Идентифициране на липокалин, свързан с неутрофилна желатиназа, като нов ранен уринарен биомаркер за исхемично бъбречно увреждане

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

ДЖАЯ МИШРА,* ЦИНГ МА,* АНЕ ПРАДА,* МАРК МИЦНЕФЕС,* КАМЯР ЗАХЕДИ,* ДЖУН ЯН,† ДЖОНАТАН БАРАШ,† и ПРАСАД ДЕВАРАДЖАН*

*Нефрология и хипертония, Медицински център на Детската болница в Синсинати, Синсинати, Охайо; и † Нефрология, Колеж по лекари и хирурзи, Колумбийски университет, Ню Йорк, Ню Йорк

Резюме.

остърбъбречнанедостатъчност (ARF), вторична на исхемично увреждане, остава често срещан и потенциално опустошителен проблем. Използвана е стратегия за разпит на транскриптом за идентифициране на бъбречни гени, които се индуцират много рано след бъбречна исхемия, чиито протеинови продукти могат да служат като нови биомаркери за ARF. Бяха идентифицирани седем гена, които са регулирани нагоре плюс - 10-кратно, един от които (Cyr61) наскоро беше съобщено, че е индуциран след бъбречна исхемия. Неочаквано, индукцията на другите шест транскрипта беше нова за полето на ARF. В това проучване един от тези неразпознати досега гени беше допълнително характеризиран, а именно липокалин, свързан с неутрофилна желатиназа (NGAL), тъй като това е малък секретиран полипептид, който е устойчив на протеаза и следователно може лесно да бъде открит в урината. Изразената регулация на нивата на NGAL иРНК и протеини в ранната постисхемична мишкабъбрекбеше потвърдено. Експресията на NGAL протеин се открива предимно в пролифериращи клетъчни ядрени антиген-положителни проксимални тубулни клетки, в точково цитоплазмено разпределение, което се локализира съвместно с маркери на късни ендозоми. NGAL лесно се открива в урината при първото отделяне на урина след исхемия както при миши, така и при плъхови модели на ARF. Появата на NGAL в урината е свързана с дозата и продължителността набъбречнаисхемия и предшества появата на други уринни маркери като N-ацетил- -D-глюкозаминидаза и 2-микроглобулин. Произходът на NGAL от тубулни клетки беше потвърден в култивирани човешки проксимални тубулни клетки, подложени на in vitro исхемично увреждане, където NGAL иРНК беше бързо индуцирана в клетките и NGAL протеинът беше лесно откриваем в културалната среда в рамките на 1 час от леко изчерпване на АТФ. NGAL също така лесно се открива в урината на мишки с индуцирана от цисплатин нефротоксичност, отново преди появата на N-ацетил- -D-глюкозаминидаза и 2-микроглобулин. Резултатите показват, че NGAL може да представлява ранен, чувствителен, неинвазивен уринарен биомаркер за исхемична и нефротоксичнабъбречнанараняване.

Cistanche herbaможе да лекува бъбречно увреждане

Получете повече информация за свързаните с Cistanche продукти

остърбъбречнапровал(ARF), вследствие на исхемично или нефротоксично увреждане, остава често срещан и потенциално опустошителен проблем в клиничната нефрология, с постоянно висок процент на смъртност въпреки значителния напредък в поддържащите грижи (1-4). Пионерски проучвания в продължение на няколко десетилетия осветляват ролята на персистиращата вазоконстрикция, тубулната обструкция, клетъчните структурни и метаболитни промени и възпалителния отговор в патогенезата на ARF (4–7). Въпреки че тези проучвания са проправили пътя за успешни терапевтични подходи при животински модели, транслационните изследователски усилия при хора са дали разочароващи резултати (2-4). Причините за това може да включват многостранния отговор на бъбреците към исхемия и нефротоксини и недостиг на ранни маркери за ARF с последващо забавяне в започването на терапия (4-8).

Опитите да се разгадае молекулярната основа на тези безброй ранибъбречнаотговорите са улеснени от последните постижения във функционалната геномика, които дадоха нови инструменти за анализ на генома на сложни биологични процеси като исхемична ARF (8-11). Методите на cDNA microarray предоставят паралелни и количествени профили на експресия на хиляди гени, които, когато се комбинират с инструменти за биоинформатика, могат да идентифицират гени в биологичен път, да характеризират функцията на нови гени и да открият подкласове на болести (9). Използвайки тази техника за скрининг, ние идентифицирахме подгрупа от седем гена, чиято експресия се регулира 0-кратно през първите няколко часа след исхемиябъбречнанараняванев модел на мишка. Един от тези транскрипти, богат на цистеин протеин 61 (Cyr61), съвсем наскоро беше потвърдено, че е индуциран от бъбречна исхемия (8), но поведението на останалите шест диференциално експресирани гена е ново за литературата за ARF. В това проучване избрахме да характеризираме допълнително един от тези неразпознати досега гени, а именно липокалин, свързан с неутрофилна желатиназа (NGAL), тъй като това е малък секретиран полипептид, който може да бъде открит в урината, по-специално, защото е резистентен на протеаза. Нашите резултати показват, че NGAL може да представлява нов ранен уринарен биомаркер за исхемична и нефротоксичнабъбречнанараняване.

Материали и методи

Миши модели на бъбречна исхемия-реперфузионно увреждане

Ние използвахме добре установени миши модели, в които структурните и функционални последици от кратки периоди набъбречнаисхемия са документирани по-рано (11–15). Накратко, мъжки мишки Swiss-Webster (Taconic Farms, Germantown, NY) с тегло от 25 до 35 g бяха настанени с цикъл 12:12-h светлина:тъмнина и им беше разрешен свободен достъп до храна и вода. Животните бяха анестезирани с натриев пентобарбитал (50 mg/kg интраперитонеално) и поставени върху затопляща маса за поддържане на ректална температура от 37 градуса. Използвани са три отделни протокола: (1) едностранна исхемия без ARF, (2) двустранна исхемия с ARF и (3) двустранна лека субклинична исхемия. За експериментите с едностранна исхемия, лявото бъбречно стъбло се запушва с нетравматична съдова скоба за 45 минути, през което време бъбрекът се поддържа топъл и влажен. След това скобата беше отстранена, бъбрекът беше наблюдаван за връщане на кръвния поток и разрезът беше зашит. Мишките бяха оставени да се възстановят в затоплена клетка и бяха получени времеви колекции от урина. След 0, 3, 12 или 24 часа реперфузия, животните се анестезират отново, коремната кухина се отваря и се взема кръв чрез пункция на долната куха вена за измерване на серумния креатинин чрез комплект за количествен колориметричен анализ (Sigma, Сейнт Луис, Мисури). Мишките бяха убити, бъбреците бяха перфузионно фиксирани in situ с 4 процента параформалдехид в PBS и двата бъбрека бяха събрани (десният бъбрек служи като контрола за всяко животно). Най-малко три отделни животни бяха изследвани при всеки от периодите на претопяване. Половината от всеки бъбрек се замразява бързо в течен азот и се съхранява при 70 градуса до по-нататъшна обработка; проба се фиксира във формалин, залива се с парафин и се нарязва (4 m). Парафиновите срезове се оцветяват с хематоксилин-еозин и се изследват хистологично. Притиснатите бъбреци показват характерните морфологични промени в резултат на исхемично-реперфузионно увреждане, както е публикувано по-рано от други (12-14) и нас (11). Другата половина от всеки бъбрек беше вградена в OCT съединението (Tissue-Tek) и бяха получени замразени срезове (4 m) за имунохистохимия. За двустранна исхемия с експерименти с ARF, двата бъбрека бяха прихванати за 30 минути и изследвани в различни периоди на рефлоум, както е описано по-горе. Тази група от осем животни е проектирана да представлява клинична ARF и показва значително повишаване на серумния креатинин на 24-ия час след нараняването. За експериментите с двустранна лека субклинична исхемия и двата бъбрека се притискат само за 5, 10 или 20 минути и се изследват при различни периоди на реперфузия, както по-горе. Тази лека степен на увреждане е предназначена да симулира субклинична бъбречна исхемия и мишките в тази група не показват никакви повишения на серумния креатинин, измерен на 24 часа след нараняването.

Плъх модел на бъбречна исхемия-реперфузионно увреждане

Използвахме утвърдени модели на гризачибъбречнаисхемично-реперфузионно увреждане (10). Накратко, мъжки плъхове Sprague-Dawley с тегло 200 до 250 g (Taconic Farms) бяха анестезирани с кетамин (150 g/g) и ксилазин (3 g/g) и подложени на двустранна оклузия на бъбречната артерия с микроваскуларни скоби за 30 минути, както е описано подробно в протокола на мишката. Колекциите на урина бяха получени на 3, 6, 9, 12 и 24 часа от реперфузията и беше събрана кръв за измерване на креатинина по време на умъртвяването (24 часа).

Миши модел на индуцирано от цисплатин бъбречно увреждане

Използвахме добре установени миши модели, в които структурните и функционални последици от приложението на цисплатин са били документирани преди това (16-18). Накратко, на мишките е дадена единична интраперитонеална инжекция на цисплатин (20 mg/kg телесно тегло). Това води до некроза и апоптоза на тубулни клетки и повишен уреен азот в кръвта в рамките на 3 дни след инжектирането на цисплатин (16-18). Животните бяха настанени в метаболитни клетки и колекции от урина бяха получени ежедневно.

Изолиране на РНК

Миши цели бъбречни тъкани (или култивирани човешки проксимални тубулни клетки; вижте по-долу) бяха разрушени с Tissue Terror (Biospec Products, Racine, WI). Общата РНК от контролни и исхемични бъбреци се изолира с помощта на RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, СА) и се определя количествено чрез спектрофотометрия.

Процедури за микрочипове

Подробни описания на хардуера и процедурите на микрочипове са публикувани по-рано (11). Накратко, за всеки експеримент, 100 g пречистена обща миша бъбречна РНК се транскрибира обратно с обратна транскриптаза Superscript II (Life Technologies, Rockville, MD) в присъствието на Cy3-dUTP (Amersham, Piscataway, NJ) за контроли и Cy5-dUTP за исхемични проби. Пробите сДНК се пречистват с помощта на филтър Microcon YM-50 (Millipore, Madison, WI) и се хибридизират в слайдове с микрочипове, съдържащи 8979 уникални последователно проверени миши сонди (11). Три отделни животни бяха изследвани за всеки от периодите на претопяване и бяха извършени поне два независими експеримента с микрочипове за всяко от животните. Слайдовете на масива бяха сканирани с помощта на скенер за микрочипове (GenePix 4000B; Axon Instruments, Foster City, CA), за да се получат отделни TIFF изображения за Cy3 и Cy5 флуоресценция. Интензитетите на сигнала за Cy3 и Cy5 бяха определени за отделни гени с помощта на софтуера за извличане на данни GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments). Контролът на качеството и анализът на данните бяха завършени, както е описано по-горе (11).

растение цистанче за бъбреци

Полуколичествена обратна транскрипция–PCR

Равно количество (1 плюс - g) обща РНК от контролни и експериментални миши бъбреци се транскрибира обратно с обратна транскриптаза Superscript II (Life Technologies) в присъствието на произволни хексамери съгласно инструкциите на производителя. PCR беше извършен с помощта на комплект (Roche, Indianapolis, IN) и следните праймери: миши NGAL сенс 5'-CACCACGGACTACAACCAGT TCGC-3', миши NGAL антисенс 5'-TCAGTTGTCAATGCATTG GTCGGTG-3', човешки NGAL смисъл 5'-TCAGCCGTCGATACACT GGTC-3' и човешки NGAL антисенс 5'-CCTCGTCCGAGTGG TGAGCAC-3'. Двойки праймери за миши и човешки -актин и глицералдехид-3- фосфат дехидрогеназа (GAPDH) бяха получени от Clontech (La Jolla, СА). Фалшиви реакции, лишени от cDNA, служат като отрицателни контроли. PCR продуктите се анализират чрез електрофореза в агарозен гел, последвана от оцветяване с етидиев бромид и се определят количествено чрез денситометрия. Кратни промени в експресията на NGAL mRNA в исхемични спрямо контролни бъбреци бяха изразени след нормализиране за -актин или GAPDH амплификация.

Микроскопия

За откриване на NGAL, замразените срезове се пермеабилизират с {{0}}.2 процента Triton X-100 в PBS за 10 минути, блокират се с кози серум за 1 час и се инкубират с първично антитяло срещу NGAL ( 1:500 разреждане) за 1 час. След това слайдовете се излагат в продължение на 30 минути на тъмно на вторични антитела, конюгирани с Cy5 (Amersham, Arlington Heights, IL) и се визуализират с флуоресцентен микроскоп (Zeiss Axiophot), оборудван с родаминови филтри. За ко-локализация на NGAL с Rab11, серийните срезове първо се инкубират с NGAL антитяло или моноклонално антитяло към Rab11 (разреждане 1:500; Transduction Laboratories), след това с вторични антитела, конюгирани с Cy5 (за NGAL) или Cy3 (за Rab11 ) и се визуализират съответно с родаминови или флуоресцеинови филтри. За ко-локализация на NGAL с пролифериращ клетъчен ядрен антиген (PCNA), срезовете се инкубират съвместно с NGAL антитяло и моноклонално антитяло срещу PCNA (разреждане 1:500; Upstate) и откриването се извършва чрез имунопероксидазно оцветяване (ImmunoCruz Staining System, Санта Круз Биотехнология). За анализа TUNEL използвахме комплекта за анализ на фрагментиране на ДНК ApoAlert (Clontech). Парафиновите срезове се депарафинизират чрез ксилен и низходящи степени на етанол, фиксират се с 4 процента формалдехид/PBS за 30 минути при 4 градуса, пермеабилизират се с протеиназа К при стайна температура за 15 минути и 0,2 процента Triton X-100/PBS за 15 минути min при 4 градуса и се инкубира със смес от нуклеотиди и TdT ензим за 60 минути при 37 градуса. Реакцията беше прекратена с 2 SSC и срезовете бяха промити с PBS и монтирани с Crystal/mount (Biomed, Foster City, СА). TUNEL-позитивните апоптотични ядра бяха открити чрез визуализация с флуоресцентен микроскоп.

Събиране на урина

Мишки или плъхове се поставят в метаболитни клетки (Nalgene, Rochester, NY) и урината се събира преди и на всеки час след двустраннобъбречназапушване на артерия. Пробите от урина се центрофугират при 5000 g за отстраняване на остатъците и супернатантът се анализира чрез Western blotting. Креатининът в урината беше измерен чрез комплект за количествен колориметричен анализ (Sigma) за нормализиране на пробите за определяне на NGAL в урината. Комплект за колориметричен анализ за определяне на N-ацетил-D-глюкозаминидаза (NAG) в урината беше получен от Roche.

Клетъчна култура

Човекбъбречнапроксимални тубулни епителни клетки (RPTEC) са получени от Clonetics (Сан Диего, Калифорния). Клетките бяха отгледани вбъбречнабазална среда на епителни клетки, допълнена сБъбречнаКомплекс за среда за растеж на епителни клетки (REGM) ({{0}}.5 l/ml хидрокортизон, 10 pg/ml hEGF, 0.5 - g/ml епинефрин, 6,5 pg/ml трийодтиронин, 10 плюс - g/ml трансферин, 5 - g/ml инсулин, 1 -g/ml гентамицин сулфат и 2 процента FBS), както се препоръчва от производителя.

Леко изчерпване на АТФ в култивирани клетки

Ние модифицирахме описаните по-рано протоколи на in vitro исхемия чрез изчерпване на АТФ с инхибитори на окислителното фосфорилиране (19, 20). На втория ден след сливането, RPTEC клетките се инкубират с 1 m антимицин А (Sigma) за различни периоди от време до 6 часа. По-рано показахме, че това води до леко частично обратимо изчерпване на АТФ и без загуба на клетъчна жизнеспособност в други видове култивирани бъбречни епителни клетки, като MDCK (19) и 786-O (20) клетки. Нивата на АТФ се наблюдават с помощта на комплект за анализ на базата на луцифераза (Sigma) и се изразяват като процент от контролните стойности. Клетките се събират в различни времеви точки на изчерпване на АТФ и се анализират за експресия на NGAL mRNA чрез обратна транскрипция – PCR (RT-PCR) и експресия на NGAL протеин чрез Western анализ. Секрецията на NGAL в културалната среда също беше наблюдавана.

Други материали и методи

Всички химикали са закупени от Sigma, освен ако не е посочено друго. За Western blotting концентрациите на протеин се определят чрез теста на Брадфорд (Bio-Rad, Hercules, СА) и равни количества общ протеин се зареждат във всяка лента. Използвано е моноклонално антитяло към - -тубулин (Sigma) при 1:10,000 разреждане за потвърждаване на еднакво натоварване с протеини и поликлонално антитяло към NGAL е използвано при 1:500 (21). Използвано е моноклонално антитяло към 2-микроглобулин при 1:500 (Sigma). Имунооткриването на прехвърлените протеини се постига с помощта на усилена хемилуминесценция (Amersham).

Резултати

Характеризиране на животинските модели на ранна бъбречна исхемия-реперфузионно увреждане

Използвахме миши модели, в които са документирани структурните и функционални последици от кратки периоди на бъбречна исхемия (11–15). Характерните хистопатологични особености на исхемичното увреждане бяха лесно очевидни в 24-h реперфузионни проби след едностранна (45 минути) и двустранна (30 минути) исхемия. Те включват загуба на мембрани на четката, тубулна дилатация, сплескан тубуларен епител, луминални остатъци и интерстициални инфилтрати (Фигура 1). Документирахме наличието на апоптотични клетки с помощта на теста TUNEL. Апоптозата е предимно локализирана в дисталните тубулни клетки и възходящия крайник на бримката на Хенле, както в отделени клетки в лумена, така и в прикрепени клетки. Случайни проксимални тубулни клетки също са апоптотични, но гломерулите по същество са лишени от апоптоза. Не бяха открити TUNEL-положителни клетки в контролните бъбреци или в исхемичните проби, където TdT беше пропуснат (не е показано). Горните хистологични и апоптотични промени липсват в бъбреците, подложени на по-леки степени на исхемия (5, 10 или 20 минути двустранна исхемия; не е показано). Нивата на серумния креатинин отразяват наблюдаваните хистопатологични промени. По този начин, мишки с едностранна бъбречна исхемия или леки степени на субклинична двустранна исхемия показват нива на серумен креатинин, които са неразличими от контролните животни, докато мишки с двустранна исхемия за 30 минути показват значително повишаване на серумния креатинин (Фигура 1).

Фигура 1. Характеризиране на миши модел на исхемиябъбречнанараняване. Левите панели показват резултатите от оцветяване с хематоксилин и еозин (отгоре) и оцветяване с TUNEL (отдолу) на бъбречни срезове от контролни мишки или след 24 часа исхемия-реперфузия (IRI). (Вдясно) Резултати от определяне на серумен креатинин при контролни мишки (Con), след едностранна исхемия за 45 минути (U45) или след двустранна исхемия за различни периоди, както е показано. *P 0.05 спрямо контрола. Числата в чертичките показват брой животни.

NGAL иРНК се индуцира значително в ранния постисхемичен бъбрек

Чрез микрочипов анализ на мишки с едностраннобъбречнаисхемия, беше установено, че NGAL се индуцира постоянно (3,2 плюс - 0.5-кратно, 11,1 плюс - 1.2-кратно и 4,3 плюс {{1{{{30} }}}.6-кратно при 3, 12 и 24 часа реперфузия) в исхемичния бъбрек на мишка в сравнение с контролните бъбреци от същото животно (средно плюс - SD от три животни във всяка времева точка). Това откритие беше потвърдено чрез полуколичествена RT-PCR, като се използва протокол за нормализиране както с плюс-актин, така и с GAPDH. Не са отбелязани значителни промени в експресията на mRNA нито на плюс-актин, нито на GAPDH при нито един от изследваните периоди на реперфузия, както е описано по-горе (11). Въпреки това, използвайки специфични за мишки праймери, ние открихме значително повишаване на експресията на NGAL иРНК (4,1 плюс -0.5-кратно, 9 плюс -0.6-кратно и 4,2 плюс 0.4-кратно при 3, 12 и 24 часа реперфузия, съответно, където стойностите представляват средно плюс - SD от три отделни животни). Тези резултати са илюстрирани на Фигура 2 и са в общо съгласие с промените, открити чрез анализ на транскриптоми.

Фигура 2. Индукция на липокалинова (NGAL) иРНК, свързана с неутрофилна желатиназа в миши бъбрек след исхемия. (Отгоре) Представителна обратна транскрипция–PCR (RT-PCR) с праймери за миши актин и NGAL, използвайки РНК, извлечена от бъбреците на контролни (C) мишки или след различни периоди на реперфузия, както е показано (часове). Ивица M съдържа 100-bp ДНК стълба. (Отдолу) Многократно увеличение на експресията на NGAL mRNA в различни времеви точки от контролата (CON). Стойностите, получени чрез микрочипове (плътна линия) спрямо RT-PCR (пунктирана линия) са средните SD от три експеримента във всяка времева точка.

NGAL протеинът е значително свръхекспресиран в проксималните тубули на ранни исхемични миши бъбреци

Следващото интересно беше да се определи дали постисхемичната експресия на NGAL протеин в бъбрека е паралелна с тази на иРНК. Чрез Western анализ NGAL се открива само като 25-kD имунореактивен пептид в бъбреците на контролна мишка. Идентичността на тази лента като NGAL беше установена в отделен набор от експерименти, където предварителното инкубиране на първичното антитяло с рекомбинантен миши липокалин напълно блокира тази имунореактивност (не е показано). В експериментите с едностранна исхемия, експресията на NGAL се индуцира три до четири пъти чрез денситометрия в исхемичния бъбрек от пет отделни животни в рамките на 3 часа от нараняването, както е показано на Фигура 3. Този отговор беше драстично повишен в експериментите с двустранна исхемия от осем отделни животни . NGAL при тези мишки се индуцира трикратно след 3 часа реперфузия, достига пик при 12- пъти в 24-h проби и спада до нормални нива до 72-h период на възстановяване (Фигура 3) .

Фигура 3. Индукция на миши бъбречен NGAL протеин след едностранна или двустранна исхемия. (Отгоре) Представителни Western blots с цели бъбречни проби, получени от контролни (Con) мишки или след периоди на реперфузия, както е показано (часове), изследвани с поликлонално антитяло към NGAL или моноклонално антитяло към тубулин (за демонстриране на еднакво протеиново натоварване). Маркерите за молекулно тегло са отляво. (Отдолу) Многократно увеличение на експресията на NGAL протеин в различни времеви точки от контролата (CON). Стойностите, получени чрез денситометрия, са средни SD от пет животни за едностранна исхемия и осем животни за двустранна исхемия

Използвайки имунохистохимични техники, след това демонстрирахме, че NGAL протеинът е едва откриваем в бъбреците на контролна мишка, но се регулира нагоре предимно в проксималните тубули в рамките на 3 часа от исхемията, както е показано на фигура 4. Идентифицирането на проксималните тубули в тези секции се основава на наличието на четка гранична мембрана, съотношението между размера на ядрото и клетката и клетъчната морфология. Индуцираният NGAL се появява в точково цитоплазмено разпределение в проксималните тубулни клетки, напомнящо за секретиран протеин. Този модел на експресия е идентичен както при едностранните, така и при двустранните модели на исхемично-реперфузионно увреждане и е постоянно очевиден при всяко изследвано животно. Гломерулите бяха лишени от експресия на NGAL и не бяха очевидни експресиращи NGAL неутрофили. Тъй като е показано, че NGAL в култивирани туморни бъбречни клетки на Wilms се локализира поне частично с ендозоми (21), ние изследвахме в серийни секции разпределението на NGAL и Rab11 (маркер за късно рециклиране на ендозоми). Обединените изображения показват значителна съвместна локализация на NGAL с Rab11 (Фигура 4). За да изследваме функционалното значение на повишената експресия на NGAL след исхемия, ние изследвахме серийни бъбречни срезове за експресия на NGAL, TUNEL-позитивни ядра или PCNA-позитивни ядра. Докато тубулните клетки, свръхекспресиращи NGAL, не са TUNEL-позитивни (не са показани), значителна съвместна локализация на NGAL и PCNA е очевидна в пролифериращите и регенериращите клетки в 48-h период на преливане (Фигура 4).

Фигура 4. Индукция на миши бъбречен NGAL протеин след исхемия. (Отгоре) Представителни имунохистохимични резултати върху замразени срезове от миши бъбреци, получени от контролни мишки или след различни периоди на пренареждане, както е показано (часове), изследвани с поликлонално антитяло срещу NGAL. G, гломерул. Панелът с надпис HP е с висока мощност 100 плюс увеличение, а другите панели са на 20. (Долу) Левите два панела показват тубула след 3 часа реперфузия, експресираща NGAL (червено) или Rab11 (зелено). Третият панел показва обединено изображение, което показва съвместна локализация в жълто. Панелът в крайния десен ъгъл показва ко-локализация на NGAL с пролифериращ клетъчен ядрен антиген в тубулите след 48 часа пренареждане.

NGAL протеинът се открива лесно в урината веднага след индукция на ARF при мишки

След това беше от значителен интерес да се определи дали постисхемичната експресия на NGAL протеин може да бъде открита в урината, като по този начин се предполага неговата полезност като ранен неинвазивен биомаркер за исхемиченбъбречнанараняване. С използването на концентрациите на креатинин в урината за изравняване за зареждане на пробата, NGAL отсъстваше в урината преди исхемия. В поразителен контраст, NGAL се проявява като 25-kD лента в рамките на 2 часа след нараняването (в първото отделяне на урина след исхемия) при всички изследвани животни (пет с едностранна и осем с двустранна исхемия), както е показано в Фигура 5. Идентичността на тази лента като NGAL беше установена в отделен набор от експерименти, в които преинкубиране на първичното антитяло с рекомбинантен миши липокалин напълно блокира тази имунореактивност (не е показано). Забележително е, че NGAL лесно се открива само в 1 l непреработена урина чрез Western анализ и персистира за цялото изследвано време (24 часа реперфузия). След това сравнихме екскрецията на NGAL в урината с тази на установени по-рано маркери за увреждане, като 2-микроглобулин и NAG. Докато NGAL в урината беше очевиден в рамките на 2 часа от исхемията, 2-микроглобулинът се откриваше в същите проби от урината само след 12 часа едностранна и 8 часа двустранна исхемия (Фигура 5). По същия начин, екскрецията на NAG в урината се повишава значително само след 12 часа едностранна и 8 часа двустранна исхемия в сравнение с неисхемични контролни животни (Фигура 5).

Фигура 5. Ранно откриване на NGAL протеин в урината при мишки с остра исхемична болестбъбречнаповреда (ARF). (Нагоре) Представителни Western blots проби от непреработена урина (1 до 2 плюс - l на лента, нормализирани за съдържание на креатинин) са получени в периоди на реперфузия, както е показано (часове), след едностранно или двустраннобъбречназатягане на артерия. Маркерите за молекулно тегло са показани вляво. Блотовете бяха изследвани с NGAL (отгоре) или {{0}}микроглобулин (бета2-M; в средата). (Отдолу) Определяне на N-ацетил--D-глюкозаминидаза (NAG) в урината при различни периоди на реперфузия, както е посочено, от пет животни за едностранна исхемия и осем животни за двустранна исхемия. Стойностите са средни SD. *P 0,05 спрямо контрола във всяка времева точка, ANOVA.

NGAL протеинът се открива лесно в урината дори след лека бъбречна исхемия при мишки

За да се определи чувствителността на откриването на NGAL в урината при отсъствие на явен ARF, ние използвахме протоколи, при които отделни групи мишки бяха подложени само на 5, 10 или 20 минути двустраннобъбречназапушване на артерия. Тези проучвания са предназначени за оценка на екскрецията на NGAL в урината след лека субклинична бъбречна исхемия. Серумният креатинин, измерен след 24 часа преливане, е в нормални граници при всички тези мишки (Фигура 1). Учудващо, NGAL лесно се открива само в 1 l непреработена урина при тези животни (Фигура 6), въпреки че появата му е малко забавена в сравнение с животни с явен ARF. По този начин, докато 30 минути двустранна исхемия води до екскреция на NGAL в урината в рамките на 2 часа (Фигура 5), мишките с 20 или 10 минути двустранна исхемия проявяват NGAL в урината след 4 часа, а тези с 5 минути исхемия екскретират NGAL само след 6 часа ( Фигура 6). По този начин появата на NGAL в урината корелира с дозата и продължителността на бъбречната исхемия.

NGAL протеинът се открива лесно в урината веднага след индукция на ARF при плъхове

Фигура 6. Откриване на NGAL протеин в урината при мишки със субклинична бъбречна исхемия. Представителен Western blot от необработени проби от урина (1 до 2 l на лента, нормализирани за съдържание на креатинин), получени в периодите на реперфузия, както е показано (часове), след 5, 10 или 20 минути двустранно клампиране на бъбречната артерия. Маркерите за молекулно тегло са показани вляво. Тези животни показаха нормален серумен креатинин на 24-ия час от рефлоума.

Тъй като съществува дебат относно разликите между видовете в отговорите на оклузия на бъбречната артерия (22), ние след това изследвахме поведението на NGAL в различен животински модел, а именно добре установен модел на плъхове на увреждане на бъбречна исхемия-реперфузия. С използването на концентрациите на креатинин в урината за изравняване за зареждане на пробата, NGAL отсъстваше в урината преди исхемия. В подчертан контраст, NGAL се проявява като 25-kD имунореактивен пептид в рамките на 3 часа от нараняването (в първото отделяне на урина след исхемия), както е показано на Фигура 7. За сравнение, серумният креатинин в този модел на исхемичното увреждане е повишено само след 24 часа реперфузия (не е показано). Още веднъж, NGAL се открива в 1 l непреработена урина и се запазва за цялото изследвано време (24 часа реперфузия).

Фигура 7. Ранно откриване на NGAL протеин в урината при плъхове с исхемична ARF. Представителен Western blot от необработени проби от урина (1 до 2 l на пътека, нормализирани за съдържание на креатинин), получени при периоди на реперфузия, както е показано (часове), след 30 минути двустранно клампиране на бъбречна артерия при плъхове. Маркерите за молекулно тегло са показани вляво. Тези животни показват значително увеличение на серумния креатинин на 24-ия час от повторното зареждане.

NGAL иРНК се индуцира в култивирани човешки проксимални тубулни клетки след ранна лека исхемия

За да потвърдим произхода на NGAL от исхемични проксимални тубулни клетки, ние модифицирахме описаните по-рано протоколи на in vitro исхемия чрез изчерпване на АТФ в култивирани човешки проксимални тубулни клетки (RPTEC). Инкубацията е 1-m антимицин, което води до леко частично изчерпване на АТФ до приблизително 83 плюс 3 процента от контролата в рамките на 1 час, с по-плавно намаляване до приблизително 75 плюс - 3 процента от контролата до 6 часа ( средна SD от четири експеримента). Не се забелязват морфологични последствия от това леко изчерпване на АТФ. NGAL иРНК се открива само в клетки в покой. Въпреки това, след частично изчерпване на АТФ, бърза и зависима от продължителността индукция на NGAL иРНК беше очевидна чрез RT-PCR, както е показано на Фигура 8.

NGAL протеинът се открива лесно в средата след ранна исхемия in vitro

След това изследвахме експресията на NGAL протеин в RPTEC клетки и културалната среда след леко изчерпване на ATP. NGAL протеин се открива в контролни RPTEC клетки и неговата експресия се увеличава след изчерпване на АТФ по начин, зависим от продължителността, както е показано на Фигура 8. Не се открива NGAL имунореактивен протеин в културалната среда от контролните клетки, но NGAL се открива лесно в рамките на 1 h на леко изчерпване на АТФ (Фигура 8). По-нататъшни увеличения на изобилието на NGAL протеин бяха отбелязани във връзка с продължителността на изчерпването на АТФ. Тези резултати предполагат, че индуцираният NGAL протеин бързо се секретира в средата, аналогично на бързата поява на NGAL в урината след бъбречна исхемия in vivo.

Фигура 8. Индукция на NGAL иРНК след исхемия in vitro. (Отгоре) Представителен RT-PCR с праймери за човешки NGAL, като се използва РНК, извлечена от клетки на бъбречни проксимални тубулни епителни клетки (RPTEC) след различни периоди на частично изчерпване на АТФ, както е показано (часове). Ивица M съдържа 100-bp ДНК стълба. (Средно) Многократно увеличение на експресията на NGAL иРНК в различни моменти от контролата (0), нормализирано за експресия на глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа. Показаните стойности са средни SD от три експеримента във всяка времева точка. (Отдолу) Представителен Western blot с RPTEC проби след различни периоди на частично изчерпване на АТФ, както е показано (часове), получени от равни количества клетъчни пелети (Pel) или културална среда (Sup), изследвани с поликлонално антитяло срещу NGAL. Маркерите за молекулно тегло са отляво. Фигурата е представителна за три отделни експеримента.

NGAL протеинът се открива лесно в урината рано след индуциране на индуцирана от цисплатин нефротоксичност

След това искахме да определим дали NGAL може да бъде открит в урината след други форми на увреждане на тубулни клетки. В установен миши модел на нефротоксичност на цисплатин, NGAL лесно се открива в урината в рамките на 1 ден от приложението на цисплатин (Фигура 9). Обратно, 2-микроглобулинът в урината беше едва откриваем след 2 дни и не можеше да бъде надеждно открит до ден 4 до 5 след цисплатин. По подобен начин, повишената екскреция на NAG в урината не беше очевидна до дни 4 и 5 след приложението на цисплатин (Фигура 9).

Фигура 9. Ранно откриване на NGAL протеин в урината при мишки с увреждане, предизвикано от цисплатин. (A) Представителни Western блотове върху необработени проби от урина (1 до 2 l на пътека, нормализирани за съдържание на креатинин), получени в дните, както е показано след прилагане на цисплатин, изследвани с антитяло срещу 2-микроглобулин или NGAL. Маркерите за молекулно тегло са показани вляво. (B) Определяне на NAG в урината в различни дни след прилагане на цисплатин (n 4). Стойностите са средни плюс -SD. *P 0.05 спрямо ден 0.

Дискусия

Използвахме стратегия за разпит на транскриптом, за да идентифицираме бъбречни гени, които се индуцират рано след бъбречна исхемия, чиито протеинови продукти могат да служат като нови биомаркери за ARF. Ние идентифицирахме седем гена, които са регулирани нагоре 10-кратно, един от които (Cyr61) наскоро беше съобщено, че е индуциран след бъбречна исхемия (8). Неочаквано, индукцията на останалите шест транскрипта беше нова за полето на ARF. В това изследване избрахме да характеризираме допълнително един от тези неразпознати досега гени, а именно NGAL.

NGAL принадлежи към суперсемейството липокалин на - 20 структурно свързани секретирани протеини, за които се смята, че транспортират различни лиганди в рамките на чашка с цилиндър (23). Човешкият NGAL първоначално е идентифициран като 25-kD протеин, ковалентно свързан с желатиназа от човешки неутрофили, където той представлява един от неутрофилните вторични гранулирани протеини (24, 25). Проучванията за молекулярно клониране показват, че човешкият NGAL е подобен на миши 24p3 ​​ген, идентифициран за първи път в първични култури от миши бъбреци, които са индуцирани да пролиферират (26). NGAL се експресира на много ниски нива в други човешки тъкани, включително бъбреците, трахеята, белите дробове, стомаха и дебелото черво (27). Експресията на NGAL е значително индуцирана в стимулиран епител. Например, той се регулира нагоре в епителните клетки на дебелото черво в области на възпаление или неоплазия, но отсъства в интервенционните незасегнати области или в рамките на метастатични лезии (28). Концентрациите на NGAL са повишени в серума на пациенти с остри бактериални инфекции (29), в храчката на пациенти с астма или хронична обструктивна белодробна болест (30) и в бронхиалната течност от емфизематозния бял дроб (31). Във всички тези случаи се предполага, че индукцията на NGAL е резултат от взаимодействия между възпалителни клетки и епителната обвивка, като регулирането на експресията на NGAL е очевидно както в неутрофилите, така и в епитела (28–32).

Повишаването на NGAL в зрелия бъбрек досега не е описано. Няколко линии от доказателства, събрани от нашето проучване, предполагат, че откритата индукция на NGAL представлява нов присъщ отговор на клетките на проксималните тубули на бъбреците към исхемично увреждане и не произлиза само от активирани неутрофили. Първо, реакцията е изключително бърза, като NGAL се появява в урината в рамките на 2 часа след нараняването (в първото отделяне на урина след оклузия на бъбречната артерия), а натрупването на бъбречни неутрофили при този модел на исхемична ARF обикновено се отбелязва за първи път на 4 часа след нараняване (33–35). Второ, времевите модели на индукция на NGAL и натрупване на неутрофили са различни. Експресията на NGAL иРНК и протеин се забелязва максимално на 12-ия час от префлоуването, докато натрупването на неутрофили достига пикове на 24-ия час (33–35), до което време експресията на NGAL е значително намаляла. Трето, неутрофили, експресиращи NGAL, не се откриват чрез имунофлуоресценция в изследваните бъбречни проби (Фигура 4). Четвърто и най-убедително, документирано е, че индукцията на NGAL иРНК и протеин се случва в култивирани човешки проксимални тубулни клетки след in vitro исхемия, като NGAL се секретира в културалната среда в рамките на 1 час от изчерпването на АТФ, в система, в която неутрофилите абсолютно липсват. Въпреки това, нашите in vivo проучвания не ни позволяват да изключим напълно някакъв принос от инфилтриращите активирани неутрофили за наблюдаваното повишаване на NGAL. Наистина е възможно повишената регулация на NGAL в клетките на бъбречните тубули да бъде индуцирана от локалното освобождаване на цитокини от неутрофили, уловени в микроциркулацията рано след исхемично увреждане.

Какво е цистанче? Цистанчеможе да лекувабъбречнанараняване

Липсва адекватно обяснение за индуцирането на NGAL от стимулиран епител и дали NGAL е защитен или е близо до нараняване или дори невинен страничен наблюдател остава неясно. Скорошни доказателства сочат, че поне в подгрупа от типове клетки NGAL може да представлява проапоптотична молекула (36–38). В миша про-В лимфоцитна клетъчна линия, отнемането на цитокини води до изразена индукция на NGAL, както и до началото на апоптоза (36, 37). NGAL също е свързан с апоптоза в репродуктивните тъкани. Епителните клетки на инволюционната млечна жлеза и матката експресират високи нива на NGAL, временно съвпадащи с периода на максимална апоптоза (38). Вероятно NGAL регулира подгрупа от клетъчни популации чрез индуциране на апоптоза. Стимулираният епител може да регулира нагоре NGAL, за да индуцира апоптоза на инфилтриращи неутрофили, като по този начин позволява на резидентните клетки да оцелеят след опустошенията на възпалителния отговор. Алтернативно, епителните клетки могат да използват този механизъм, за да регулират собствената си смърт. Въпреки това, интересно е да се отбележи в нашите проучвания, че индукцията на NGAL след ранното бъбречно исхемично-реперфузионно увреждане се проявява предимно в проксималните тубулни клетки, които не показват TUNEL-позитивни ядра.

Други скорошни проучвания разкриха, че NGAL подобрява епителния фенотип. NGAL се експресира от проникващата пъпка на уретера и предизвиква нефрогенеза чрез стимулиране на превръщането на мезенхимни клетки в бъбречен епител (21). Доказано е, че друг липокалин, гликоделин, индуцира епителен фенотип, когато се експресира в клетки на човешки карцином на гърдата (40). Тези констатации са особено подходящи за зрелия бъбрек, при който един от добре документираните отговори на исхемично увреждане е забележителната поява на дедиференцирани епителни клетки, покриващи проксималните тубули (41). Важен аспект на бъбречната регенерация и възстановяване след исхемично увреждане включва повторното придобиване на епителен фенотип, процес, който обобщава няколко аспекта на нормалното развитие (42). Това предполага, че NGAL може да се експресира от увредения тубул, за да предизвика повторна епителизация. Подкрепата за това схващане произтича от скорошната идентификация на NGAL като протеин, транспортиращ желязо, който е комплементарен на трансферина по време на нефрогенезата (21). Добре известно е, че доставянето на желязо в клетките е от решаващо значение за клетъчния растеж и развитие и това вероятно е критично за постисхемичната бъбречна регенерация, точно както е по време на онтогенезата. Тъй като изглежда, че NGAL свързва и транспортира желязото (21), също е вероятно NGAL да служи като мивка за желязо, което се отделя от увредените епителни клетки на проксималните тубули. Тъй като NGAL може да бъде ендоцитизиран от проксималния тубул (K. Mori и J. Barasch, непубликувани наблюдения), протеинът може потенциално да рециклира желязото в жизнеспособни клетки. Това може да стимулира растежа и развитието, както и да премахне желязото, реактивна молекула, от мястото на увреждане на тъканите, като по този начин ограничава медиираната от желязо цитотоксичност. Нашите резултати, показващи ко-локализация на NGAL в PCNA-позитивни регенериращи и пролифериращи тубулни клетки, допълнително подкрепят тази хипотеза.

Основно следствие от нашите открития се отнася до възможността NGAL да бъде нов уринарен биомаркер за исхемичнабъбречнанараняванекоето се сравнява благоприятно с други биомаркери, които са описани. Може би най-добре проученият пример е молекулата на увреждане на бъбреците-1 (KIM-1), предполагаема адхезионна молекула, участваща в бъбречната регенерация (43,44). В плъх модел на исхемично-реперфузионно увреждане беше установено, че KIM-1 се регулира нагоре 24 до 48 часа след първоначалния инсулт, което го прави надежден, но донякъде късен маркер за увреждане на тубулните клетки. Скорошни елегантни проучвания показват, че KIM-1 може да бъде открит в бъбречна биопсия и урина на пациенти с исхемична остра тубулна некроза (45). Това откриване обаче е документирано при пациенти с установено исхемично бъбречно увреждане и ползата от измерване на KIM-1 в урината за откриване на ранно субклинично увреждане досега не е валидирана. В друг скорошен пример беше установено, че Cyr61 е секретиран богат на цистеин протеин, който се открива в урината 3 до 6 часа след исхемично бъбречно увреждане (8). Въпреки това, това откриване изисква етап на биоафинитетно пречистване с хепарин-сефароза перли и дори след такова пречистване бяха очевидни няколко кръстосано реагиращи пептида. За разлика от това, нашето проучване показва, че NGAL лесно и бързо се открива като относително чисти имунореактивни пептиди в Western blots с едва 1 l от първата необработена урина след бъбречна исхемия както при мишки, така и при плъхове. В допълнение, NGAL в урината е очевиден дори след много лека "субклинична" бъбречна исхемия, въпреки нормалните нива на серумен креатинин. Освен това откриването на NGAL в урината далеч предхожда появата на традиционните маркери в урината, включително 2- микроглобулин и NAG.

И накрая, заслужава да се отбележи, че NGAL също се открива в урината рано след приложението на цисплатин, във време, когато други морфологични и биохимични показатели набъбречнанараняванеотсъстваха. По този начин регулирането нагоре и отделянето на NGAL в урината може да представлява бърз отговор на клетките на бъбречните тубули на различни инсулти, а откриването на NGAL в урината може да представлява широко приложим неинвазивен клиничен инструмент за ранна диагностика на увреждане на тубулни клетки.

В обобщение, нашите данни показват, че NGAL представлява нов, чувствителен, неинвазивен уринарен биомаркер за бъбречна исхемия. Ще бъде важно в бъдещата транслационна работа да се изследва експресията на NGAL в урината на пациенти с леки и ранни форми на исхемиябъбречнанараняване. Надяваме се, че такова ранно откриване може да даде възможност на клиницистите да предприемат навременни интервенционни усилия при ARF, състояние, което все още е свързано с лоша прогноза, за което са отчаяно необходими нови терапии. Освен това се надяваме, че такова бързо и лесно откриване на NGAL в урината при пациенти с фина, субклинична исхемиябъбречнанараняване(напр. бъбречни трансплантации, свързани с живота, съдова хирургия, сърдечно-съдови събития) или субклинични нефротоксични увреждания (напр. използване на контрастни вещества и аминогликозиди) ще предупредят клинициста да предприеме маневри, насочени към предотвратяване на прогресията до явна ARF.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от грантове от Националния институт по здравеопазване/Националния институт по диабет и храносмилателни и бъбречни заболявания към PD (DK53289, DK52612) и JB (DK55388 и DK58872).

Cistanche tubulosaможе да лекувабъбречно увреждане

Препратки
1. Thadani R, Pascual M, Bonventre JV: Остра бъбречна недостатъчност. N Engl J Med 334: 1448–1460, 1996
2. Star RA: Лечение на остърбъбречнапровал. Kidney Int 54: 1817–1831, 1998
3. Liaño F, Pascual J: Предсказуеми фактори и точкуване. В: Остра бъбречна недостатъчност, редактирано от Molitoris BA и Finn WF, Филаделфия, WB Saunders, 2001, стр. 507–518
4. Molitoris BA: Преход към терапия при исхемична остра бъбречна недостатъчност. J Am Soc Nephrol 14: 265–267, 2003 г
5. Brady HR, Brenner BM, Clarkson MR, Lieberthal W: Остра бъбречна недостатъчност. В: The Kidney, 6th Ed., редактирано от Brenner BM, Филаделфия, WB Saunders, 2000, стр. 1201–1262
6. Sutton TA, Molitoris BA: Механизми на клетъчно увреждане при исхемична остра бъбречна недостатъчност. Semin Nephrol 18: 490–497, 1998
7. Sheridan AM, Bonventre JV: Клетъчна биология и молекулярни механизми на увреждане при остра исхемична болестбъбречнапровал. Curr Opin Nephrol Hypertens 9: 327–334, 2000 г.
8. Muramatsu Y, Tsujie M, Kohda Y, Pham B, Perantoni AO, Zhao H, Jo SK, Yuen PST, Craig L, Hu X, Star RA: Ранно откриване на богат на цистеин протеин 61 (CYR61, CCN1) в урината след бъбречно исхемично-реперфузионно увреждане. Kidney Int 62: 1601–1610, 2002

9. Kurella M, Hsiao LL, Yishida T, Randall JD, Chow G, Sarang SS, Jensen RV, Gullans SR: Анализ на ДНК микрочипове на сложни биологични процеси. J Am Soc Nephrol 12: 1072–1078, 2001 г.

10. Yoshida T, Kurelia M, Beato F, Min H, Ingelfinger JR, Stears RL, Swinford RD, Gullans SR, Tang SS: Мониторинг на промените в генната експресия при бъбречна исхемия-реперфузия при плъхове. Kidney Int 61: 1646–1654, 2002

11. Supavekin S, Zhanh W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P: Диференциална генна експресия след ранна бъбречна исхемия/реперфузия. Kidney Int 63: 1714–1724, 2003
12. Nogae S, Miyazaki M, Kobayashi N, Saito T, Abe K, Saito H, Nakane PK, Nakanishi Y, Koji T: Индуциране на апоптоза в модел на исхемия-реперфузия на миши бъбрек: Възможно участие на Fas. J Am Soc Nephrol 9: 620–631, 1998
13. Daemen MARC, Van de Ven MWCM, Heineman E, Buurman WA: Участие на ендогенен интерлевкин-10 и фактор на туморна некроза при увреждане на бъбречната исхемия-реперфузия. Трансплантация 67: 792–800, 1999
14. Kelly KJ, Plotkin Z, Dagher PC: Добавянето на гуанозин намалява апоптозата и предпазвабъбречнафункция в условията на исхемично увреждане. J Clin Invest 108: 1291–1298, 2001 г
15. Burne NJ, Rabb H: Патофизиологичен принос на фукозилтрансферазите при увреждане на бъбречната исхемия-реперфузия. J Immunol 169: 2648–2652, 2002
16. Megyesi J, Safirstein RL, Price PM: Индукцията на p21WAF1/CIP/SD1 в клетките на бъбречните тубули засяга хода на индуцираното от цисплатин остробъбречнапровал. J Clin Invest 101: 777–782, 1998
17. Shiraishi F, Curtis LM, Truong L, Poss K, Visner GA, Madsen K, Nick HS, Agarwal A: Генна аблация или експресия на хемоксигеназа-1 модулира цисплатин-индуцирана бъбречна тубулна апоптоза. Am J Physiol 278: F726–F736, 2000
18. Ramesh G, Reeves WB: TNF-медиира експресията на хемокини и цитокини ибъбречнанараняванепри нефротоксичност на цисплатин. J Clin Invest 110: 835–842, 2002 г
19. Feldenberg LR, Thevananther S, del Rio M, De Leon M, Devarajan P: Частичното изчерпване на ATP индуцира Fas- и каспаза-медиирана апоптоза в MDCK клетки. Am J Physiol 276: F837–F846, 1999
20. Devarajan P, De Leon M, Talasazan F, Schoenfeld AR, Davidowitz EJ, Burk RD: Генният продукт на von Hippel-Lindau инхибира апоптозата на бъбречните клетки чрез Bcl-2-зависими пътища. J Biol Chem 276: 40599–40605, 2001 г.
21. Yang J, Goetz D, Li JY, Wand W, Mori K, Setlik D, Du T, ErdjumentBromage H, Tempst P, Strong R, Barasch J: Път на доставяне на желязо, медииран от липокалин. Mol Cell 10: 1045–1056, 2002 г
22. Molitoris BA, Weinberg JM, Venkatachalam MA, Zager RA, Nath KA, Goligorsky MS: Остра бъбречна недостатъчност II. Експериментални модели на остра бъбречна недостатъчност: Несъвършени, но незаменими. Am J Physiol 278: F1–F12, 2000
23. Flower DR, North AC, Sansom CE: Семейството протеини липокалин: преглед на структурата и последователността. Biochim Biophys Acta 1482: 9–24, 2000 г
24. Kjeldsen L, Cowland JB, Borregaard N: Липокалин, свързан с човешка неутрофилна желатиназа, и хомоложни протеини при плъхове и мишки. Biochim Biophys Acta 1482: 272–283, 2000 г.
25. Xu S, Venge P: Липокалините като биохимични маркери на заболяването. Biochim Biophys Acta 1482: 298–307, 2000 г.
26. Hraba-Renevey S, Turler H, Kress M, Salomon C, Weil R: SV40-индуцирана експресия на миши ген 24p3 ​​включва посттранскрипционен механизъм. Онкоген 4: 601-608, 1989
27. Cowland JB, Borregaard N: Молекулярна характеристика и модел на тъканна експресия на гена за липокалин, свързан с неутрофилна желатиназа, от хора. Геномика 45: 17–23, 1997
28. Nielson BS, Borregaard N, Bundgaard JR, Timshel S, Sehested M, Kjeldsen L: Индукция на синтеза на NGAL в епителни клетки на човешка колоректална неоплазия и възпалителни заболявания на червата. Черва 38: 414–420, 1996
29. Xu SY, Pauksen K, Venge P: Серумните измервания на човешки неутрофилен липокалин (HNL) разграничават остри бактериални и вирусни инфекции. Scand J Clin Lab Invest 55: 125–131, 1995 г
30. Keatings VM, Barnes PJ: Маркери за активиране на гранулоцити в индуцирана храчка в сравнение между хронична обструктивна белодробна болест, астма и нормални субекти. Am J Respir Crit Care Med 155: 449–453, 1997
31. Betsuyaky T, Nishimura M, Takeyabu K, Tanino M, Venge P, Xu S, Kawakami Y: Неутрофилни гранулирани протеини в бронхоалвеоларен лаваж от субекти със субклиничен емфизем. Am J Respir Crit Care Med 159: 1985–1991, 1999
32. Carlson M, Raab Y, Severus L, Xu S, Hallgren R, Venge P: Човешкият неутрофилен липокалин е уникален маркер за неутрофилно възпаление при улцерозен колит и проктит. Червата 50: 501–506, 2002 г
33. Chiao H, Kohda Y, McLeroy P, Craig L, Housing I, Star RA: -Меланоцит-стимулиращият хормон предпазва отбъбречнанараняванеслед исхемия при мишки и плъхове. J Clin Invest 99: 1165–1172, 1997
34. Rabb H, Ramirez G, Saba SR, Reynolds D, Xu J, Flavell R, Antonia S: Бъбречно исхемично-реперфузионно увреждане при мишки с дефицит на L-селектин. Am J Physiol 271: F408–F13, 1996
35. Rabb H, Star R: Възпалителна реакция и нейните последствия при острабъбречнапровал. В: Остра бъбречна недостатъчност, редактирано от Molitoris BA и Finn WF, Филаделфия, WB Saunders, 2001, стр. 89 –100
36. Devireddy LR, Teodoro JG, Richard FA, Green MR: Индуциране на апоптоза от секретиран липокалин, който се регулира транскрипционно от лишаване от IL-3. Наука 293: 829–834, 2001 г
37. Persengiev SP, Devireddy LR, Green MR: Инхибиране на апоптоза от ATFx: Нова роля за член на ATF/CREB семейството на bZIP транскрипционни фактори при бозайници. Genes Dev 16: 1806–1814, 2002
38. Ryon J, Bendickson L, Nilsen-Hamilton M: Висока експресия в инволюиращи репродуктивни тъкани на uterocalin/24p3, липокалин и протеин от острата фаза. Biochem J 367: 271–277, 2002 г
39. Изтрито в доказателство.
40. Kamarainen M, Seppala M, Virtanen I, Andersson LC: Експресията на гликоделин в MCF-7 клетки от рак на гърдата индуцира диференциация в организирания ацинарен епител. Lab Invest 77: 565–573, 1997
41. Witzgall R, Brown D, Schwarz C, Bonventre JV: Локализация на пролифериращ клетъчен ядрен антиген, виментин, c-fos и клъстерин в постисхемичния бъбрек: Доказателство за хетерогенен генетичен отговор сред сегментите на нефрона и голям набор от митотични активни и дедиференцирани клетки. J Clin Invest 93: 2175–2188, 1994
42. Hammerman MR: Рекапитулация на филогенезата чрез онтогенеза в нефрологията. Kidney Int 57: 742–755, 2000 г
43. Ichimura T, Bonventre JV, Bailly V, Wei H, Hession CA, Cate RL, Sanicola M: Молекула за увреждане на бъбреците -1 (KIM-1), предполагаема адхезионна молекула на епителните клетки, съдържаща нов имуноглобулин домен, се регулира нагоре в бъбречните клетки след нараняване. J Biol Chem 271: 4135–4142, 1998
44. Bailly V, Zhang Z, Meier W, Cate R, Sanicola M, Bonventre JV: Отделяне на молекула за увреждане на бъбреците -1, предполагаем адхезивен протеин, участващ в бъбречната регенерация. J Biol Chem 277: 39739– 39748, 2002 г.
45. Han WK, Bailly V, Abichandani R, Thadani R, Bonventre JV: Молекула на увреждане на бъбреците-1 (KIM-1): нов биомаркер за увреждане на човешки бъбречни проксимални тубули. Kidney Int 62: 237–244, 2002