Имуностимулираща активност на екстрахируеми с вода полизахариди от Cistanche Deserticola като растителен адювант in vitro

За повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Ailian Zhang, Xiumei Yang, Quanxiao Li, Yu Yang, Gan Zhao, Bin Wang, Daocheng Wu

1 Ключова лаборатория за биологични ресурси и генно инженерство в Синдзян, Колеж по наука за живота и технологии, Университет Синдзян, Урумчи, Синдзян, Китай,

2 Ключова лаборатория по медицинска молекулярна вирусология, Училище по основни медицински науки, Медицински колеж в Шанхай, Университет Фудан, Шанхай, Китай,

3 College of LifeScience and Technology, Xi'an Jiaotong University, Xian, Shanxi, Китай

Резюме

Безопасният и ефективен адювант на ваксината е важен в съвременните ваксини. Разни китайскибилкови полизахаридиможе да активира имунната система.Cistanche deserticola(CD) е традиционна китайска билка и кандидат за адювант. Ето, потвърдихме товаводоизвличащи се полизахаридина CD (WPCD) може да модулира имунните отговори in vitro и in vivo. По зависим от дозата начин WPCD значително насърчава съзряването и функцията на дендритни клетки, получени от миши костен мозък (BM-DCs) чрез регулиране на нивата на експресия на MHC -II, CD86, CD80 и CD40, алогенна Т клетъчна пролиферация и добивите на IL-12 и TNF- чрез toll-подобен рецептор4 (TLR4), както е посочено от in vitro експерименти. В допълнение, неговата имуномодулираща активност е наблюдавана и при мишки. WPCD ефективно подобрява титрите на IgG, IgG1 и IgG2a и значително повишава пролиферацията на Т и В клетките, производството на IFN- и IL-4 в CD4 плюс Т клетки и нивото на експресия на IFN- в CD8 плюс Т-клетки по-добри от стипца. Освен това, WPCD може значително да регулира нагоре нивата на експресия на CD40 и CD80 върху DC в далака и да регулира надолу честотата на Treg. Проучването предполага, че полизахаридите на Cistanche deserticola са безопасен и ефективен адювант на ваксината за предизвикване както на хуморален имунитет, така и на клетъчен имунитет чрез активиране на DC чрез сигналния път на TLR4.

Щракнете за продукти от стебла на Cistanche

Въведение

Ваксините са важни за контролиране или предотвратяване на заболявания. Новосъздадените и разработваните в момента ваксини са високо пречистени рекомбинантниантигенис по-висока безопасност, но пречистените антигени не могат да стимулират задоволителенимунен отговорв сравнение с атенюирани или инактивирани патогенни препарати. С помощта на адюванти ваксините могат да предизвикат персистиращиимунни реакции[1,2]. Новите мощни адюванти са широко засегнати както при разработването на ваксини, така и при човешкото здраве. Към днешна дата различни адюванти са идентифицирани и подробно проучени. Тези адюванти придават на ваксините няколко предимства, включително намаляване на необходимото количество антигени, минимизиране на броя на имунизациите, необходими за нормален имунен отговор, и предизвикване на по-бързи, по-широки и по-силниимунни реакции[3–5]. Въпреки че са разработени много мощни адюванти, като липополизахарид (LPS) и пълен адювант на Freund (FCA), те не се прилагат широко поради тяхната токсичност. Следователно само няколко адюванти, като стипца, са лицензирани за клинична употреба [6]. Като цяло трябва да се разработят по-ефективни и по-безопасни адюванти за насърчаване на по-добри профилактични и терапевтични ваксини срещу инфекциозни и неинфекциозни заболявания.

Безопасността е важен фактор при разработването на адюванти. Китайските тревисти съставки включват хранителни вещества и важни активни композити, като фенолни съединения и полизахариди, които могат да действат като мощни имуностимуланти [7–9]. Сред тях полизахаридите от традиционни китайски билки са широко изследвани поради тяхната имуностимулираща активност и ниска токсичност. Например инулинът е имунен адювант без токсичността на други адюванти като FCA. AdvaxTM делта инулиновият адювант също така успешно повишава имуногенността на ваксините [10,11]. Астрагалът, известен също като Huangqi на китайски и Radix Astragali на латински, е широко разпространен по целия свят. Полизахаридът е една от основните му активни съставки, отговорни за имуномодулиращата активност. Експериментални проучвания показват, че полизахаридът от астрагал има силни имуномодулиращи ефекти както in vitro, така и in vivo [12, 13]. Полизахаридите на Lycium barbarum като адювант на ваксината също показват добри подобрения и стимулиращи ефекти [14, 15]. Тези проучвания предполагат, че китайските билкови полизахариди са идеални кандидати за адювантно развитие.

Cistanche deserticola YC Ma(CD, "Rou Cong Rong" на китайски) е ценна традиционна китайска билка и обикновено се счита за "Женшен на пустините" поради превъзходните си тонизиращи ефекти. Разпространен е в сухи или полусухи райони в Синдзян. В Китай изсушеното му месесто стъбло се използва като тонизираща храна от стотици години [16, 17]. В продължение на много години свареният CD се използва като тонизираща храна за лечение на увреждане, предизвикано от пренапрежение, което предполага, че е безопасно за перорално приложение. Това растение е широко разпространено поради широките си лечебни функции. Последните фитохимични и фармакологични проучвания показват, че полизахаридите са основните биологично активни компоненти и имат различни биологични ефекти, включително имуномодулираща активност, антиоксидантен ефект и противовъзпалителни ефекти [18–21]. Въпреки това рядко се съобщава за активността на повишаване на имунитета на екстрахираните с вода полизахариди от C. deserticola в Синдзян.

Добре известно е, че DC са важни антиген-представящи клетки (APC), осигуряващи сигнали, необходими за иницииране на имунни отговори и модулиране на вродени и адаптивни клетки. Някои адюванти, подобряващи усвояването на антиген от DCs, могат да увеличат костимулаторните или MHC молекули и да подобрят имунитета. Когато започне съзряването на DCs, се произвеждат повече костимулиращи молекули и цитокини и DCs показват различни фенотипове [22, 23].

В това проучване първо проучихме дали WPCD може да насърчи активирането на DC чрез сигнален път на TLR4 in vivo. Тъй като DCs бяха връзката между вродените и адаптивните имунни отговори, ние предположихме, че активирането на DCs, стимулирано от WPCD, ще повлияе на резултата от адаптивния имунитет. Изследвахме специфичния имунен отговор към овалбумин (OVA) при мишки, третирани с WPCD, включително титри на IgG, IgG1 и IgG2a подклас, Т- и В- пролиферация и производството на цитокини. Изследвахме дали лечението с WPCD би увеличило активността на DC и Treg клетки в далака на тези мишки. Нашите открития доказаха потенциалната имуномодулираща активност на естествените полизахариди от C. deserticola и разшириха обхвата на приложението им

Материали и методи

Животни

Женски мишки C57BL/6, BALB/c или ICR на възраст от осем до десет седмици бяха закупени от FirstHospital на Медицинския университет в Синдзян (Урумчи, Синдзян, Китай). Мишките бяха настанени при условия, свободни от патогени, съгласно насоките на Комитета за грижа и използване на животните (ACUC) на Синдзянския университет за здраве и благополучие на животните. Процедурите за експерименти с животни бяха одобрени от AUCC на университета Синдзян.

Екстракция на водни екстракти

C. deserticola е растение в провинция Синдзян в Китай. Суровият полизахарид се получава чрез водна екстракция и утаяване с етанол. Накратко, 100 g изсушен C. deserticola се смила на прах и след това се филтрира. Прахът се кипи многократно с петролев етер при стайна температура и след това се кипи с безводен етанол в продължение на 1 час, за да се отстранят оцветените съставки и липидите. Остатъците се екстрахират с вряща вода три пъти и екстрактите се обединяват, центрофугират се при 4000 rpm за 10 минути и се нагряват под обратен хладник при 60°C за 4 часа. Към разтвора се добавят четирикратни обеми от 95 процента етанол, за да се утаят суровите полизахариди. Суровите полизахариди се разтварят отново в дестилирана вода и се третират с реагент Savage за отстраняване на протеините. Екстрактите се разтварят в PBS и се стерилизират през 0.22-μm филтър. И накрая, общото съдържание на захар в WPCD е 59,58 процента, както е посочено от анализа на фенол-сярна киселина [24].

Генериране на DC

BM-DC са генерирани съгласно описания по-горе метод с леки модификации [25]. DCs от костен мозък от C57BL/6 мишки се промиват с пълна среда RPMI-1640 (Gibco), допълнена с 10 процента фетален телешки серум (Hyclone). Събраните клетки се ресуспендират в среда RPMI-1640 с 50 μM -меркаптоетанол (Sigma, St Louis, MO) и 20 ng/mL миши GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) и се инкубират при 37˚ C в 5 процента CO2 атмосфера. Половината от културалната среда се заменя със свежа среда, съдържаща GM-CSF на всеки 1-2 дни. Клетките бяха събрани на Ден 6, третирани с различни дози WPCD, LPS (100 ng/mL) (Sigma, St Louis, MO) в продължение на 24 часа и след това оценени чрез поточна цитометрия.

Откриване на съзряване на DC и Т клетъчно активиране in vitro

Ефектът на съзряване in vitro на WPCD върху BM-DCs беше оценен въз основа на резултатите от фенотипния анализ от FACs. На ден 7, BM–DCs от C57BL/6 бяха индуцирани в присъствието на GM-CSF и след това третирани с различни концентрации на WPCD (0.01, 0.{{11 }}2, 0.05, 0,1 и 0,2 mg/mL) за 12 часа в три екземпляра. LPS (100 ng/mL) се използва като положителна контрола. След като BM-DCs бяха промити в PBS и Fc Block (BD Biosciences, Калифорния) беше използван за предотвратяване на неспецифично свързване на антитела, клетките бяха оцветени в PBS чрез използване на подходящи FITC-, PE- или APC-конюгирани CD40, CD11c, CD{ {24}}, CD80 и MHC-II антитела (BD) за 20 минути при 37˚C. Оцветените клетки бяха открити от FACs Calibur (BD). Анализът на данните беше извършен със софтуер FlowJo (Tree Star).

В експеримента за узряване на DCS in vitro, супернатантите от клетъчни култури също бяха събрани за анализиране на IL-12 и TNF- чрез използване на комплекти за анализ на цитокини (Boster, Wuhan, Китай) съгласно инструкциите на производителя. Абсорбцията при 450 nm се измерва с ELISA четец на плаки (Bio-Rad, USA). Количествата на цитокини в пробите се изчисляват със стандартни криви на рекомбинантни цитокини съгласно линеен метод на регресия.

За да се тества тяхната алогенна стимулираща активност, експериментът на смесена лимфоцитна реакция (MLR) беше извършен съгласно предишния метод [26] чрез MTT (Sigma, St Louis, MO) анализ. Накратко, BM-DCs от C57BL/6 мишки, използвани като стимулаторни клетки, бяха възстановени на ден 7 в RPMI-1640 среда плюс GM-CSF и третирани с различни концентрации на WPCD в продължение на 12 часа при 37˚C. Клетките бяха промити и ресуспендирани в среда RPMI-1640 преди поставяне в 24-платката с ямки. Единична пленоцитна суспензия като реагиращи клетки се изолира от BALB/c мишки. BM-DCs се смесват със спленоцити в съотношения 1:5 и 1:10. Клетките се култивират при 37˚C в 5 процента CO2 атмосфера в продължение на три дни в три екземпляра. Лечението с LPS се използва като положителна контрола. Впоследствие културите бяха добавени с 20 μL МТТ за последното 4-h култивиране. Абсорбцията при дължината на вълната на измерване (490 nm) и референтната дължина на вълната (650 nm) бяха измерени за анализ на Т клетъчна пролиферация. Всички проби бяха измерени спрямо фонов контрол.

Лечение с TLR4 инхибитор in vitro

BM-DC бяха предварително третирани с 5 μM TAK-242 (инхибитор на TLR4, Medchemexpress Inc.USA) в продължение на 1 час и след това съвместно култивирани с различни концентрации на WPCD (100 и 200 ug/mL) в продължение на 12 часа в присъствието или отсъствието на Golgi Stop в три екземпляра. В положителната контрола беше добавен LPS. Клетките и супернатантите бяха открити чрез FACs за анализиране на повърхностни маркери CD86и CD40 и чрез ELISA за анализиране съответно на цитокини TNF-a и IL-12.

Имунизационен протокол

Тест за остра токсичност. При оралния тест за остра токсичност в това проучване са използвани 40 здрави възрастни ICR мишки. ICR мишките бяха гладни (храна, но не вода за една нощ) преди дозиране. WPCD се прилага перорално съответно в дози от 0, 50, 500 или 5000 mg/kg телесно тегло на всяко животно в продължение на 7 дни. Третирани с физиологичен разтвор и третирани със стипца мишки бяха включени в контролната група. Животните се наблюдават ежедневно в рамките на 14 последователни дни. Мишките се наблюдават индивидуално, за да се запише смъртността и клиничните признаци. В допълнение, телесното тегло и консумацията на храна и вода бяха измерени по време на експеримента. На ден 14, индексът на далака или тимуса се изчислява като (тегло на далака или тимуса/телесно тегло) × 10.

Откриване на WPCD имуномодулаторна активност in vivo. За да се изследва дали WPCD има имуномодулираща активност, овалбумин (OVA) (Sigma) се използва като модел на антиген и женски ICR мишки се разделят на случаен принцип в 7 групи (отрицателна контролна група (0.9 процента NaCl и WPCD 400 ug) и положителната контрола (стипца 200 ug с OVA)). На мишките се прилагат подкожно два пъти с 10 ug OVA самостоятелно или WPCD с OVA в съответствие с дозата от 20, 100 или 400 ug с 2-седмичен интервал. Бяха взети кръвни проби и далак след бустер ваксинацията, за да се открият IgG титри, IgG подкласове, спленоцитна пролиферация и цитокини, DCs повърхностни маркери и Treg честота

Откриване на OVA-специфични антитела

OVA-специфични IgG титри и подкласове бяха изследвани чрез ELISA съгласно предишния метод [27]. Плаките ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) се покриват за една нощ и след това се блокират. Серумните проби се разреждат серийно за анализ на IgG титър или откриване на IgG1 и IgG2a (Southern Biotech, Inc.). След това плаките се инкубират с PBST, съдържащ HRP-конюгиран анти-миши IgG, IgG1 и IgG2a за 1 час при 37°C. Колориметричната реакция се развива с тетраметилбензидин (TMB) и след това се измерват абсорбциите при 450 nm/655 nm и се изразяват като единици за оптична плътност (OD).

Откриване на пролиферация на спленоцити и цитокини

Спленоцитната пролиферация се определя чрез МТТ анализ. На 21-ия ден след първата ваксинация се получава суспензия от единичен спленоцит. Клетките се култивират в RPMI-1640 среда в96-плаки с ямки в съответствие с концентрацията от 1 × 106 клетки/ямка в три екземпляра. Културите се стимулират с OVA (крайна концентрация 10 ug/mL), ConA (крайна концентрация 5 ug/mL) (Sigma, St Louis, MO) и LPS (крайна концентрация 100 ng/mL) за 48 часа при 37˚C . Клетките се култивират в продължение на 48 часа и към всяка ямка се добавят 20 μL (5 mg/mL) МТТ (Sigma, St Louis, MO) и се инкубират още 4 часа. След добавяне на 50 μL DMSO във всяка ямка, за да се спре развитието на цвета (Sigma), плаките се четат при 570 nm от четец на микротитърни плаки (Bio-Rad, Калифорния, САЩ). Пролиферацията на спленоцитите се изразява като индекс на стимулация (SI), който е съотношението OD570 nm на стимулирана ямка към нестимулирана ямка.

Добивите на IL-4 и IFN- в Т клетките бяха измерени чрез оцветяване с вътреклетъчни цитокини съгласно публикуван протокол с незначителни модификации [27, 28]. Суспензия от единични спленоцити се приготвя на 21-ия ден след първата ваксинация. След лизис на червените кръвни клетки, спленоцитът (2 × 106 клетки/mL) се инкубира с OVA (10 ug/mL) за 4-h стимулация и Golgi stop (BD) се добавя за 12 часа инкубация, PMA като положителна контрола. Клетките бяха събрани, промити с PBS, оцветени с CD4-FITC/CD8-FITC и фиксирани и пермеабилизирани с Cyto fix/Cytoperm комплект (BD) съгласно инструкциите на производителя. Вътреклетъчното оцветяване с цитокини се извършва с подходяща концентрация на IL-4-PE или IFN- -APC антитела при 4˚C за 20 минути. Оцветените клетки бяха открити от FACs. Анализът на данните беше извършен във FlowJo.

Оценка на съзряването на DC и Treg клетки в далака

За анализа на съзряването на DC от спленоцити в мишки, оцветяването на клетъчната повърхност беше извършено с CD11c-PE, CD40-FITC и CD80-APC антитела. На ден 3 след първата ваксинация се получава суспензия от единични спленоцити (1 × 106 клетки/mL) и клетките се подлагат на двойно оцветяване. Флуоресцентните интензитети бяха измерени от FACs Calibur и измерените данни бяха анализирани от FlowJo.

За да се наблюдава дали WPCD може да регулира надолу честотата на CD4 плюс CD25 плюс Foxp3 плюс Treg клетки. Суспензия от единични спленоцити се приготвя на 7-ия ден след втората ваксинация. Спленоцитът (2 × 106 клетки/mL) беше подложен на оцветяване на клетъчната повърхност с CD4-APC антитяло, последвано от оцветяване с ядрени цитокини с подходящи CD25-FITC и Foxp3-PE антитела с миши регулаторен комплект за оцветяване на Т-клетки (eBios ciences) съгласно инструкциите на производителя. Честотата на CD4 плюс CD25 плюс Foxp3 плюс Treg клетки беше тествана на FACs. Анализът на данните беше извършен във FlowJo.

Статистически анализ

Тестовете за еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) (Tukey's Multiple-Comparison Test) бяха извършени, за да се анализират разликите между множество експериментални групи. Всички стойности са изразени като средно ±SD. П< 0.05="" is="" believed="" to="" be="" statistically="" significant.="" the="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" prism="" 5.0="">

Резултати

WPCD насърчава съзряването и функцията на BM-DCs in vitro

Адаптивният имунитет се определя от активирането на DC, включително видовете костимулиращи молекули и цитокини [29, 30]. Първоначално изследвахме дали WPCD може да насърчи експресията на костимулиращи молекули. В съответствие с различни дози WPCD бяха приложени BM-DCs от C57BL/6. Нивата на експресия на CD11c, CD86, CD80, CD40 и MHC-II в клетките бяха анализирани (Фигура 1). Клетките, затворени с SSC и FSC, показват, че лечението с различни дози WPCD не променя морфологията на BM-DCs (данните не са показани). Нивата на експресия на CD86, CD80 и CD40 бяха значително повишени по дозозависим начин в сравнение с нелекуваната група и достигнаха платото при доза от 20 ug/mL WPCD, но разликата беше не е значимо в сравнение с LPS групата (Фигура 1A–1C). Нивото на експресия на MHC-II беше значително повишено до максималната си стойност при доза от 50 ug/mL (Фигура 1D). Резултатите от анализа на маркерите на клетъчната повърхност показват, че DCs, третирани с LPS или WPCD, показват значително повишени нива на експресия на CD86, CD80, CD40 и MHC-II и насърчават фенотипното съзряване.

Някои адюванти могат да увеличат костимулиращите молекули на DC или директно да индуцират секрецията на цитокини. IL-12 и TNF- са основните цитокини за активиране на Th1 имунния отговор. Ние анализирахме добивите на цитокини в BM-DCs при лечение с WPCD. След като BM– DC бяха третирани с различно съдържание на WPCD в продължение на 12 часа, супернатантата беше събрана за откриване на съдържанието на IL-12 и TNF- с ELISA комплект. WPCD може в зависимост от дозата да увеличи производството на IL-12 (Фигура 2A) и TNF- (Фигура 2B). Резултатите показват, че WPCD може да индуцира функционалното съзряване на DC

При имунен отговор е необходимо да се активират функционално DC. След това по-високото ниво на алогенна Т клетъчна пролиферация се индуцира от напълно зрели DC. Следователно, функционалният отговор на DC към WPCD беше изследван от MLR. Алостимулиращата способност на WPCD-индуцирани DCs, подобно на LPS, беше подобрена драстично по дозозависим начин при посоченото съотношение (Фигура 2C и 2D). Резултатите показват, че WPCD подобрява представянето на антиген и оптимизира Т-клетъчния отговор от MLR in vitro.

WPCD насърчава узряването на DC чрез TLR4 път

От горните резултати може да се заключи, че BM-DCs, активирани от WPCD, показват подобни експресии на повърхностни молекули на DCs като LPS (TLR4 лиганд). По този начин ние предположихме, че BM-DCs се активират от WPCD чрез TLR4 пътя. След като BM-DC бяха предварително третирани с TAK-242 (TLR4 инхибитор) и съвместно култивирани с WPCD и LPS в продължение на 12 часа, експресията на CD40, CD86, TNF-a или IL{{12 }} бяха открити чрез FAC или ELISA. Както е показано на Фигура 3A и 3B, лечението с TAK-242 води до значително понижени експресии на CD40 и CD86, индуцирани от LPS или WPCD, и производство на цитокини на IL-12 или TNF-a също бяха значително намалени (Фигура 3C и 3D). Резултатите показват, че WPCD може да активира DC съзряване чрез TLR4 пътя.

WPCD засилва хуморалния и клетъчния имунитет

За целите на сравнението, ние оценихме ефектите на WPCD върху предизвикването на хуморален имунен отговор при OVA-имунизирани мишки. Преди ваксинацията и на дните 14, 21, 35 и 49 след първата ваксинация се взема кръв за откриване на IgG титър и IgG подкласове серум чрез ELISA. Отговорът на IgG антитялото към OVA се повишава с увеличаването на дозата на приложение на WPCD (100 и 400 ug) по дозозависим начин (Фигура 4). Оптималната концентрация е 100 ug/mL WPCD и повишава IgG отговорите два пъти в сравнение с OVA самостоятелно на дни 21, 35 и 49 (Фигура 4А). Бяха получени значителни повишения в нивата на OVA-специфични IgG1 и IgG2a антитела при 20 и 100 ug от прилагането на WPCD в сравнение с OVA групата в серума на Ден 35 (Фигура 4В). Междувременно Alum насърчава само нивата на експресия на OVA-специфични IgG и IgG1 антитела в имунизираните мишки. WPCD самостоятелно не предизвиква OVA-специфични антитела. Горните резултати очевидно показват, че WPCD генерира по-високи титри на антитела и по-балансирани Th1/Th2 отговори от Alum.

Пролиферацията на спленоцитите е друг показател за клетъчния имунитет. ConA стимулира Т-клетките, а LPS стимулира В-клетъчната пролиферация. На 21-ия ден след първата ваксинация беше получена суспензия от единичен спленоцит и съответно стимулирана с OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL) пептид, ConA (5 ug/mL) и LPS (5 ug/mL) за 48 часа. След това пролиферацията на Т клетки се измерва чрез МТТ метода. WPCD може значително да насърчи OVA-антиген, Con A-митоген и LPS митоген-стимулирана пролиферация на спленоцити в мишките, имунизирани с OVA и WPCD (Фигура 5) и оптималната концентрация на WPCD е 100 ug/mL. Тези данни показват, че WPCD като адювант на ваксина при OVA-имунизирани мишки може по-ефективно да индуцира активирането на Т-клетки и В клетки, отколкото Alum.

Всички тествани WCPD адюванти, формулирани с OVA ваксини, генерират еднакво силен хуморален и клетъчен имунитет (фигури 4 и 5). Въз основа на тези данни, за по-нататъшна оценка на влиянието на WPCD върху OVA-специфичния Т хелперен (Th) клетъчен отговор, ние допълнително анализирахме експресиите на цитокини в CD8 плюс и CD4 плюс Т клетки чрез поточна цитометрия (Фигура 6). На 21-ия ден след първата ваксинация се изолира единичен спленоцит от мишки и след това се култивира съвместно с OVA (10 ug/mL). Добивът на IL-4 в CD4 плюс Т клетки в групата, на която са приложени 100 ug OVA/WPCD, е значително по-висок от този в групата OVA/Alum и OVA групата и подобен на този в PMA (Фигура 6А). Освен това, добивът на IFN- в CD8 плюс и CD4 плюс Т клетки също е значително повишен при мишките, на които е приложен OVA/WPCD (20, 100 и 400 ug) (Фигура 6В и 6С). В сравнение с Alum адювант, WPCD показа по-добра способност за индуциране на IL-4 и IFN-секреции от Т клетки.

WPCD стимулира узряването на DC и намалява честотата на Treg in vivo

DCS е признат за най-мощните APC, участващи в инициирането на първичен имунен отговор. По този начин, на ден 3 след първата ваксинация, ние също изследвахме ефектите на WPCD върху CD40 и CD80 върху DCs в далака при мишки (Фигура 7A и 7B). Мишките в 100-ug OVA/WPCD групата произвеждат значително по-високи нива на CD40 и CD80 на DCs от тези в OVA/Alum групата. Тези данни показват, че WPCD може да активира DC и да индуцира съзряване на DC в мишки. Treg клетките могат да балансират толерантността и имунните реакции. За по-нататъшно изследване как WPCD модулира имунния отговор, Treg клетките в далака на мишки бяха оцветени с миши регулаторен комплект за оцветяване на Т клетки. На ден 21 след първата ваксинация се наблюдава намалена честота на CD25 плюс Foxp3 плюс Treg клетки в общите CD4 плюс Т клетки (Фигура 7C). В сравнение с групите OVA и OVA/Alum, групата WPCD показва значително намалена честота на Treg.

Оценка на безопасността на WPCD при мишки

За да оценим оралната остра токсичност, проведохме тест за остра токсичност. Мишките, на които са приложени перорално 5000 mg/kg телесно тегло, не показват необичайно поведение или странични ефекти и не е открита смъртност при теста за оценка на токсичността. Не е регистрирана значителна разлика в наддаването на телесно тегло, индекса на тимуса и индекса на далака сред различните групи мишки, на които са прилагани различни дози WPCD и няма значителна разлика (Таблица 1). Не се наблюдава смъртност след 14 дни. Следователно стойността на LD50 на WPCD е повече от 5000 mg на kg телесно тегло.

За да се провери дали WPCD има отрицателни ефекти върху растежа на мишките, преди и след подкожна ваксинация, телесното тегло се определя съответно за всяка мишка (Таблица 2). При последващото наблюдение на мишките не са наблюдавани странични ефекти или необичайно поведение. Освен това телесното тегло на мишките, на които е приложен WPCD, и мишките, на които е приложен физиологичен разтвор или OVA/Alum, не показва значителна разлика. Тези резултати от наблюдение показват, че прилагането на WPCD е безопасно.

Дискусия

Адювантите са ключови компоненти във ваксините [31]. Благодарение на напредъка в геномиката и протеомиката се идентифицират все повече и повече рекомбинанти и синтетични ваксини. Следователно са необходими повече адюванти и формулировки. Някои мощни адюванти обикновено са свързани с повишена токсичност, например FCA. Следователно е необходимо да се намери безопасна формула, съдържаща различни синергични компоненти, които в крайна сметка да стимулират желания имунен отговор. Полизахаридите от китайски билки са нетоксични и не показват значителни странични ефекти [32,28]. За определена ваксина е необходим безопасен адювант.

Cistanche deserticola е важна тонизираща билка и широко разпространена в сухите земи и топлите пустини в северозападния Китай. Cistanche deserticola е широко загрижен поради неговата биоактивност, включително имуномодулаторни, антиоксидантни, антибактериални и антитуморни ефекти [20,21]. Постигнат е известен напредък в структурната характеристика и имунологичната активност на Cistanche deserticola, който е добър кандидат за разработване на адюванти. Ние експериментално оценихме адювантните ефекти и механизма на WPCD in vitro и in vivo. Подкожното приложение на WPCD значително насърчава хуморалните и клетъчните имунни отговори чрез увеличаване на серумните антитела и лимфоцитната пролиферация, засилване на експресията на цитокини, регулиране нагоре на съзряването на DC и понижаване на честотата на CD4 плюс CD25 плюс Foxp3 плюс Treg клетки.

DCS са ключови APC за подготовка на наивни Т клетки. Активирането на DC е важно за адювантите. DCS, особено DCs, получени от миши костен мозък, често се използват за оценка на адюванти и ваксини. Поточната цитометрия може да различи клетките, които са били активирани след улавяне на антиген от околните клетки. При FCM анализа степента на агрегация на стимулираните клетки е индиректен индикатор за оценка на безопасността на имуномодулаторите [3]. По този начин данните за адювантната активност на WPCD в DCs in vitro могат да предоставят ценна информация за животински модели. Въз основа на BM-DC модела, нивата на експресия на MHC-II, CD86, CD80 и CD40, производството на цитокини и алогенната Т клетъчна пролиферация бяха открити в оптималния обхват на концентрация на WPCD. Нивата на експресия на MHC-II, CD86, CD80 и CD40 бяха регулирани нагоре в BM-DCs и добивите на TNF-a и IL-12 бяха увеличени в зависимост от дозата. Наблюдава се алогенна Т клетъчна пролиферация. Морфологията на BM-DCs не е променена. Чрез индуциране на активиране на BM-DCs и секреция на възпалителни цитокини in vitro, WPCD адювантът може значително да увеличи количеството антиген и количеството APCs и да стимулира Т клетките да секретират IFN-, което допринася за повишаване на имуномодулаторната активност.

Различни китайски тревисти полизахариди са способни да активират имунната система и притежават отлични адювантни способности чрез стимулиране на узряването на DC по пътя на TLR4 [33,28]. По този начин ние приемаме, че TLR4 участва в сигналния път на WPCD-индуцираното съзряване на DC. Както се очакваше, лечението с TLR4 инхибитор доведе до значително намаляване на TNF-a и IL-12. Освен това, инхибирането на пътя на TLR4 също възпрепятства експресията на CD 40 и CD80 върху DCs, което показва, че узряването на DCs зависи от TLR4. Следователно е очевидно, че TLR4 участва в съзряването на индуцираните от WPCD DC.

Оптималната доза на адювантите и формулировката на ваксината се определя емпирично в много експерименти. За да изследваме връзката доза-отговор на WPCD адювант и OVA антигени при мишки, ние избрахме различни WPCD дози въз основа на предишни докладвани данни от BM-DCs in vitro за подкожно прилагане на ICR мишки два пъти. Ние открихме, че WPCD значително повишава добива на OVA-специфични антитела и индуцира балансиран Th1/Th2 имунен отговор с повишаване на нивата на IgG1 и IgG2a. По-специално, нивото на IgG2a е по-високо от това, лекувано със стипца в оптималната доза. Следователно, WPCD доведе до по-високи нива на специфични антитела и по-висока ефикасност с по-ниските инжекции.

Новите ваксини изискват индуциране на силни клетъчни отговори, които включват антитела, Т хелперни (Th) клетки и цитотоксични Т лимфоцити (CTL). Терапевтичната ваксина има за цел да предизвика по-силни Т-клетъчни отговори. Идеалният адювант повишава ефикасността на ваксината и насърчава клетъчно-медиирания имунитет, без да причинява токсични ефекти [34]. Сред наблюденията при модели на имунизирани мишки, WPCD води до увеличаване на OVA-специфичната и неспецифичната спленоцитна пролиферация в сравнение с Alum. Някои адюванти повишават цитокините и имунната система. Например, сапонините могат да стимулират клетъчно-медиирани имунни отговори към антиген, който обикновено индуцира само антитела. Избрахме IL-4 и IFN- като индикатори за индиректна оценка на нивата на имунитет при мишки. WPCD може да индуцира повече секреции на IL-4 и IFN- от Alum. По този начин се наблюдават силни хелперни Т-клетъчни отговори и секреция на цитокини в резултат на WPCD ваксинация, което предполага, че WPCD може по-ефективно да стимулира лимфоцитите да секретират Th1-тип цитокин и Th2-тип цитокин отколкото стипца

Адювантите, влияещи върху представянето на антигена, могат да повлияят на сложни имунни процеси. Treg клетките могат да модулират Th1 и Th2 отговорите [35]. Подходяща доза WPCD може да насърчи узряването на DC в мишки чрез повишаване на нивата на експресия на CD80 и CD40 и усилване на способността за представяне на OVA антиген в ранния имунен отговор. Експерименталните резултати от активирането на DCS и честотата на Treg показват, че WPCD индуцира узряването на DCs и намалява честотата на Treg в далака при мишки. Тези резултати доказаха, че WPCD повишава ефикасността на OVA ваксините чрез увеличаване на насочването към антиген-представящи клетки и насърчаване на Т-клетъчно специфично активиране.

При разработването на адюванти е трудно селективно да се предизвика подходящият имунен отговор срещу съответната инфекция. Подходящият адювант трябва да има ниски странични ефекти и токсичност за хора или животни. Следователно трябва да се има предвид безопасността на WPCD, включително незабавни и дългосрочни странични ефекти. В това проучване изследвахме острата токсичност на WPCD и отрицателния ефект на WPCD върху растежа на мишки в продължение на 110 дни. Резултатите от острата токсичност на WPCD показват, че телесното тегло, индексът на тимуса или индексът на далака нямат значителна разлика. Стойността на LD50 на WPCD е повече от 5000 mg на kg телесно тегло. По време на последващото експериментално наблюдение на мишките не са открити странични ефекти или необичайно поведение при мишки. Тези резултати показват, че WPCD е безопасен.

В заключение, в това изследване, WPCD, суров полизахарид, извлечен от C. deserticola от Xinjiang, показва някои свойства на адюванти. Например, WPCD усилва както Th1, така и Th2 отговорите чрез активиране на DCs, увеличаване на отговорите на антителата, подобряване на производството на цитокини. Освен това, ние изследвахме механизма на ефикасността на WPCD чрез анализиране на съзряването и функционирането на DCs чрез пътя на TLR4 in vitro. При мишките, третирани само с WPCD, не се наблюдава очевиден страничен ефект. Следователно WPCD притежава по-висока имуностимулираща активност в клетъчните и хуморалните имунни отговори. Адювантите са смес от няколко съединения. Смес от няколко сурови екстракта може да има по-големи благоприятни ефекти от единичен растителен екстракт. Необходимо е систематично да се изследват екстрактите от WPCD, да се тества тяхната ефикасност и безопасност и да се изяснят механизмите на тяхното въздействие.

Подкрепяща информация

S1 файл. ПРИСТИГАНЕ Контролен списък. (DOCX)

Благодарности

Със специални благодарности на Bing Wang и Daocheng Wu за предоставянето на добри идеи в експериментите.

Авторски принос

Концептуализация: Ailian Zhang, Bin Wang, Daocheng Wu.

Куриране на данни: Xiumei Yang, Yu Yang. Формален анализ: Ailian Zhang, Quanxiao Li.

Придобиване на финансиране: Ailian Zhang. Администрация на проекта: Ailian Zhang.

Ресурси: Ailian Zhang, Gan Zhao. Писане – оригинална чернова: Ailian Zhang.

Писане – преглед и редакция: Ailian Zhang, Daocheng Wu.