Анализът In Silico на пептид от паразитна отрова на Drosophila разкрива разпространението на катионно-полярен катионен клипс мотив в протеини Knottin, част 1

Резюме:

Като обикновени паразитоидни оси, Leptopilina heteroatom е много успешен при много видове плодови мушици от рода Drosophila. Паразитоидите произвеждат специализирани многостратегически екстрацелуларни везикулоподобни (EV) структури в тяхната отрова. Протеомният анализ идентифицира няколко протеини, свързани с имунитета, включително пептида нотин, LhKNOT, съдържащ структурно запазения инхибитор на цистеиновия възел (ICK), който присъства в протеини от различни таксони. Нашият структурен и докинг анализ на 36-остатъчната гънка на възела на ядрото на LhKNOT разкри, че в допълнение към самия мотив на възел, той също така притежава катион-полярно-катион (CPC) клип.

Инхибиторът цистеин е естествено вещество, използвано за предотвратяване на окислително увреждане и насърчаване на клетъчния растеж. За имунитета ролята на цистеина се отразява главно в подобряване на имунитета на организма и предотвратяване на възпаления и инфекции.

През последните години все повече проучвания показват, че цистеинът може да играе важна роля в имунната система. Той може да насърчи пролиферацията на имунните клетки, да повиши устойчивостта на организма към патогени и да намали риска от инфекция. В допълнение, цистеинът може също да намали производството на свободни радикали и да подобри цялостното здраве на имунната система, като по този начин повишава имунитета на организма.

Въпреки че ефектът на цистеина върху имунитета е много значителен, когато се използва инхибитор цистеин, той трябва да се използва с повишено внимание. Тъй като инхибиторът цистеин обикновено се използва за лечение на определени заболявания, като сърдечно-съдови заболявания, артрит и т.н., ако се злоупотребява, той ще повлияе на имунитета и ще доведе до отслабване на имунната система на организма, като по този начин ще увеличи риска от инфекция.

В заключение, съществува неразривна връзка между инхибитора цистеин и имунитета. Въпреки че инхибиторите на цистеин могат да подобрят здравето на тялото, те също трябва да се използват под ръководството на лекар и трябва да се обърне внимание на поддържането на разумна доза за поддържане на здравето на тялото. Вижда се, че трябва да подобрим имунитета. Cistanche може значително да подобри имунитета, тъй като пепелта от месо съдържа различни биологично активни съставки, като полизахариди, две гъби, Huang Li и др. Тези съставки могат да стимулират различни имунни системи. клетъчно-подобни клетки, повишаващи тяхната имунна активност.

Кликнете върху ползите за здравето от цистанче

Смята се, че CPC клип мотивът улеснява антимикробната активност в хепарин-свързващите протеини. Изненадващо, по-голямата част от тестваните ICK също притежават CPC клип мотив, включително 75 добросъвестни растителни и членестоноги протеини, които споделят висока последователност и/или структурно сходство с LhKNOT. Подобно на LhKNOT и тези други 75 белтъка от възел, дори противогъбичният пептид на Drosophila Drosomycin, каноничен целеви ген на TollNF-kappa B имунния път на мухата, съдържа този CPC клип мотив. Заедно нашите резултати предполагат възможна отбранителна функция за паразитоида LhKNOT.

Разпространението на мотива на CPC клипса, присъщ на цистеиновия възел в рамките на изследваните тук нотин протеини, предполага, че получената 3D топология е важна за техните биохимични функции. CPC клипът вероятно е силно запазен структурен мотив, открит в много различни протеини с докладван капацитет за свързване на хепарин, включително амилоидни протеини. Knottins са мишени за разработване на терапевтични лекарства и прозренията в техните взаимоотношения структура-функция ще допринесат за нов дизайн на лекарства.

Ключови думи:

гостоприемник–паразит; дрозофила; лептопилина; цистеинов възел; гънка на възли; Cation–Polar–Cation скоба; антимикробен пептид; хепарин-свързващ мотив; мини протеини.

1. Въведение

При взаимодействия гостоприемник-паразит, паразитът трябва да осигури офанзивен натиск, като същевременно поддържа гостоприемника жив, за да поддържа жизнеспособно потомство [1,2]. Такива противоречиви цели са довели до еволюцията на вирулентни фактори с различни молекулярни стратегии, като същевременно поддържат висока специфичност на гостоприемника. Паразитните Hymenoptera представляват повече от един милион вида, разпространени са повсеместно на планетата и паразитират в различни членестоноги, главно насекоми [3].

Осите, атакуващи гостоприемници на насекоми, са разработили набор от поведенчески и биохимични стратегии за успех и остават под постоянен коеволюционен натиск със своите гостоприемници [4–7].

Системата Leptopilina/Drosophila е нововъзникващ модел за разбиране на молекулярните основи на реакциите срещу осите и стратегиите за вирулентност на осите [8]. За да потиснат имунитета на гостоприемника, женските Leptopilina въвеждат отровни фактори в своите ларви гостоприемници по време на яйцеполагане [4,9,10]. Добре дефинираните вродени имунни механизми в Drosophila [11–13] предоставят ценен контекст за изследване на ефектите от тези фактори на отровата на оси.

Инфекцията от специалиста L. boulardi активира хуморалните и клетъчните имунни рамена, контролирани от запазения Toll-NF-κB сигнален път на мухата. Експресията на антимикробен пептид (AMP) гени като дрозомицин се активира след инфекция с L. boulardi [14]. Сигнализацията на Toll-NF-κB също контролира деленето и развитието на кръвните клетки [15,16], стъпки, които контролират капсулирането и смъртта на яйцата на оси [17,18].

Обратно, инфекцията от обикновения L. heteroatom потиска и двата имунни пътя [9,14] и почти всички ларвни кръвни клетки се унищожават от фактори в отровата на осите [19,20].

В това изследване ние анализираме теоретичната структура на L. хетероатомен пептид, наречен LhKNOT, идентифициран в органелоподобни секрети в L. heteroatom отрова, но не и в L. boulardi отрова [21]. Тези имуносупресивни органели включват повече от 350 протеина и притежават протеомичен профил на еукариотни микровезикули и множество протеини, свързани с имунитета [21–23].

LhKNOT приема мотива "Inhibitor Cysteine ​​Knot" (knottin) [24]. Мотивът на възела е широко запазен в редица таксони, от растения [25,26] до охлюви [27]. Тези малки пептиди (<60 residues) are functionally diverse. Knottins are used offensively, in spider toxins [28] and cone snail venom [27], as well as defensively, e.g., in wound healing activities of cacti [26], and antimicrobial host defense in plants [25,26,29] and invertebrates [30].

Широкият обхват на активност на възел се приписва на цялостната структура на неговата гънка, която разчита единствено на запазен мотив от шест цистеинови остатъка, който се възползва от уникалната способност на тези цистеини да образуват дисулфидни мостове. Мотивът на възела възниква, когато цистеинови остатъци се наблюдават в C1-C2-C3-C4-C5-C6 модел (където "-" представлява няколко силно променливи остатъци).

След това се образуват дисулфидни мостове по подобен консервативен начин (C1-C4, C2-C5 и C3-C6), което води до C1-C4 и C{{ 8}}C5 образува макроцикъл, докато C3-C6 се среща в рамките на този макроцикъл, което води до „заплетена“ топология. Тъй като тази заплетена топология до голяма степен зависи от запазването на шестте цистеинови остатъка, мотивът на възела позволява значителни вариации в цялостната последователност [30]. Комбинацията от техния малък размер, висока толерантност към вариация на последователностите и наблюдаваната структурна стабилност направи възлите популярно скеле за дизайн на лекарства [30], потенциално дори за лечение на рак [31].

Различни линии от експериментални доказателства демонстрират или предполагат антимикробни способности за различни възли [25,26,29,30,32,33] или взаимодействия на затворени йонни канали [28,34], въпреки че молекулярните механизми, чрез които се извършват тези функции, не са добре разбран. Освен това не е известно дали тези антимикробни функции имат общ механизъм на действие.

Като се има предвид откриването му от имуносупресивни частици от паразити на мухи, нашите цели бяха да (а) идентифицираме LhKNOT-свързани последователности от различни организми, включително L. heteroatom, L. boulardi и Ganaspis паразитоиди, които атакуват Drosophila и (b) да идентифицираме всякакви нов структурен мотив(и), присъстващ в известните или нови хомолози на LhKNOT с надеждата, че прогнозирането на такъв запазен мотив може да предложи възможни функции за LhKNOT и да насочи бъдещи експериментални изследвания.

Ние показваме, че теоретичен модел на LhKNOT притежава отличителните белези на възловата гънка с три антипаралелни бета листа, ограничени от дисулфидни мостове. Моделът LhKNOT съдържа CPC скоба, способна да взаимодейства с хепарин, отрицателно зареден гликозаминогликан (GAG) със значителна медицинска стойност. LhKNOT също има потенциал за взаимодействие с други GAG, като кератан сулфат (GAG, който е силно сулфатиран, подобно на хепарина) и хиалуронова киселина (единственият представител на GAG, който не изисква сулфатиране) [35].

Освен това, структурни хомолози на LhKNOT (т.е. добросъвестни протеини с мотив на възел) също притежават CPC клип мотив, който може да се свързва с хепарин. Изненадващо, подобно на LhKNOT и тези други добросъвестни протеини на възли, дори противогъбичният пептид Drosophila Drosomycin споделя този CPC клип мотив в своята структура. Този мотив също беше идентифициран в 41 от 46 допълнителни LhKNOT хомолози от L. heteroatom, L. boulardi и Ganaspis spp. оси успешно върху D. melanogaster.

Тези in silico-базирани наблюдения предполагат, че CPC клип мотивът, присъщ на много възли, може да осигури структурната основа за модифициране на имунни или вирулентни функции. Спекулираме с възможна антимикробна или свързана с вирулентността функция за LhKNOT на осите. Изобилието от възловата гънка и нейното съвпадение с мотива на CPC скоба в повечето от новооткритите пептиди на възел от три Drosophila паразитоида предполага важна, все още неопределена роля за тях във физиологията на паразитите и/или в гостоприемника-паразит взаимодействия.

2. Резултати
2.1. Последователността на LhKNOT показва сходство с антимикробните пептиди от насекоми и растения

BLASTp търсене в базите данни nr и TSA, използвайки пълната дължина на LhKNOT последователността (60 аминокиселини), показа ограничен брой значими попадения, предимно анотирани като "антимикробни пептиди", от растения и насекоми. Бяха идентифицирани и няколко гъбични последователности. Всички резултати показват по-малко от 60 процента аминокиселинна идентичност с LhKNOT. Най-доброто съвпадение за LhKNOT в базата данни nr беше антимикробен пептид от обикновения бръмбар, Callosobruchus maculates, докато най-добрият хит в базата данни на TSA беше антимикробен пептид от житния акар Aceria Coachella.

Консервацията беше най-видна в областта на единствения мотив на последователността, свързан с LhKNOT, цистеиновият възел "противогъбичен пептид" подпис (pfam11410 домейн, E=2.8 × 10-3). След стартиране на PSI-BLAST за откриване на отдалечени хомолози бяха разкрити допълнителни последователности. PSI-BLAST показа подобни резултати с обикновеното ледено растение, Mesembryanthemum crystallinum; червени акари, Dinothrombium tinctorium; паразитоидна оса, Trichogramma pretiosum; клик бръмбар, Ignelater светещ; паразитоидна оса, Trichogramma brassicae; обикновен бръмбар, Brassicogethes aeneus; пепелянка, Agrilus planipennis; и трион, Neodiprion lecontei.

Използвайки уеб сървъра HMMER, управляван от скрити модели на Марков, като алтернативен метод за откриване на отдалечени хомолози, ние идентифицирахме пет гъбични удара от Akanthomyces lecanii, Cordyceps javanica, Cordyceps confragosa, Rosellinia necatrix и Beauveria bassiana.

Търсене в PDB за подобни последователности извлече само два значими резултата, единият за противогъбичен пептид от типа на възела Alo-3 от насекомото Acrocinus longimanus и вторият от дисулфид-ограничения пептид за зарастване на рани pB1 от Pereskia bleo. Подробностите за всички близки и отдалечени хомолози, идентифицирани с помощта на различните подходи за сходство на последователности, са обобщени в допълнителна таблица S1.

Подравняването на LhKNOT към известните структури на типичните възли, както и идентифицираните хомолози показаха запазването на шестте цистеина, които образуват трите дисулфидни моста в LhKNOT (Фигура 1А). На своя N-край LhKNOT съдържа дълъг, спирален сегмент, за който се предвижда да функционира като сигнална последователност; вътрешно той съдържа три бета-листа, както се очаква от вторичната структура на пептидите на възела (Фигура 1B).

Освен това, оценка на сходството на последователността на LhKNOT, насочена към наличните L. heteroatom и L. boulardi транскрипти и от друг Drosophila паразитоид, Ganaspis spp. (вижте Методи), разкрива изобилие от свързани последователности. За L. heterotoma (Lh14), ние идентифицирахме 16 допълнителни Lh14 нотин протеини (допълнителна таблица S2).
За L. boulardi идентифицирахме 22 белтъка от възел (допълнителна таблица S3). Шест LhKNOT хомолога бяха идентифицирани по подобен начин от Ganaspis hookeri (G1) и два LhKNOT хомолога бяха открити в протеиновите прогнози, направени от генома на G. brasiliensis (VA) (допълнителна таблица S4). Фигура 2 показва запазването на тези паразитоидни последователности на възли с LhKNOT. По този начин изглежда, че поне малкото паразитоиди на Drosophila, взети в това изследване, кодират множество протеини на възли. Допълнителни такива пептиди на възли могат да бъдат кодирани от тези оси и са необходими систематични протеомни/биоинформационни подходи за получаване на изчерпателен списък. Функциите на тези предполагаеми възли във физиологията на паразитите остават неизвестни.

Фигура 1. (A) Подравняване на множество последователности на LhKNOT (отгоре) и хомолози в семейството на нотин (отгоре до долу): Mesembryanthemum crystallinum (растение; антимикробен; NCBI ID: AAC19399), Aceria tosichella (кърлеж; антимикробен; NCBI ID :MDE48292.1), Callosobruchus maculatus (бръмбар; неизвестен; NCBI ID:VEN35376.1), Dinothrombium tinctorium (кърлеж; неизвестен; NCBI ID:RWS16713.1), Trichogramma pretiosum (Alo{{10}} като; паразитоидна оса; антимикробен; NCBI ID: XP_014233229.1), Ignelater luminosus (бръмбар; неизвестен; NCBI ID: KAF2884324.1), Trichogramma brassicae (паразитоидна оса; неизвестен; NCBI ID: CAB{{27 }}{{30}}31014.1), Brassicogethes aeneus (бръмбар; неизвестен; NCBI ID: CAH0563829.1), Agrilus planipennis (ясенов пробив; антимикробен; NCBI ID : XP_018321119.1), Neodiprion lecontei (трион; неизвестен; NCBI ID: XP_015517007.2), Akanthomyces lecanii (гъба; противогъбично; Uniprot ID: A0A168C5L6), Cordyceps javanica (гъба; противогъбично) ; Uniprot ID: A0A545VVU1), Cordyceps confragosa (гъба; неизвестен; Uniprot ID: A0A179IJT7), Rosellinia necatrix (гъба; неизвестен; Uniprot ID: A0A1S8A723), Beauveria bassiana (гъба; неизвестен; Uniprot ID: A0A0A2VUF6), Acrocinus longimanus (Alo-3; бръмбар; противогъбично; PDB ID: 1Q3J) и Pereskia bleo (pB1; кактус; PDB ID: 5XBD). Идентични остатъци са подчертани в червено, докато химически подобни остатъци са подчертани в жълто. Черните стрелки обозначават запазените цистеинови остатъци, които са отговорни за структурната гънка на възела, а свързването на дисулфидния мост на трите дисулфидни моста е маркирано с неоново зелени числа.

X и XX означават променливия брой остатъци при N- и C-края, съответно. Вторичните структурни елементи на моделирания LhKNOT са показани в горната част. и Т представляват съответно -нишка и -завой. (B) Прогноза за вторична структура за LhKNOT, показваща дълъг спирален сегмент (розов цилиндър; сигнален пептид), последван от три бета нишки (жълти стрелки). Тази вторична структура следва каноничния подпис на Knottin [36]. (C) Прототип на структурната гънка на knottin от базата данни KNOTTIN [36] (разрешение за възпроизвеждане на това изображение, дадено от д-р Жан-Кристоф Гели, INSERM, октомври 2019 г.). Двата дисулфидни моста (зелени) образуват макроцикъл, докато трети (син) тегли през центъра, давайки на протеина неговата едноименна заплетена топология. (D) Предсказаната третична структура на LhKNOT, показваща заплетената топология и запазения цистеинов мотив, цистеиновите остатъци образуват дисулфидни мостове в запазения модел, наблюдаван в семейството на възли (C1 -C4 и C2 -C5 форма макроцикълът, C3 -C6 минава през центъра).

Фигура 2. (A) Подравняване на множество последователности на LhKNOT (отгоре) и хомолози в Lh14. (B) Подравняване на множество последователности на LhKNOT (отгоре) и хомолози в L. boulardi. X, отбелязан в зелената кутия, съответства на следните вмъквания в две последователности Lb17: Lb: GISX01151661.1 X=SQAPPPTPEFHPPGTPP; Lb: GISX01151653.1 X=SQLTSPRSTFPPTGSTIPSIITT. (C) Множествено подравняване на последователности на LhKNOT (отгоре) и хомолози в Ganaspis spp. Идентични остатъци са подчертани в червено, докато химически подобни остатъци са подчертани в жълто.

Черните стрелки обозначават запазените цистеинови остатъци, които са отговорни за структурната гънка на възела, а свързването на дисулфидния мост на трите дисулфидни моста е маркирано с неоново зелени числа. Вторичните структурни елементи на моделирания LhKNOT са показани в горната част. и Т представляват съответно -нишка и -завой. Сивите звезди се добавят в горната част на блокове от последователности, горните остатъци представляват остатъци, моделирани с алтернативни конформации.

2.2. Триизмерната структура на LhKNOT

Типичната структурна гънка на пептида нотин се определя от шест цистеина, участващи в три дисулфидни връзки, за да образуват цистеинов възел с три вериги, антипаралелен бета-лист [25]. Важна характеристика на тази гънка е свързаността на цистеиновите остатъци за образуване на дисулфидни мостове и дисулфидния мост на цистеини 3 и 6, преминаващи през дисулфиди 1–4 и 2–5, за да направят специален дисулфиден през дисулфиден възел (Фигура 1A, C ).

Този дисулфид, чрез характеристика на дисулфиден възел, разграничава гънката на възел от други протеини на цистеинов възел. Освен запазените цистеини, останалата част от аминокиселинната последователност може да бъде доста променлива и следователно само ограничен брой възли се идентифицират чрез подходи за сходство на последователности за LhKNOT (вижте предишния раздел и допълнителна таблица S1).

Алгоритмите за разпознаване на сгъване и подходите за моделиране, базирани на шаблони, от друга страна, извличат няколко различни възли като подходящи кандидати за моделиране на LhKNOT. Сред различните генерирани LhKNOT модели, най-добрият модел беше базиран на множество шаблони модел на LhKNOT, създаден с помощта на програмата HHpred [37] със структурни ограничения, извлечени от първите три шаблона, Alo-3 (PDB: 1Q3J) [ 30], омега-агатоксин-IVA (PDB: 1IVA) [28] и PAFP-S (PDB: 1DKC) [25]. Базираните на знания енергийни профили, изчислени с помощта на ProSA-web [38] за този избран модел, показват ниски енергии и z-резултат от −4,53, което е сравнимо с решените структури.

Verify3D [39] оцени този базиран на множество шаблони модел с положителен резултат (100.00 процента от остатъците в модела имат осреднен 3D-1 D резултат по-голям или равен на 0,2). Резултатът VoroMQA [40] от 0,325 вероятно е отражение на малкия размер на пептида и резултатите на шаблоните са в същия диапазон (допълнителна фигура S1).

Този модел, базиран на множество шаблони, типизира възловата гънка с три антипаралелни бета-нишки, ограничени от дисулфидни мостове и очакваната свързаност на дисулфидни мостове (Фигура 1D). KNOTER3D, инструмент в базата данни KNOTTIN [36] потвърди, че този модел има добросъвестна гънка на възел и потвърди идентифицирания преди това модел на дисулфидно свързване на Фигура 1D.

2.3. LhKNOT показва наличието на CPC клип, способен да взаимодейства с хепарин и други GAG

За да се търсят потенциални LhKNOT функции, бяха изследвани структурно-функционални корелации на близки структурни хомолози на LhKNOT. Протеин на възел от кактус Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26] притежава хепарин-свързващ мотив, известен като CPC клип. Този структурен мотив образува геометрично ограничена скоба от два катионни и един полярен остатък, които взаимодействат с хепарина чрез солни мостове и водородни връзки, закрепвайки го в позиция в положително заредената повърхност на скобата [41].

Структурна суперпозиция на cactus knottin и LhKNOT показа, че двете структури са много сходни, с обща разлика от по-малко от 2Å. Докинг анализът на LhKNOT с хепарин, използвайки специфичните параметри на ClusPro за хепарин като лиганд, разкри, че за LhKNOT полярните взаимодействия, отговарящи на мотива на CPC клипа, възникват в остатъци R1-S3-R14 (Фигура 3A) .

Измерените разстояния (както между алфа-въглеродите, така и центровете на масата на участващите странични вериги на остатъците) се различават от тези на CPC клипа с по-малко от 1Å, което предполага наличието на предполагаем CPC клип в LhKNOT (Фигура 3B). Повърхностната електростатика на моделирания LhKNOT също показа наличието на очаквания катионен свързващ джоб, образуван от CPC скобата [41,42] (Фигура 3C).

За да се оцени способността на CPC клипа да взаимодейства с други GAG, беше извършен допълнителен докинг анализ с LhKNOT и кератан сулфат (PDB ID: 1KES) и с LhKNOT и хиалуронова киселина (PDB ID: 1HYA). И в двата случая положително заредената свързваща повърхност, създадена от CPC скобата, е свързана с отрицателно заредените молекули. Ligplots, генерирани от PDBSum, потвърждават връзката на GAGs с CPC-образуващите остатъци (допълнителни фигури S2 и S3).

2.4. Други структурни хомолози на LhKNOT също съдържат CPC Clip Motif

Наличието на CPC клипа както в LhKNOT, така и в неговия структурен хомолог от Pereskia bleo (pB1) предполага възможността за по-широко запазване на CPC клипа в семейството на knottin. Анализ на 21 близки структурни хомолози на LhKNOT с експериментално решени PDBs в базата данни KNOTTIN разкри, че във всеки случай пептидите притежават CPC клип мотив. За повечето пептиди (напр. T. tridentatus), параметрите на мотива се отклоняват по-малко от 1Å от гънката на сърцевината, докато за други (напр. обидните възли), отклонението е до граница от 3Å (допълнителна таблица S5). По подобен начин, моделирани протеини на възел на идентифицираните хомолози показват, че почти всички от тях притежават CPC клипа.

Шестнадесет допълнителни последователности от L. heteroatom, 22 последователности от L. boulardi и 8 последователности от Ganaspis spp., без известни 3D структури, бяха моделирани и анализирани за наличието на CPC клип мотив. Докато 13 от 16-те предполагаеми L. heteroatom knottins и 2 0 от 22 предполагаеми L. boulardi knottins разкриха мотив на CPC клип, всички последователности на Ganaspis съдържаха CPC клипа (допълнителна таблица S5). Интересното е, че седемте хомолога, които не показват мотив на CPC клип, принадлежат към (a) обикновената последователност на цветен прашец (B. aeneus (CAH0563829.1), (b) гъбична последователност R. necatrix (A0A1S8A723) и (c) три L. heterotoma knottins 4,5,6 и L. boulardi knottins 3 и 20 (допълнителна таблица S5).

Проучване на възли в базата данни KNOTTIN, несвързано с LhKNOT, но представително за различни таксони (шишарен охлюв, подковонос, насекомо, растение, скорпион и паяк), показа мотива на CPC клипа. Във всички случаи, повърхностният електростатичен профил на мотива на CPC клипса е положително зареден, вероятно, за да улесни взаимодействията с отрицателно заредения хепарин (Фигура 4). Въпреки това, подобно на възлите от бръмбари, гъбички и оси, описани по-горе, CPC клипът не е идентифициран в възли от растителния циклотид и гъби (допълнителна таблица S5).

Фигура 4. Резултати от докинг хепарин и повърхностна електростатика на (A) противогъбичен пептид на Phytolacca americana (PFAP-s; растение; PDB: 1DKC), (B) селективен омега-агатоксин на Agelenopsis aperta (Омега-агатоксин IV-A) ; паяк; PDB: 1IVA), (C) противогъбичен пептид на Acrocinus longimanus (Alo-3; бръмбар; PDB: 1Q3J), (D) заздравяващ рани пептид на Pereskia bleo (pB1; кактус; PDB: 5XBD) , (E) LhKNOT, (F) противогъбичен пептид "Drosomycin" от Drosophila spp. (Drosomycin; муха; PDB: 1MYN), (G) Conotoxin GS (Conotoxin GS; конусовидни охлюви; PDB:1AG7), (H) антимикробен пептид Tachystatin A, изолиран от подковоносни раци (Tachystatin A; подковообразни раци; PDB:1CIX) и (I) Хлоротоксин, малък скорпионов токсин от Leiurus quinquestriatus (Хлоротоксин; скорпион; PDB:1CHL), показващ катионен CPC клип мотив. Цифрите са ориентирани така, че да показват най-добре структурата на CPC клипа. Повърхностните електростатични потенциали са градирани по цвят от −4 kT/e (червено) до плюс 4 kT/e (синьо).

2.5. In Silico Мутационен анализ на LhKNOT CPC клип разкрива вторичен CPC клип

Модели на три in silico LhKNOT мутанти (R1A, S3A, R14A) бяха изследвани за сравняване на свързващи взаимодействия на див тип и мутантни протеини. В случая на мутанта R14A, хепаринът беше изненадващо свързан с вторичен CPC клип, включващ R1, S3 и R30 остатъците вместо R1, S3 и R14 мотива в дивия тип (допълнителна фигура S4). Двойни или тройни мутанти (R14A-R1A; R14A-S3A-R1A), обаче, не показват взаимодействие с нито един от остатъците от първичен или вторичен мотив на CPC клип (допълнителна фигура S4C, D).

Мутантите in silico с R1A мутация (прекъсващи както първичните, така и вторичните мотиви на CPC клип), обаче, показаха хепарин, свързващ се с R29 и R30, тъй като те осигуряват единствената останала катионна повърхност (допълнителна фигура S4C, D). Интересното е, че лигандът предпочита да се асоциира с мотива на CPC клипа, както в случая на първичните, така и на вторичните клипове, върху тази допълнителна катионна повърхност, когато мотивът е наличен, което предполага, че специфичното взаимодействие на CPC клипа може да позволи по-стабилно свързване върху неспецифично електростатично взаимодействие.

For more information:1950477648nn@gmail.com