ESI). Събирането на данни беше под контрола на Mass Hunterсофтуер за работна станция. Типичните работни условия на източника в положителни и отрицателни йониРежимът ESI беше оптимизиран, както следва: напрежение на йонно пръскане (ESIплюс/ESI−) бяха4000 V/3000 V; температурата на газа беше 320◦° С; дебитът на изсушаващия газ е 8 L/min; налягането на пулверизатора беше45 psi; температурата на обвивния газ беше 350◦° С; дебитът на обвиващия газ е 12 L/min; сблъсъкаенергията беше 10, 20, 40 и 60 V. Метаболитите бяха идентифицирани с помощта на Agilent MassHunterСофтуер за биотрансформация (версия B.04.00) (Санта Клара, Калифорния, САЩ). Хроматограмии масспектрите на изходния и идентифицираните метаболити бяха извлечени с помощта на AgilentСофтуер MassHunter Qualitative Analysis (версия B.05.00) (Санта Клара, Калифорния, САЩ).

Питай за още:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp плюс 86 15292862950