In Silico Проектиране на нова поливалентна мулти-субединица пептидна ваксина, използваща кръстосания имунитет срещу човешка висцерална и кожна лайшманиоза: подход, базиран на имуноинформатика

Резюме

Контекст Лайшманиозата е група от векторни инфекциозни заболявания, причинени от над 20 патогенни вида Leishmania, които са ендемични в много тропически и субтропични страни. Появата на резистентни към лекарства щамове, неблагоприятните странични ефекти на лекарствата против Leishmania и липсата на стратегия за превантивна ваксинация застрашават чувствителната популация. Напоследък много групи от изследователи са използвали полето на обратната ваксинология, за да разработят ваксини, като се фокусират главно върху предизвикване на имунитет срещу висцерална или кожна лайшманиоза.

cistanche tubulosa - Противовъзпалително

МетодиТази настояща работа включва извличане на дванадесет експериментално валидирани лейшманиални антигенни протеинови последователности от базата данни на UniProt, последвано от тяхното антигенно профилиране, използващо ANTIGENpro и Vaxijen 2.0 сървъри. MHC свързващите епитопи за същите бяха предсказани с помощта както на NetCTL 1.2, така и на SYFPEITHI сървъри, докато епитопите за В клетки бяха изчислени с помощта на ABCpred и BepiPred 2.0 сървъри. Скринираните епитопи със значително по-високи резултати бяха използвани за проектиране на конструкцията на ваксината с подходящи линкери и естествени адюванти. Вторичните и третичните структури на синтетичния пептид се определят чрез условни произволни полета, плитки невронни мрежи и подравняване на нишки на профила на профил с итеративни симулации на сглобяване на структура, съответно. Моделът на ваксината 3-D беше валидиран чрез CASP10-тествано усъвършенстване и уеб сървъра MolProbity. Бяха извършени молекулярно докинг и многомащабна симулация на анализ на нормален режим, за да се анализира най-добрият комплекс ваксина-TLR. И накрая, резултатите от изчислителната имунна симулация разкриват обещаващи клетъчни и хуморални имунни отговори, което предполага, че конструираният химерен пептид е потенциална широкоспектърна ваксина срещу висцерална и кожна лайшманиоза.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Ключови думи Лайшманиоза · Обратна ваксинология · TLR · Мултиепитопна ваксина · Молекулярна динамична симулация · Хомоложно моделиране

Въведение

Лайшманиозата е група от паразитни заболявания, причинени от различни членове на рода Leishmania, диморфни вътреклетъчни паразитни протозои [1]. Лайшманиозата засяга повечето популации от ниския социално-икономически статус на тропическите и субтропичните страни по света [2]. Това е векторно заболяване и паразитите се предават чрез ухапване на заразените женски флеботоминови пясъчни мухи (СЗО, 2019 г.). Според последните доклади на Световната здравна организация, 700, 000 до 1 милион нови случая и около 26, 000 до 65, 000 смъртни случая настъпват годишно (СЗО, 2019 г.). В Източна Африка огнища на висцерална лейшманиоза се появяват често. Регионът на Източното Средиземноморие представлява 70% от случаите на кожна лайшманиоза в световен мащаб (СЗО, 2019 г.). През 2017 г. 20 792 от 22 145 (94%) нови случая, съобщени на СЗО, са в седем държави: Бразилия, Етиопия, Индия, Кения, Сомалия, Южен Судан и Судан (СЗО, 2017 г.). Заради тревожния сценарий трябва да се подчертаят и мерките за овладяване и ликвидиране на болестта у нас. Лайшманиозата има различни клинични прояви и има три основни форми на заболяването – висцерална (известна също като кала-азар и най-тежката форма на заболяването), кожна (най-честата) и кожно-лигавична (СЗО, 2019 г.) . Доказателство за самоизлекуване в няколко случая на кожна лайшманиоза (CL) и произтичащият от това имунитет към повторна инфекция предполага възможния обхват на ваксинацията като осъществим метод за контрол на лайшманиозата през периода [3]. Към днешна дата обаче не е налична лицензирана ваксина срещу човешка лайшманиоза. Въпреки че няколко потенциални кандидат-ваксини са преминали към клинично изпитване, много от тях все още са в ранна фаза на изследване и развитие [4]. Генерирането на пептидни ваксини е преобладаваща и обещаваща област на изследване в тази област. За разлика от цели живи или атенюирани паразити или техните базирани на субединици ваксини, синтетичните пептиди имат няколко предимства, които включват липсата на потенциално вредни материали, по-ниска сложност на антигена, добра стабилност и ниска цена за мащабиране [1, 5]. Разработването на нови ваксини изисква по-задълбочени познания в имунологията, молекулярната биология и химическото инженерство. Следователно учените във всички тези области работят ръка за ръка, за да проектират и произвеждат безопасни, ефективни ваксини [6]. Идеалната ваксина срещу лайшманиоза трябва да предизвика дълготраен имунитет и балансиран TH-1 и TH-2-медииран имунен отговор [4, 7]. Базираният на имуноинформатика подход за проектиране на такава нова кандидат-ваксина е по-нова стратегия, която използва предимно изчислителни инструменти за прогнозиране на структурно стабилна и имуногенна мулти-субединица пептидна ваксина за кратко време. Протеините, за които първоначално е установено, че имат необходимите имуногенни характеристики за придаване на имунитет срещу болестта в предишни имунологични проучвания, включващи експериментални животински модели или други in silico анализи, са най-добрите възможни кандидати за епитоп [1, 8–10]. Сред протеините, които се изследват, протеинът LACK (активиран от Leishmania С-киназа антиген) е силно запазен протеин във видовете Leishmania и се счита за жизнеспособен кандидат за ваксина срещу човешка лайшманиоза [11]. Доказано е, че е ключова цел на имунния отговор при чувствителни BAL b/c мишки [12]. KMP-11 (кинетопластиден мембранен протеин-11) присъства във всички кинетопластидни протозои и също се счита за потенциален кандидат за ваксина, за която е доказано, че повишава нивата на IL-10 в миши модели, което показва неговия имуногенен потенциал [13]. Лейшманолизин, или GP63, е повърхностна протеиназа, която е постулирана като вирулентен фактор, участващ в директното взаимодействие на паразита с рецептора на макрофага на гостоприемника [14]. Установено е също, че мембранните протеини LCR1 и GP46 увеличават производството на IFN-гама и следователно се считат за полезни при разработването на обща ваксина срещу инфекции с Leishmania [5, 15]. Протеините на топлинен шок (HSPs) са силно запазени молекули, които са силно имуногенни за индуциране както на MHC-I, така и на MHCII пътища на адаптивен имунитет и се смята, че имат важна роля в разработването на ваксина срещу инфекциозна лайшманиоза [16]. Leishmania хидрофилен ацилиран повърхностен протеин-B (HASP-B) се експресира само в инфекциозни паразити, което предполага роля във вирулентността на паразита и следователно е потенциален кандидат за ваксина [17]. Протеините на кинетопластидната парафагеларна пръчица (PFR) също са от терапевтично и профилактично значение поради тяхното ограничено еволюционно разпространение, организация от висок ред и висока имуногенност [18]. По същия начин, цистеиновите протеази и протеофосфогликаните също действат като съществени вирулентни фактори за паразитите в бозайниците гостоприемници и са привлекателни мишени за лекарства за лайшманиоза [19–21]. Освен това, бета-тубулиновият протеин преди това също е бил характеризиран като Т-клетъчно стимулиращ антиген от Leishmania, въпреки че неговата ефикасност като кандидат за ваксина все още не е изпробвана [22]. Бета-тубулинът на L. donovani също се счита за потенциална лекарствена цел срещу висцерална лайшманиоза [23]. И накрая, доказано е, че транслационният фактор протеин eIF5A от L. braziliensis индуцира хетероложна защита срещу лайшманиоза при животни, когато се прилага като ваксина в комбинация с друг рекомбинантен протеин. Повишава секрецията на специфични за паразитите цитокини при ваксинирани животни. Протеинът eIF5A също е запазен във всички еукариоти [24]. По-рано Khatoon et al. описват базиран на имуноинформация подход за проектиране на мулти-субединица пептидна ваксина срещу висцерална лайшманиоза (VL) чрез изследване на секреторните протеини на L. donovani [6]. Тук избрахме различни лейшманиални антигени в различни инфекциозни видове на паразита. В същото време всички тези протеини вече са идентифицирани (или чрез in vitro изследвания върху животни, или чрез използване на изчислителни инструменти), за да предизвикат имунен отговор, провокирайки защитен имунитет. Избраните протеинови последователности принадлежат към всеки от петте патогенни вида на Leishmania, а именно Leishmania major, Leishmania Mexicana, Leishmania donovani, Leishmania chagasi и Leishmania amazons, сред които L. donovani е основният паразит, причиняващ висцерална лайшманиоза (VL), докато другите са основно отговорни за причиняването на кожна (CL) или мукокутанна лайшманиоза (MCL). Обосновката зад избора на такива разнообразни типове запазени и имуногенни протеини в различни видове Leishmania беше да се създаде обща пептидна ваксина, която да осигури широкоспектърен кръстосан имунитет срещу двете форми на лайшманиоза (VL и CL), които обикновено засягат хората .

Какво прави билката цистанче—Против- възпалителни

Материали и методи

Селекция и извличане на антигенни протеинови последователности на Leishmania

Пълните аминокиселинни последователности на дванадесет специфични за Leishmania антигенни протеини бяха извлечени от базата данни Uniprot (Universal Protein Resource) (https://www.unipr ot.org/uniprot/) във формат FASTA (достъпен на 21.{{16} }3.2022). Както беше посочено по-рано, всички тези протеини бяха докладвани като имуногенни, силно запазени и потенциални кандидати за ваксина, както беше установено в предишни имунологични проучвания, включващи животински модели или изчислителни in silico методи за прогнозиране. Антигенността на избраните протеини беше изчислена чрез използване на сървъра ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/), който изчислява антигенността на входна протеинова последователност чрез използване на базиран на SVM двустепенен класификатор, валидиран десетократно подход за кръстосано валидиране [25]. След това протеините бяха подложени на сигнален пептиден анализ с помощта на SignalP 4.1 сървър (SignalP—4.1— Services—DTU Health Tech), за да се направи разлика между класически секреторни и несекреторни (трансмембранни) протеини. Този метод включва предсказване на местата на разцепване и предсказване на сигнален пептид/несигнален пептид въз основа на комбинация от няколко изкуствени невронни мрежи [26]. Прогнозите за локализация за всички протеини бяха извършени след това с помощта на DeepLoc (DeepLoc—1.0—Services—DTU Health Tech), алгоритъм без шаблони, който използва дълбоки невронни мрежи за прогнозиране на субклетъчна локализация на протеини, като използва само информация за последователността, постигайки добра точност [27]. Всички функционални протеинови последователности, както са получени от сървъра SignalP 4.1, след това бяха подложени на предсказване на присъствието на антигенни детерминанти (епитопи), които ще бъдат разпознати от В и Т клетъчните рецептори. Това беше направено, за да се гарантира, че проектираният ваксинен конструкт съдържа само имунодоминантни Т-клетъчни и В-клетъчни епитопи и по този начин ще бъде в състояние да стимулира ефективен имунен отговор, включващ както хуморални, така и клетъчно-медиирани пътища на имунни механизми.

Прогноза за епитоп на цитотоксични Т лимфоцити (CTL).

Предсказването на епитопа на цитотоксичния Т лимфоцит (CTL) е съществен аспект от проектирането на идеален пептид [28]. Свободно достъпен уеб сървър, а именно NetCTL1.2 (https://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL), беше използван за прогнозиране на CTL епитопите за всички избрани протеини. Методът интегрира предсказанието на свързване на пептид МНС клас I, протеазомно С крайно разцепване и TAP транспортна ефективност [29], всички от които са съществени характеристики, които трябва да притежава последователност от CTL-свързващ епитоп. Сървърът позволява прогнозиране на CTL епитопи, ограничени до 12 MHC клас I супертипове, сред които само A1 супертип беше използван за настоящото изследване. MHC клас I свързване и протеазомно разцепване се извършват с помощта на изкуствени невронни мрежи. Транспортната ефективност на TAP се прогнозира с помощта на тегловна матрица [29]. Последователности с по-високи резултати на свързване се считат за мощни CTL епитопи. В допълнение към NetCTL 1.2, друг публично достъпен базиран на уеб сървър подход, а именно SYFPEITHI (http://www. syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm), също беше използван за прогнозиране на CTL епитопи от всички избрани протеини на Leishmania. Прогнозата се основава на публикувани мотиви и взема предвид аминокиселините в опорните и спомагателните позиции на котва и други често срещани аминокиселини [30]. От списъка с видове MHC, предоставени в този сървър, HLA-A*01, HLA-A*02:01 и HLA-A*03 бяха избрани за прогнозата. Търсенето на епитоп беше определено за последователности на nonamer за равномерно сравнение с резултатите, дадени от сървъра NetCTL 1.2. Само общите епитопи от всеки протеин (ако има такива), които бяха предсказани както от сървърите NetCTL 1.2, така и от SYFPEITHI със съвместими по-високи резултати, бяха избрани за крайната конструкция на ваксината.

Предсказване на епитоп на хелперни Т лимфоцити (HTL).

Помощните Т-лимфоцити са най-важните имунни клетки, тъй като те са необходими при всички видове адаптивни имунни отговори. Предсказването на HTL епитопи (главно от типа Th-1), следователно, се превръща в основен елемент за проектиране на ефективна пептидна ваксина. В настоящото проучване инструментът за анализ на MHC-IIbinding в сървъра IEDB (Immuno Epitope Database and Analysis) (http://tools.iedb.org/mhcii/) беше използван за прогнозиране на 15-mer HTL епитопи за набор от три човешки алела, а именно HLA-DRB1*01:01, HLADRB1*01:02 и HLA-DRB1*01:03. Човешки HLA алели бяха избрани за по-реалистична оценка на MHC-II свързващия афинитет на епитопите, тъй като ваксината беше проектирана срещу човешка лайшманиоза. Предсказаният изход е даден в единици IC50nM за комбинаторната библиотека и SMM подравняването. Следователно по-нисък брой показва по-висок афинитет. Препоръчаният от IEDB метод за прогнозиране е използван в този подход, при който ниският коригиран ранг е показателен за подходящи MHC-II свързващи вещества и следователно може да се определи като мощни HTL епитопи.

Идентифициране и селекция на цитокин-индуциращи НТ епитопи

Цитокините са от огромно значение за правилното функциониране на имунната система. Батерия от цитокини като IL-2, IL-4, IL-6 и интерферон може да индуцира както CTL-медииран, така и хуморален имунен отговор [31]. Следователно, HTL епитопите, които могат да предизвикат производството на цитокини, са за предпочитане за проектиране на имуно-профилактична ваксина. С този изглед сървърът IFNepitope (http://crdd.osdd.net/raghava/ ifnepitope/) беше използван за идентифициране на HTL епитопи, имащи способности за индуциране на цитокини. IFNepitope е онлайн сървър за предсказване, който има за цел да предскаже пептидите от протеинови последователности, които могат да индуцират IFN-гама, освободен от CD4+ Т клетки. Уеб сървърът е разработен на базата на набор от данни, който включва IFN-гама-индуциращи и неиндуциращи MHC клас II свързващи вещества [32]. HTL епитопите, предсказани от IEDB сървъра с по-високи MHC-II-свързващи афинитети (по-ниски коригирани рангове) бяха предоставени като вход за проверка на тяхната способност за производство на цитокини от IFNepitope сървъра. Така идентифицираните епитопи след това бяха подложени на следващото ниво на анализ от сървъра IL4pred (IFNepitope(iiitd.edu.in) и също от сървъра IL10Pred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il10pred/predict3 .php), за да се гарантира, че избраните HTL епитопи също ще предизвикат секрецията на IL-4 и IL-10, съответно. Те също така вземат предвид запазването на позицията на аминокиселинните остатъци и аминокиселинния състав на пептиди за по-точно предсказване [33, 34]. MHC-II-свързващите HTL епитопи, предвидени като положителни от всичките три сървъра, бяха избрани за включване в крайната ваксина. Тази стратегия беше приета, за да се подобри ефикасността на ваксината, тъй като тя може да предизвика интензивен отговор, включващ голямо разнообразие от цитокини (IFN-гама, IL-4 и IL-10), което води до ускорен и дълготраен имунитет.

Анализ на запазването на епитопа

Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>100% (по подразбиране).

Проектиране на мулти-епитопна последователност на ваксина

Въз основа на имуноинформационния анализ, първичната последователност на субединичната ваксина беше конструирана чрез включване на избраните CTL и HTL епитопни последователности. Тези епитопи бяха свързани заедно чрез AAY и GPGPG линкери, съответно [28, 31]. Вмъкват се линкери за правилно разделяне на отделните епитопи, които са необходими за ефективното функциониране на конструкцията на ваксината [28, 36]. Второ, добавянето на подходящ адювант е от решаващо значение в субединичната ваксина за засилване на имунния отговор [31]. Изборът на подходящ адювант е кардинален при проектирането на ваксини за изпитвания върху хора. IL-12, произведен от различни имунни клетки, е от съществено значение за развитието на клетъчно-медииран имунитет срещу лайшманиоза и потенциалът на IL-12 като адювант във ваксини срещу лайшманиоза е докладван в миши модели [3, 37, 38]. Този IL-12 беше избран като адювант за проектиране на ваксината и неговата последователност беше включена в N терминала на конструкцията на ваксината, използвайки EAAK линкер [28, 31]. Последователността на човешката IL-12 алфа верига беше извлечена от базата данни Uniprot (www.uniprot.org; номер на достъп P29459). Накрая беше получена конструкцията на пептидната ваксина, имаща адювант, линкер, CTL епитопи и HTL епитопи (с интра-епитопни AAY и GPGPG линкери) в последователност, движеща се от N край към С терминал.

Предсказване на конформационен и линеен В клетъчен епитоп

Хуморалният имунитет включва синтеза и секрецията на специфични антитела от активирани В-клетки, което изисква наличието на антигенни детерминанти, които се разпознават от В-клетъчните рецептори, присъстващи на повърхността на В-лимфоцитите. Една идеална имунозащитна пептидна ваксина трябва да има такива компоненти, за да взаимодейства и по този начин да стимулира В клетките. Следователно, два сървъра, а именно ABCpred и BepiPred 2.0, бяха приложени за точното предсказване на В клетъчни епитопи в първичната последователност на проектираната ваксина. ABCpred сървър (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/ abcpred/ABC_submission.html) е подход, базиран на изкуствена невронна мрежа (ANN), който предсказва В клетъчни епитопи в дадена антигенна последователност, използвайки параметри с фиксирана дължина. Наборът от данни за обучение, използван в този метод, съдържа В клетъчни епитопи от базата данни за В клетъчни епитопи (BCIPEP). Сървърът е в състояние да предвиди епитопи с 65,93% точност, използвайки повтаряща се невронна мрежа [39]. Първичната последователност на крайния ваксинен конструкт беше предоставена като вход в обикновен формат и параметрите по подразбиране на ABCpred сървъра, включително прагова стойност от 0.51 с дължина на прозореца от 16 аминокиселинни остатъка, бяха използвани за предсказанието. Сървърът BepiPred 2.0 (BepiPred—2.0—Services—DTU Health Tech), от друга страна, прогнозира последователни В клетъчни епитопи от входна последователност чрез произволен горски алгоритъм, обучен върху епитопи и неепитопни аминокиселини, определени от кристални структури, последвани от последователно изглаждане на прогнозата [40]. Първичната последователност на ваксината беше предоставена във формат FASTA като вход. Прилагането на два различни сървъра, които предсказват В клетъчни епитопи въз основа на два различни алгоритъма, прави прогнозата по-реалистична. Повечето от антигенните детерминанти, разпознати от В-клетъчния рецептор и антителата, са прекъснати, което означава, че съдържат аминокиселинни остатъци, разположени отдалечено в първичната структура на имуногена, но се довеждат един до друг по време на нагъването на протеина [41]. Предсказването на такива прекъснати В клетъчни епитопи в валидираната третична структура на ваксината беше извършено чрез използване на сървъра ElliPro (http://tools.iedb.org/ellip ro/), включен в портала IEDB. ElliPro е свободно достъпен уеб инструмент, който прилага модифицирания метод на Thronton и взема предвид центъра на масата на всеки остатък, а не C атомите. По този начин всеки от епитопите се свързва с приписан резултат, дефиниран като PI (индекс на изпъкналост), осреднен върху епитопните остатъци. Прекъснатите епитопи се определят на базата на техните съответни PI стойности и се групират на базата на разстоянието между центровете на масата (R) на остатъка. По-големите стойности на R корелират с прогнозираните по-значими прекъснати епитопи [42]. В същото време линейните В клетъчни епитопи във входящия протеинов модел също могат да бъдат предвидени и визуализирани чрез използване на ElliPro. Откриването както на линейни, така и на прекъснати В-клетъчни епитопи в усъвършенствания 3D модел на ваксината гарантира успешна стратегия за проектиране на ваксина.

Профилиране на антигенност, алергенност и токсичност на конструкцията на ваксината

Антигенността е основен критерий за имуно-профилактична ваксина. За да се гарантира, че проектираният конструкт на ваксина ще предизвика дълготраен имунен отговор чрез взаимодействие с В и Т клетъчните рецептори, антигенността на същата беше оценена с помощта на сървъри ANTIGENpro и VaxiJen 2.0. Сървърът ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci. edu/) класифицира правилно 82% от известните защитни антигени, когато се обучава, използвайки само наборите от данни за протеинови микрочипове. Точността на комбинирания набор от данни се оценява на 76% чрез десетократни експерименти за кръстосано валидиране, които позволяват значително по-добро разпознаване на антигенни пептиди. Той работи на двустепенна архитектура, включително базиран на SVM класификатор от втори етап. За нова входна протеинова последователност, вероятността, изчислена от SVM предиктора на втория етап, е крайният прогнозен резултат на ANTIGENpro [25]. VaxiJen2.0 (http://www. dog-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) е друг публично достъпен уеб сървър, който оценява антигенността на протеинова последователност чрез подход без подравняване, който се основава върху авто-кръстосаната ковариантна (ACC) трансформация на протеинови последователности в еднакви вектори на основните аминокиселинни свойства и позволява класифициране на антигени единствено въз основа на различни физикохимични свойства на протеина, без да се позовава на подравняване на последователности [43]. Второ, за да се изключи каквато и да е възможност конструктът на ваксината да предизвика алергичен отговор при индивид, сървърът AlgPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpr ed/submission.html) беше използван за определят неговата алергенност. Сървърният инструмент предоставя различни подходи, включително картографиране на IgE епитопи, MEME/MAST мотив, SVM метод, базиран на дипептиден състав, и BLAST ARPs, всички от които се използват за точна прогноза. Прагът беше зададен на 0.4 (по подразбиране) за по-висока прецизност на прогнозата. В допълнение беше приложен и AllerTop v.2.{{20}} (https://www. dog-pharmfac.net/AllerTOP/index.html), свободно достъпен базиран на уеб сървър инструмент за потвърждаване на неалергичния характер на конструкцията на ваксината. Този метод се основава на автоковариантната (ACC) трансформация на протеинови последователности в еднакви вектори с еднаква дължина. Прилага се за количествени изследвания на връзките структура-активност (QSAR) на пептиди с различни дължини и протеините се класифицират чрез алгоритъма на k-най-близкия съсед [44]. Токсичността, ако има такава, беше предвидена чрез използване на сървъра ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/prote in.php). Този инструмент за прогнозиране работи въз основа както на техника за машинно обучение, така и на количествен метод, който се обучава върху набор от данни от различни токсични и нетоксични пептиди, получени от SwissProt и TrEMBL [45]. Профилирането на токсичността е от решаващо значение за оценка на безопасността на ваксината и други подобни имунотерапевтични пептиди, които са предназначени за изпитване върху хора. Анализът беше извършен чрез избиране на SVM (TrEMBL)+базиран на мотив подход при праг на E стойност от 10.0 за базирания на мотив метод и SVM праг от 0,1.

Оценка на физикохимичните свойства

Описването на физическите и химичните характеристики на химерния пептид става жизненоважно, тъй като, когато се прилага като ваксина, той трябва да може да предизвика правилен имунен отговор. Сървърът ProtParam, достъпен с портала ExPASY (Expert Protein Analysis System) (https://web.expasy.org/program/), беше използван за изчисляване на различни физикохимични параметри на първичната конструкция на ваксината, които включват характеристики като молекулно тегло, теоретичен pI, индекс на нестабилност, алифатен индекс, in vivo и in vitro полуживот, голяма средна стойност на хидрофобност (GRAVY) и други.

Предсказване на вторична структура на пептида на ваксината

Вторичните структурни елементи на проектираната конструкция на ваксината бяха предсказани чрез прилагане на сървъра PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) и сървъра за свойства на RaptorX (http://raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/ predict/), като и двата са свободно достъпни онлайн сървъри за анализ на структурата на протеините. Първичната последователност на пептида на ваксината беше предоставена като вход. PSIPRED прогнозира вторичната структура на входната протеинова последователност чрез използване на две невронни мрежи за подаване напред, които функционират въз основа на позиционно-специфични точкови матрици (PSSM), генерирани от PSI-BLAST [46]. Той включва идентифициране на последователности, които са хомоложни на нашата конструкция на ваксина чрез PSI-BLAST, последвано от генериране на PSSM. Установено е, че PSIPRED 3.2 и по-високи версии постигат среден резултат за Q3 от 81,6%, оценен чрез строг метод за трикратно кръстосано валидиране, което прави този подход значително прецизен и точен. Уеб сървърът за собственост на RaptorX използва съвсем скорошна техника за машинно обучение, наречена DeepCNF (дълбоки конволюционни невронни полета), за едновременно прогнозиране на различни характеристики като вторична структура, достъпност на разтворителя и неподредени региони. DeepCNF е интегриран подход, комбиниращ както условни произволни полета (CRF), така и плитки невронни мрежи, който моделира сложни връзки последователност-структура чрез дълбока йерархична архитектура и може да получи приблизително 84% Q3 точност за 3-класова вторична структура [47] .

Прогноза за третична структура

Третичната структура на крайния пептид на ваксината беше предсказана чрез използване на онлайн уеб сървъра I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/). I-TASSER е подход за моделиране на йерархична протеинова структура, базиран на подравняване на нишки на профилен профил (PPA) и итеративни симулации на сглобяване на структура, последвани от усъвършенстване на структурата на атомно ниво. Работи на три етапа: идентификация на структурен шаблон, итеративно сглобяване на структура и анотация на базирана на структура функция. Най-високо класираните структурни модели с глобални и локални оценки на точност се връщат с техните представителни C-резултати и ТМ резултати, които са в корелация с качеството на прогнозирания модел. Програмата I-TASSER представлява един от най-успешните методи, демонстрирани в CASP за автоматизирани прогнози на протеинова структура и функция [48, 49].

Усъвършенстване на третичната структура на ваксината

Конвенционалното изчислително моделиране на протеинова структура само по себе си не гарантира автентичността и точността на прогнозирания модел, тъй като такива стратегии за моделиране до голяма степен зависят от степента на вероятност на входа (целта) с наличните шаблонни структури. Поради това се смята, че е необходимо подобряване на качеството на модела, базиран на шаблон, извън точността, и това може да се постигне чрез усъвършенстване на цялата протеинова структура. С тази перспектива изходът на триизмерния модел от сървъра I-TASSER с най-добър C-резултат беше подложен на допълнително усъвършенстване от сървъра GalaxyRefne (http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type{ {4}} ПРЕЦИЗИРАНЕ). Това е CASP10-тестван подход за усъвършенстване, при който страничните вериги на протеина първо се възстановяват, а след това преопаковането на страничните вериги и цялостната релаксация на структурата се извършва чрез симулация на молекулярната динамика. Това води до прецизно подобряване както на локалните, така и на глобалните третични структури на целевите протеини [50].

ползи от добавката Cistanche—Анти-възпалителен

Валидиране на третичната структура на ваксината

Усъвършенстваната третична структура на ваксината трябваше да бъде валидирана, за да се открият потенциални грешки, които могат да възникнат в прогнозирания 3D модел. Усъвършенстваният модел, получен от сървъра GalaxyRefne, беше предоставен като входна структура във формат a.pdb. Освен това графиката на Рамачандран е друг много полезен подход за визуализиране на енергийно разрешени и непозволени области на phi (ϕ) и psi (ψ) двустенни ъгли на страничните вериги на аминокиселините, които се считат за решаващи компоненти за валидиране на протеинова структура. Следователно беше използван сървърът MolProbity [Главна страница—MolProbity (duke.edu)], който генерира диаграма Рамачандран за дадения модел на ваксината въз основа на валидиране на Phenix в стил MolProbity на Python [51]. Освен това използвахме ERRAT сървъра [SAVESv6.0—Structure Validation Server (UCLA. edu)], който анализира статистиката на несвързани взаимодействия между различни атоми в модела и чертае стойността на функцията за грешка спрямо {{ 6}}плъзгане на остатъците [52]. За тази цел беше използван уеб сървър ProSA (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php), интерактивна уеб базирана платформа, базирана на стандартната програма ProSA [53]. Тази стъпка беше извършена, за да се получи по-сложно и прецизно валидиране на моделираната структура.

Дисулфидно инженерство на пептида на ваксината

Дисулфидните връзки допринасят за стабилността на протеина чрез понижаване на конформационната ентропия и също чрез увеличаване на свободната енергия на денатурираното състояние. Въвеждането на нови дисулфидни връзки се счита за критичен биотехнологичен инструмент за подобряване на термостабилността на естествените, нагънати протеини. Сървърът Disulfide by Design 2 (DbD 2) v 2.12 беше използван за подобряване на общата структурна стабилност на проектираната ваксина чрез въвеждане на дисулфидни връзки. Този метод използва естествена геометрия и изчислява енергийна стойност за всеки потенциален дисулфид, като по този начин осигурява средство за класиране на кандидат дисулфидните връзки. Дисулфидните връзки, които осигуряват максимална стабилност, бяха кандидатите с висока стойност на chi3, енергия на връзката и B фактор [54]. Гъвкавите региони на пептида бяха избрани въз основа на параметрите, споменати по-рано, и съответните стабилизиращи мутации бяха създадени чрез образуване на дисулфидни връзки между избраните двойки остатъци.

Молекулярно свързване на конструкт на ваксина с имунни рецептори (човешки TLR-2, 4, 5, 8 и миши TLR-9)

Toll-подобните рецептори (TLR) са основни атрибути на клетъчните имунни отговори, които разпознават свързани с патогени молекулярни модели (PAMP) и предизвикват вродени имунни отговори срещу инфекции. Впоследствие се съобщава за директно активиране на TLR-2 с компоненти на Leishmania [55]. В други свързани експериментални проучвания, липсата на TLR-4 води до повишен паразитен растеж и забавено зарастване на кожни лезии, причинени от L. major инфекции, което показва правдоподобната роля на TLR-4 в индуцирането на имунитет срещу Leishmania [56]. ]. От друга страна, беше установено, че TLR-2, 4 и 9 участват в имунопатологичен спектър на CL, причинени от L. braziliensis и L. amazonensis [57]. TLR-9 също беше оценен като ключов играч в активирането на дендритни клетки в патогенезата на VL при хора [58]. Доказано е, че някои от получените от Leishmania компоненти активират TLR-2, 4 и 9 в повечето проучвания, проведени в тази област. Тези наблюдения подчертават факта, че различни TLR участват в задействането на защитен имунитет срещу Leishmania. Следователно, взаимодействието между TLR и проектираната конструкция на ваксината се счита за необходимо за предизвикване на ефективен имунитет срещу инфекции с Leishmania. Това беше проверено чрез извършване на молекулярно свързване на мулти-епитопния ваксинен пептид с човешки TLR-2, 4, 5, 8 и миши TLR-9 с помощта на сървъра PatchDock [PatchDock Server (tau.ac.il) )]. Алгоритъмът PatchDock има три основни етапа, а именно представяне на молекулна форма, съпоставяне на повърхностни петна и филтриране и точкуване. Това е алгоритъм за молекулярно докинг, базиран на геометрията, който основно работи върху комплементарността на молекулната форма между рецептора и лиганда. Допълнителните кръпки се съпоставят и се генерират кандидат трансформации. Всяка от тези трансформации се класира допълнително чрез присвояване на точкова функция, която отчита както енергията на атомна десолватация, така и геометричните ft [59, 60]. В нашето изследване човешки TLR-2 (PDB id: 6NIG), TLR-4 (PDB id: 4G8A), TLR-5 (PDB id: 3J0A), и TLR-8 (PDB id: 4QC0), и миши TLR-9 (PDB id: 3WPF) бяха избрани като рецептори и техните отделни PDB файлове бяха извлечени от Protein DataBank (www .rcsb.org). Усъвършенстваният 3D модел на пептида на ваксината беше използван като лиганд за всички докинг симулации. Сървърът PatchDock беше зададен на параметри по подразбиране (RMSD за клъстериране: 4.0). Допълнително анализирахме най-добрия докинг модел, използвайки сървъра Cluspro въз основа на възможен алгоритъм за ротация на облигации и облигациите бяха оценени с помощта на софтуера PyMOL [61].

Оптимизиране на кодон, предсказване на структурата на иРНК и клониране in silico за експресия на ваксинен протеин

Необходима е оптимизация на кодона, за да се постигне максимална експресия на чужди гени в организма на гостоприемника, когато използването на кодон от гостоприемника се различава значително от това на естествения гостоприемник, от който са били избрани оригиналните последователности за крайната конструкция на ваксината. JCat (Java Codon Adaptation Tool), достъпен публично на (http://www.jcat.de/), беше използван за обратна транслация и оптимизация на кодони чрез предоставяне на първична последователност на крайната конструкция на ваксината като вход. Използването на кодон е оптимизирано за най-секвенирания прокариотен организъм, Е. coli K12 [6]. Бяха избрани три допълнителни опции, предоставени от инструмента, за да се избегнат rho-независими терминатори на транскрипция, места за свързване на прокариотни рибозоми и нежелани места на рестрикционно разцепване. Индексът на адаптация на кодона (CAI) и съдържанието на GC, изчислени от инструмента JCat, показват колко добра е била оптимизацията. По-добрата оптимизация осигурява по-висока експресия на протеина на ваксината. Освен това, рестрикционните сайтове за ензимите XhoI и NdeI бяха включени в оптимизираната cDNA последователност, осигурена от JCat инструмента за улесняване на клонирането. След това модифицираната последователност (с рестрикционни сайтове) беше вмъкната в E. coli pET 28-a(+) плазмиден вектор чрез използване на модула за рестрикционно клониране на инструмента SnapGene [6, 31, 62, 63]. Софтуерът SnapGene е достъпен в мрежата на (https:// www.snapgene.com/). Освен това използвахме и уеб сървъра mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi ng-Form) за прогнозиране на вторичната структура на иРНК, кодирана от гените на химерния пептид. Обратно преведената оптимизирана последователност, получена от инструмента JCat, беше предоставена като вход. Програмата mfold се основава на основен алгоритъм, който предвижда минимална свободна енергия, ∆ G, и минимални свободни енергии за сгъвания, съдържащи всяка конкретна базова двойка. Различни ограничения за сгъване също се прилагат за точното прогнозиране на енергиите на сгъване. Енергията на сгъване за сгъване на РНК е фиксирана на 37 градуса, докато йонните условия са фиксирани на [Na+]=1 M и [Mg++]=0 [64].

Имунна симулация, базирана на C-immsim

C-immsim (https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index. php?page=1) е базиран на сървър инструмент за прогнозиране на имунен отговор, който използва базиран на агент клас и неговата прогноза разчита на невронни мрежи. Той може да предвиди както хуморален, така и клетъчно-медииран имунен отговор. C-immsim използва модела на Celda Seiden, модела на поликлоналната решетка с битов низ и индекса на Simpson, за да характеризира прогнозата за активни, почиващи и клетки на паметта и тяхната дълголетие. Той помага да се предвиди цитокиновият профил на дадена реакция, за да се оценят възпалителните отговори [65].

Екстракт от цистанче на прах

Молекулярна динамична симулация

Молекулярната динамична симулация беше извършена, за да се оцени стабилността на нашия най-добър комплекс, т.е. TLR, с предложената ваксина, използвайки iMOD (сървър на началната страница на iMod сървър (csic.es). Този уеб базиран сървър използва подобрен анализ в нормален режим (NMA) за характеризиране на различни динамични свойства на биомолекули, като гъвкавост и стабилност на протеини, посредством вътрешноатомно силово поле.В това настоящо изследване анализирахме деформациите на основната верига, B фактор, собствени стойности, ковариационен фактор и модел на еластична мрежа като стандартни NMA параметри за оценка на протеин-протеинови комплекси, получени чрез in silico подходи [66–69].

Резултати

Селекция и извличане на антигенни протеинови последователности на Leishmania

The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0.51), отразявайки тяхната по-висока ефективност за дизайна на ваксината (Таблица 1). Протеините бяха разграничени като секреторни и несекреторни на базата на предсказването на местата на разцепване на сигнален пептид от сървъра SignalP 1.4. Два от избраните протеини на Leishmania, т.е. Установено е, че L. mexicana цистеин протеиназа A (Uniprot id: P25775) и L. amazoensis повърхностен гликопротеин GP-46/M2 (Uniprot id: P21978) съдържат сигнални пептиди и следователно са предвидени като секреторни протеини. Останалите от десетте антигена на Leishmania не са открити да имат сигнален пептид, показващ техния несекреторен характер. Анализът на локализацията прогнозира, че протеинът цистеин протеиназа А на L. mexicana (Uniprot id: P25775) ще бъде локализиран в лизозома/вакуола, протеините лейшманолизин С1 и протеофосфогликан на L. mexicana (Uniprot id: P43150 и Q9TW13, съответно) са мембранни протеини , ЛИПСВА защитен антиген на L. donovani (Uniprot id: Q9BIJ5) да бъде в ядрото и свързан с топлинен шок 70 протеин 1 на L. major (Uniprot id: P12076) да бъде локализиран в митохондриите. Всички останали протеини бяха предсказани като цитоплазмени (Таблица 1). В допълнение към това, аминокиселинната последователност на алфа веригата на човешки IL-12 също беше получена от базата данни на Uniprot (Uniprot id: P29459), за да бъде използвана като адювант в крайния ваксинен конструкт.

Прогнозиране на CTL и HTL епитопи

От всички протеини, които се изследват, общ брой от 59 обикновени номенични CTL епитопи бяха идентифицирани съвместно от сървърите NetCTL 1.2 и SYFPEITHI. На всеки от прогнозираните CTL епитопи беше присвоен определен резултат, изчислен от съответните сървъри. Само 26 от тези общи 9-mer CTL мотиви бяха избрани поради по-високите им резултати (показващи по-висок афинитет на свързване на MHC I). Тези двадесет и шест CTL епитопа, идентифицирани обикновено от двата сървъра със съвместими по-високи резултати, бяха включени в крайната конструкция на ваксината (допълнителна таблица S1). По същия начин инструментът за анализ на свързване на IEDB MHCII предсказа 15-mer HTL епитопи от всички избрани протеини срещу набор от три човешки HLA алела (HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*01:02 и HLADRB1* 01:03). Предсказаните HTL епитопи с най-нисък коригиран ранг за всеки един от тези алели са документирани като в допълнителна таблица S2. От този набор бяха избрани общ брой от девет последователности на базата на техните ниски коригирани рангове (Таблица 2), които правят тези HTL епитопи най-мощните MHC-II свързващи вещества за всеки от трите HLA алела. След това избраните HTL епитопи бяха подложени на допълнителен изчислителен анализ, за ​​да се предвидят техните способности за производство на цитокини.

Таблица 1 Дванадесет потенциални антигенни пептида от различни видове Leishmania са използвани за конструиране на ваксина и са избрани въз основа на техния висок антигенен резултат, както е предвидено от сървъра ANTIGENpro

Скрининг за HTL епитопи с цитокин-индуциращи способности

Всичките девет избрани HTL епитопа (Таблица 2) бяха оценени за способността им да произвеждат интерферон - чрез използване на IFNepitope сървър. Сървърът предсказа (IFN- срещу nonIFN, използвайки SVM и базиран на мотив хибриден анализ) само три такива пептида като FRRLYKTLGQLVYKK от протеин на парафагеларен пръчица 2C на L. major, DNGAYLGMEPSSVAA от протеофосфогликан на L. mexicana и RLHFFMMGFAPLTSR от тубулинова бета верига на L. mexicana като „положителен“ с резултати по-малки от 1.0 (Таблица 3). Тези три пептида бяха допълнително проверени за техните способности за производство на IL-4 и IL-10-, като се използва съответно IL4pred сървър и IL10pred сървър. И двата сървъра използват SVM класификатор и отчитат различни SVM входни параметри като аминокиселинен състав, дипептиден състав, склонност към аминокиселини и физикохимични свойства за прогнозата [32, 33]. Съответните сървъри прогнозираха, че тези три епитопа, произвеждащи 15-mer IFN- -, също са индуктори за IL-4 и IL-10 (допълнителна таблица S3). Следователно, тези три MHC-II-свързващи 15-mer HTL епитопи най-накрая бяха избрани за конструирането на ваксината, като се има предвид способността им да предизвикват производството на цитокини IFN-, IL-4 и IL{{24 }} като по този начин медиира засилен имунен отговор.

Анализ на запазването на епитопа

IEDB модулът "консервация през антиген", наличен в рамките на IEDB сървъра, беше използван, за да се намери степента на консервация на избраните CTL и HTL епитопи, които ще бъдат включени в крайната ваксина. Всеки от двадесет и шестте CTL епитопа и три HTL епитопа беше скриниран индивидуално срещу специфичен набор от хомоложни протеинови последователности, получени от Uniprot BLAST. Резултатите от BLAST показват висока степен на запазване на избраните протеини в различни видове Leishmania, а също и в други свързани паразитни протозои, най-вече Trypanosoma. Установено е, че всички HTL епитопи са силно запазени (100%) в набора от свързани протеини на Leishmania, използвани в анализа, докато диапазонът на запазване за избрани CTL епитопи варира от 0 до 100% (допълнителна таблица S4). Включването на такива запазени CTL и HTL епитопи в крайния ваксинен конструкт би осигурило широкоспектърен кръстосан имунитет срещу множество видове патогенни Leishmania, които обикновено заразяват хората.

Таблица 2 Подробности за избрани HTL епитопи (15 mer) с техните изходни протеини, съответните свързващи алели и коригирани рангове, предсказани от инструмента за свързване на IEDB MHC-II

Таблица 3 IFNepitope сървър прогнозира MHC II-индуциращи епитопи, които са способни да произвеждат интерферон

Конструиране на мулти-епитопна последователност на ваксина

Първичната последователност на пептидната ваксина с множество субединици беше конструирана чрез сливане на последователностите от двадесет и шест CTL епитопа и три HTL епитопа, избрани на базата на тяхната антигенност, МНС-свързващ афинитет и способност за индуциране на цитокини. Индивидуалните CTL и HTL епитопи бяха амалгамирани чрез използване на AAY и GPGPG линкери, съответно, и общата дължина на получения ваксинен пептид беше 369 аминокиселини. Адювантът, дълга алфа верига от 219 аминокиселини на човешки IL-12 (Uniprot id: P29459), беше добавен към N края на проектирания пептид чрез EAAK линкер. Добавянето на IL-12 като естествен адювант трябваше да подобри ефективността на ваксината чрез ускоряване на имунния отговор, както вече е потвърдено в проучвания върху животни [3, 37]. В допълнение към С терминала на пептида беше добавен маркер 6XHis, за да се улесни идентифицирането и пречистването на протеина след производството му чрез рекомбинантна ДНК технология. След добавянето на линкери, адювант и хистидинов маркер се установи, че дължината на крайния ваксинен пептид е 598 аминокиселинни остатъка (фиг. 1).

Прогноза за линеен, непрекъснат и прекъснат В клетъчен епитоп

Наличието на антигенни детерминанти в първичната последователност на проектираната ваксина беше идентифицирано чрез използване на два различни сървъра, а именно ABCpred и BepiPred 2.0, за по-ефективно прогнозиране. ABCpred сървър прогнозира В клетъчни епитопи чрез използване на обучена повтаряща се невронна мрежа и представя кандидат последователностите като 16-mer пептиди, класирани според техните резултати на свързване (допълнителна таблица S5). По-висок резултат на пептида означава по-висока вероятност да бъде епитоп. Установено е, че проектираният ваксинен пептид има седем неприпокриващи се 16-mer пептида с прогнозирани резултати от 0.90 и повече при прагова стойност по подразбиране от 0.51 , което отразява много високата им ефикасност да свързват и стимулират В клетките. Другият сървър, BepiPred 2.0, прогнозира вероятността всеки аминокиселинен остатък във входната последователност да бъде част от B клетъчния епитоп и изобразява изхода като илюстрация с градация на оранжев цвят, показваща степента на вероятност. Предсказаните остатъци, които принадлежат към В клетъчни епитопи, са маркирани като "E." Сървърът идентифицира голям брой остатъци като линейни В клетъчни епитопи с голяма вероятност в рамките на остатъчен участък от 380–53{{20}} позиция на пептида (фиг. 2), когато прагът на епитопа беше зададен на 0.5 (по подразбиране). По този начин, идентифицирането на антигенни детерминанти за В-клетъчни рецептори от два независими сървъра установи факта, че пептидът, когато се прилага като ваксина, би могъл да стимулира производството на антитела от В-клетките за защита на индивидите от инфекции с Leishmania. Костюмът Ellipro (наличен в портала на IEDB) прогнозира общо 323 аминокиселинни остатъка, разположени в осем прекъснати В-клетъчни епитопа в рафинираната третична структура на пептидната ваксина, с резултати, вариращи от 0.509 до 0.802. Сред тях най-големият конформационен епитоп съдържа 107 аминокиселинни остатъка с прогнозиран резултат от 0,772. За анализа са използвани параметрите по подразбиране на сървъра. Ellipro също прогнозира дванадесет линейни В клетъчни епитопа с общ брой от 324 остатъка в рамките на диапазон от 0.535–0.885 (допълнителна таблица S6 и допълнително изображение M1).

Профилиране на антигенност, алергенност и токсичност на конструкцията на ваксината

Антигенността на крайната последователност на ваксината (с адювант) беше оценена от сървърите ANTIGENpro и VaxiJen 2.0. Сървърът на ANTIGENpro прогнозира, че същото е вероятен антиген с резултат за антигенност 0.745396. Сървърът VaxiJen 2.0 оцени пептида на ваксината като вероятен антиген с резултат от 0.5325 при праг от {{10}}.5, когато целевият организъм е избран да бъде паразит (Таблица 4). Въпреки това, когато оригиналната последователност на ваксината без адюванта беше анализирана от VaxiJen 2.0, тя също беше предсказана като вероятен антиген с резултат 0.5768 в паразитни модели. Прогнозният резултат на ANTIGENpro за оригиналната последователност беше 0.714582. Следователно, и двете конструирани последователности на ваксина (със и без адювант) се оказаха антигенни по природа, подкрепяйки факта, че пептидните компоненти на ваксината са антигенни сами по себе си, дори в отсъствието на добавения адювант (Таблица 4). Що се отнася до алергенността, крайната последователност на ваксината беше установена като неалергенна от AlgPred с прогнозиран резултат от 0.4018 при праг от 0.4. В допълнение, не беше установено, че протеиновата последователност съдържа някакъв експериментално доказан IgE епитоп и не бяха открити резултати за BLAST резултати за алерген-представителни пептиди (ARP), което показва неалергенната природа на ваксината. Сървърът AllerTOP v.2.0 също определи протеина като вероятен неалерген. Анализът на токсичността от сървъра на ToxinPred прогнозира, че пептидът е нетоксичен, когато подходът, базиран на SVM (TrEMBL)+мотив, е възприет при праг на SVM от 0,1, а граничната стойност на E за базиран на мотив е зададена на 10,0. Следователно, генерираната последователност на ваксината беше предсказана като вероятен антиген, неалерген и нетоксична, всички от които са важни критерии за идеална пептидна ваксина с множество субединици.

Фиг. 1 Схематично изображение на проектирана мулти-епитопна пептидна ваксина, съдържаща общо 598 аминокиселинни последователности, представляващи възможна конструкция на ваксина с N краен естествен адювант (зелено), свързано с EAAK (лилаво) с 26 CTL (оранжево), използвайки AAY (син) линкер и 3HTL (жълт) са свързани с GPGPG (червен) линкер. Завършва с 6-Неговия таг на терминала C за целите на пречистването

Фиг. 2 В клетъчен епитоп, предвиден от Bepipred 2.0 сървър. Разтягания в различни точки от 1 до 590 аминокиселинни последователности бяха предсказани с потенциален епитоп над нивото на прага по подразбиране. Първият ред, маркиран като E, показва предвиденото местоположение на епитопа

Оценка на физикохимичните показатели

Физикохимичните параметри на крайната конструкция на ваксината бяха изчислени от сървъра Protparam на базата на аминокиселинните остатъци, присъстващи в дадената последователност. Молекулното тегло (MW) на проектирания пептид се изчислява на 65.68 kDa, което го прави подходящ за индуциране на имуногенен отговор. Теоретичната pI (изоелектрична точка) е изчислена като 5,98, което означава, че пептидът е леко кисел по природа. Общият брой на положително заредените и отрицателно заредените остатъци в пептида е съответно 48 и 55. Полуживотът се изчислява като 30 h в ретикулоцити на бозайници in vitro, повече от 20 h в дрожди и повече от 10 h в E. coli in vivo. Устойчивостта на протеина в продължение на 30 часа в клетки на бозайници (включително хора) е достатъчна за предизвикване на желан имунен отговор, тъй като механизмът изисква обработка и представяне на протеина от имунните клетки. Алифатният индекс (относителният обем, зает от алифатните странични вериги) се прогнозира да бъде 78,34, което показва, че протеинът е термостабилен по природа, тъй като алифатният индекс може да се счита за положителен фактор, допринасящ за повишаването на термостабилността на глобуларните протеини. Индексът на нестабилност беше изчислен на 47,10. Предсказаната голяма средна стойност на хидропатия (GRAVY) на конструкцията на ваксината беше прогнозирана да бъде -0.140; отрицателната стойност го определя като хидрофилен по природа и ще взаимодейства с водните молекули [28, 70–72]. В заключение, имуноинформационният анализ прогнозира проектираната пептидна конструкция като антигенна, термостабилна, персистираща в клетки на бозайници и хидрофилна. Всички тези фактори оказват влияние върху ефективността на конструкта като вероятен кандидат за ваксина.

Прогноза за вторична структура

Прогнозата на вторичната структура за дългия 592 остатъка химерен пептид от PSIPRED сървър разкрива наличието на 45,77% алфа спирала, 4,89% бета-лист и 49,32% намотки, както е показано на следващата фигура 3. В допълнение, структурата на RaptorX Сървърът за прогнозиране анализира съответната достъпност на разтворителя за пептида, в който 36% от остатъците е предвидено да бъдат изложени, 28% са предвидени като средно заровени и 35% от остатъците са предвидени като заровени, което показва, че протеинът ще има цялостен справедлив контакт с вода (разтворител). Само 32 остатъка (5% от пептида) бяха предвидени да бъдат в неподредения домейн на протеина от RaptorX сървъра.

Прогноза за третична структура

I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5 показва модел с правилното сгъване. TM резултатът е независим от дължината на последователността параметър за измерване на структурното сходство на прогнозирания модел с други идентични протеини в същото SCOP/CATH сгъваемо семейство [47].

Таблица 4 Резултати за антигенност, изчислени от сървър ANTIGENpro и сървър Vaxijen2.0 със и без антиген

Фиг. 3 Предсказание на вторична структура към линейна последователност на ваксина от PSIPRED сървър

Фиг. 4 Прогноза и прецизиране на третична структура 3-D моделиране на структурата на ваксината, както е предвидено от I-TASSER сървъра. b Усъвършенстване на грубия 3-D модел от сървъра GalaxyRefne

Усъвършенстване и валидиране на 3-D модел на ваксина

„Суровият“ третичен модел за пептидната ваксина беше последователно усъвършенстван чрез обработката му чрез сървъра GalaxyReone. GalaxyRefne даде пет модела, от които модел 1 беше установено, че е най-добрият след оценка и сравнение на свързаните параметри като GDT-HA (0.8826); RMSD (0.608); MolProbity (2,398); резултат от сблъсъка (21,1); лоши ротамери (0.6); и предпочитан от Рама регион (88.8) с останалите модели (фиг. 4b). Диаграмата Рамачандран, генерирана от сървъра MolProbity, показа, че прецизният 3-D модел има 88,8% остатъци в предпочитания регион, 98,6% остатъци в разрешения регион и само 0.013% отклонения. За разлика от това, беше установено, че първоначалният суров модел има 77,1%, 94,2% и 0,057% остатъци съответно в предпочитаните, разрешените и извънредните региони. Тези резултати ясно заключават, че качеството на усъвършенствания третичен модел е значително подобрено. ERRATA сървърът също беше използван за допълнително валидиране на усъвършенствания модел. Сървърът на ERRATA анализира модела с общ коефициент на качество от 43,542, което всъщност представлява процентът на входящия протеинов модел, който пада под границата на отхвърляне от 95%. По този начин ние успешно получихме значително усъвършенствана и валидирана третична структура за конструкцията на ваксината. Усъвършенстваната третична структура на ваксината, заедно с графиките, получени от сървъра MolProbity и сървъра ERRAT, е представена на Фиг. 5. Уеб сървърът на ProSA показа Z резултат от −1,08 (допълнително изображение M2), в което отрицателният стойността показва, че моделът попада извън обхвата на резултатите от подобни протеини със сравними размери, чиито структури са определени чрез рентгенова дифракция или чрез ЯМР [51].

Дисулфидно инженерство на пептида на ваксината

Сървърът Disulfide by Design 2.12 върна 45 двойки аминокиселинни остатъци, които са вероятни места за образуване на дисулфидна връзка. Идентифицирахме четирите най-важни двойки кандидат остатъци, които могат да бъдат разположени в областта на гъвкавата верига на протеина на ваксината въз основа на тяхната висока енергия на връзката и Chi3 стойности (допълнителна таблица S7). Тези остатъци, THR58-PHE61 (chi3:+126.18), LEU216-ALA234 (chi3:+125.92), THR323-GLU359 (chi3 :+121.54) и TYR472-ARG504 (chi3: + 125.75), бяха заменени с цистеин в рафинирания третичен модел на крайния протеин на ваксината, като по този начин се подобри термичната стабилност на пептид (фиг. 6). Въпреки това, точността на B фактора е ограничена до отслабването на неутронното разсейване или рентгеновите лъчи от топлинното движение на молекулите в протеиновата кристалография. По този начин ние стриктно избрахме високи стойности на енергия на връзката и Chi3 над фактора B за този компютърно подпомаган модел на рафинирана ваксина [73, 74].

Анализ на докинг взаимодействията на пептида на ваксината с TLRs

Взаимодействията на химерния пептид с имунните рецептори (човешки TLR{{0}}, 4, 5, 8 и миши TLR-9) бяха изследвани чрез извършване на докинг анализ с помощта на PatchDock сървър, в който свързването бяха оценени афинитетите на ваксината (лиганд) с различни TLR (рецептори). Бяха разгледани първите десет модела, генерирани от PatchDock за всяко докинг, сред които най-добре класираните модели с най-високи резултати за докинг бяха избрани за всеки случай. Резултатите представляват формата и електростатичното допълване между рецепторите и лигандите. Най-доброто допълване е установено в случая на човешки TLR-2 (PDB id: 6NIG) с резултат от 18 714, повърхностна площ 3963.10 и атомна контактна енергия (ACE) 217.99 (фиг. 7a) . Ваксината също показа ефикасно свързване с TLR-5 (PDB id: 3J0A) и TLR-9 (PDB id: 3WPF) с докинг резултат от 18 258; повърхностна площ 2879.80 и ACE от −666.94 и докинг резултат 18 164; и повърхностна площ 4090.70 и ACE от 495.74, съответно. Докингът с други TLR показва по-слаби афинитети на свързване, отразени от по-ниски резултати за докинг, генерирани от PatchDock, 16 708 за TLR-4 (PDB id: 4G8A) и 17 800 за TLR-8 (PDB id: 4QC0). По този начин, нашата конструкция на ваксина успя да се свърже с различни имунни рецептори с различен афинитет на свързване. Това би било много желателно за ефективна ваксина по отношение на предизвикване на подходящ и повишен имунитет за предотвратяване на инфекции с Leishmania. Освен това уеб инструментът FireDock беше използван за усъвършенстване и оценка на най-добрия комплекс (TLR-2 ваксинен комплекс), който прецизира същия с минимална глобална енергия от −19.01, асоциации на Van Der Waals (−25.74), атомен контакт енергия (-0,03) и свободна енергия на свързване (-24,26). Тези резултати потвърждават факта, че пептидът на ваксината взаимодейства най-ефективно с човешкия TLR-2 и по този начин образува сравнително стабилен комплекс, който може да доведе до изразен имунен отговор срещу паразити Leishmania. В допълнение към това, ние допълнително изследваме свързването между TLR-2 и ваксината; използвайки уеб сървъра на Cluspro, най-добрият модел (фиг. 7b) е избран въз основа на 5D ротационен FFT и CAPRI (критична оценка на прогнозираните взаимодействия) с балансиран претеглен резултат -1192.5 с най-голям размер на клъстера от 42 члена. Таблица 5 съдържа списък от 10 взаимодействащи аминокиселинни остатъка от Фиг. 7b, които образуват стабилен комплекс рецептор-лиганд.

Фиг. 5 диаграма на Рамачандран за модел GalaxyRefne. b ERRAT сървър прогнозира качествена оценка на протеиновата структура

Фиг. 6 Дисулфид по дизайн 2.0 прогнозира четири (обозначени със стрелка) потенциални образувания на дисулфидни връзки за подобряване на термичната стабилност на крайния ваксинен конструкт

Оптимизиране на кодон и in silico клониране за експресия на протеина на ваксината

В опит да се преодолее проблемът с отклонението на кодона, инструментът JCat беше използван за оптимизиране на кодон, който върна входната аминокиселинна последователност на пептида на ваксината под формата на обратно транслирана cDNA последователност с оптимизирана CAI стойност от 1. Тази стойност се намира в рамките на приетия обхват на стойността на CAI от 0.8–1.0 [28], осигурявайки висока степен на експресия на гена в организма гостоприемник, E. coli K12. Колкото по-висока е стойността на CAI, толкова по-добра ще бъде степента на експресия на чуждия ген. В допълнение, установено е, че GC съдържанието на подобрената последователност е 51.85%, което показва добра оптимизация на кодона. За по-добра генна експресия е необходимо 35–70% съдържание на GC [63]. Рестрикционните сайтове за ензимите XhoI и NdeI бяха създадени в 5/ и 3/ краищата на последователността, последвано от вмъкване на модифицираната последователност в pET28 a(+) вектора. Клонираната инсерция, представена в червен цвят, се намира между посочените рестрикционни сайтове във вектора. Участък от шест хистидинови остатъка също е разположен в двата края на клонираната последователност, за да се улесни процеса на пречистване след производството на рекомбинантния ваксинен протеин [6, 31]. Размерът на крайния плазмиден векторен конструкт с вмъкнатия генен фрагмент е около 7 kb (фиг. 8). Уеб сървърът mfold прогнозира общ брой от петдесет сгъваеми конформации на иРНК, сред които горната структура беше избрана поради най-ниския й енергиен резултат (ΔG=−492.50). Беше предвидено, че тази конкретна сгъната конформация съдържа единичен външен контур и четири стека с минимални свободни енергии, показващи стабилността на конформацията. Примката се формира с 21 едноверижни бази и две затварящи се спирали. Енергийната точкова диаграма изчислява оптималната енергия (δG) на 494,4 kcal/mol. Различните цветни точки в полето се отнасят до различните енергийни степени на определена базова двойка, присъстваща в иРНК, като се има предвид δG, изчислено от сървъра [64]. Според графиката, свободните енергии на повечето от базовите двойки са в рамките на −487.5<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">

Таблица 5 PyMOL генерира десет взаимодействащи аминокиселинни остатъка на рецептор и лиганд от Фиг. 7b, а числото в () показва съответната позиция на аминокиселините в рецептора и лиганда

Имунна симулация

Имунна симулация in silico с помощта на уеб сървър C-immsim прогнозира антигенен брой, достигащ до 6,9 × 105 /ml в рамките на 2 дни след първоначалната доза на инжектиране, а нивото на антигена спадна до 0 на четвъртия ден нататък. Това нарастване на броя на антигените е свързано със забележително повишаване на концентрацията както на нивото на IgM IgG, така и само на нивото на IgM по време на ранния период на инфекция и достигане на пиково ниво приблизително в рамките на 12 дни от цикъла на инфекция в произволен мащаб. Други подтипове на IgG1+Ниво на IgG2 и IgG1 се повишават значително в резултат на вторичен имунен отговор (фиг. 9а). Цитокиновите профили показват възпалителни медиатори като INF-, достигащи нива до 4 × 106 ng/ml на 12-ия ден, докато нивата на други цитокини остават доста ниски (фиг. 9b). Клетъчно-медиираните имунологични отговори, предполагаеми от наличието на активни и покойни цитотоксични Т-лимфоцити, се увеличават след 2-3 дни след първоначалната инжекция и присъствието на пролиферативна Т-клетка помощник на паметта също е видно (Фиг. 9c и d). Общата популация на В клетки също се увеличава в рамките на 2-3 дни, заедно с генерирането на В клетки на паметта след 1 седмица от прилагането на първичната доза (Фигура 9е).

Фиг. 8 Експресионна система на ваксина срещу Leishmania, използваща pET28 a(+) вектор, червената област показва вмъкната последователност на нуклеинова киселина на ваксината, оградена от NdeI и XhoI рестрикционни места

Интерпретация на молекулярно-динамична симулация

Най-добрият докинг резултат, постигнат от TLR2-ваксинния комплекс, беше допълнително анализиран чрез подпомогната от NMA молекулярна динамична симулация. Деформируемостта на основната верига е представена от високи панти (фиг. 10а), което означава висока деформируемост. B факторът (фиг. 10b) е изчислен от NMA, което означава гъвкавост на протеина въз основа на параметрите на атомно изместване [73]. Собствената стойност (фиг. 10c) очертава около необходимата енергия за деформиране на структурата. TLR-2 ваксинен комплекс показва собствена стойност от около 7,778 × 10−7. Дисперсията (фиг. 10d) е обратно пропорционална на собствената стойност. Ковариационната матрица (фиг. 10e) илюстрира дали двойките остатъци са корелирани (червено), некорелирани (бяло) или антикорелирани (синьо). Еластичният мрежов модел (фиг. 10f) изчислява пружини между съответните двойки атоми, точки в графиката, представени от цветен градиент, показващ твърдост или гъвкавост на пружината, а по-тъмният цвят отразява по-твърдата пружина. По този начин резултатите от молекулярната динамична симулация предполагат, че предложената от нас пептидна ваксина е стабилна.

Дискусия

Лайшманиозата се счита за една от най-пренебрегваните тропически болести, която засяга предимно хората, живеещи в бедни райони на развиващите се страни, включително Индия [2]. Според докладите на СЗО Индия е ендемична и за двете форми на заболяването, CL и VL. CL, причинена от L. tropica и L. major, се среща в северозападните щати на Индия, Пенджаб и Раджастан, които са огнища (https://www.who.int/leishmaniasis/burden/Leishmaniasis_India/en/ ). Освен това, с нарастващата поява на епидемията от вируса на човешката имунна недостатъчност (ХИВ) по целия свят, лайшманиозата се очертава като възобновяващ се опортюнистичен патоген при пациенти със СПИН, което прави ситуацията още по-ужасна [22, 38]. В настоящото проучване ние имахме за цел да проектираме нова поливалентна обща ваксина за лейшманиоза, която може да осигури хетероложна защита от обикновени видове патогенни паразити. Избрахме дванадесет специфични за Leishmania протеини, обхващащи пет патогенни щама на паразита, които причиняват VL и CL инфекции при хора. Тези протеини вече са били оценени за тяхната роля във вирулентността и имуногенността и потенциала им като кандидати за ваксина в различни имунологични проучвания [1, 8–10, 75]. Следователно конструкт на ваксина, проектиран in silico чрез включване на такива добре охарактеризирани и силно запазени имуногенни протеини от различни патогенни видове Leishmania, може да осигури кръстосан имунитет срещу всички форми на човешка лайшманиоза (главно VL и CL) и следователно може да се използва за обща програма за ваксиниране за предотвратяване на инфекции с Leishmania при хора. Избраните протеини бяха първоначално скринирани за наличието на потенциални CTL и HTL епитопи. Откриването на Т клетъчни епитопи е важно, тъй като Т клетките могат да разпознават антигени само когато се обработват по ендогенен или екзогенен път, в комплекс с МНС клас I или МНС клас II молекули и впоследствие се представят на Т клетъчните рецептори от антиген-представящите клетки ( БТР-и). MHC-I е специфичен за CD8+CTLs, докато MHC-II се свързва специфично с CD4+HTL рецептори. Идентифицирането на CTL епитопи беше извършено стриктно чрез използване на два независими сървъра едновременно. Само онези епитопи, предсказани от двата сървъра със значително по-висок афинитет на свързване на МНС, най-накрая бяха включени в пептида на ваксината. Идентифицираните HTL епитопи бяха допълнително оценени за техните способности за индуциране на цитокини чрез използване на три уеб сървъра. Тези, които биха могли да стимулират производството на голямо разнообразие от цитокини, а именно IFN-, IL{{20}} и IL-10, бяха избрани за проектиране на химерна пептидна ваксина, за да се гарантира, че това би подтикнало производството на всички тези специфични за паразита цитокини в гостоприемника. Това е от изключителна важност, тъй като Kedzierski и колеги предложиха, че секрецията на IL-10 е също толкова важна, колкото и секрецията на IFN, за да се определи дали ваксината може да предизвика защитен имунен отговор и че правилният имунитет не се индуцира, ако IL Нивата на -10 не са пропорционално повишени [8, 75]. Изключителните CTL и HTL епитопи бяха след това слети чрез използване на AAY и GPGPG линкери за конструиране на химерния пептид. По-рано се съобщава, че линкерите AAY и GPGPG са полезни за проектиране на мулти-епитопна ваксина, тъй като позволяват минимална имуногенност на връзката и улесняват обработката и представянето на избрани епитопи от MHC-II [6, 28, 71]. Адювантната алфа верига на човешки IL-12 беше свързана с N края на получения пептид чрез EAAK линкера. IL-12 беше избран като адювант, тъй като е един от най-ефективните адюванти за ваксината срещу Leishmania при животински модели, както е документирано в предишни имуногенни проучвания [3, 37, 71]. Тъй като ваксината е предназначена за приложение при хора, включването на човешки IL-12 като естествен адювант вместо който и да е синтетичен TLR агонист се очаква да засили имунитета, без да причинява неблагоприятни странични ефекти. Ролята на IL-12 като общ адювант за ваксини също е подчертана поради неговата ефикасност за усилване както на отговорите на протеиновите, така и на полизахаридните антитела на ваксината и предизвикване на адекватно локално възпаление, което позволява ексудация на IgG, водеща до повишен имунен отговор [72]. Беше добавен EAAK линкер за постигане на по-висока скорост на експресия и за насърчаване на биологичната функция на слетия пептид чрез ограничаване на взаимодействието между домените на ваксината [76, 77]. Имуноинформационният анализ показа, че нашата конструкция на ваксина има много линейни В клетъчни епитопи, които са силно желани за ваксина, направена за имунопрофилактична употреба. Отново използвахме два различни инструмента за по-точни прогнози. И двата сървъра предвиждат достатъчно В клетъчни епитопи в последователността на ваксината. Предвидено е, че проектираната ваксина е неалергенна, нетоксична и достатъчно имуногенна, за да предизвика правилна имунна реакция. Последващият физикохимичен анализ разкрива, че пептидът на ваксината е леко кисел (pI 5,98) със значително по-висок алифатен индекс (78,34), което предполага неговата термостабилна природа. Отрицателна стойност на GRAVY (-0,14) показва, че пептидът е хидрофилен, което допълнително допринася за неговата ефективност като ваксина. Вторичните структурни елементи на ваксината бяха определени от сървъра PSIPRED v 4.0, който е един от най-точните и широко използвани изчислителни методи за прогнозиране на вторичната структура на протеина. Освен това, 3D структурата за проектирания пептид също беше предсказана с помощта на сървъра I-TASSER, който предостави подробна информация за координатите на важните остатъци на протеина, което е от първостепенно значение за изследване на динамиката, биоактивността и взаимодействието на ваксината с други лиганди. Първоначалната третична структура беше усъвършенствана и валидирана чрез използване на инструменти за валидиране на протеинова структура за локализиране и коригиране на потенциални грешки в страничната верига или гръбнака на прогнозирания модел. Анализът на диаграмата Рамачандран показа, че повече от 90% от остатъците от прецизирания модел попадат в разрешената област с малък процент отклонения, докато сървърът ERRAT показа коефициент на качество от 43,542, които всички са показателни за задоволително качество на модела. Установено е, че валидираният 3D модел има адекватен брой конформационни В-клетъчни епитопи от сървъра ElliPro, което предполага, че той може да генерира желан В-клетъчен отговор и да стимулира производството на специфични антитела в гостоприемника. Активирането на B клетките също е от решаващо значение за имунологичната памет и е отговорно за дълготраен имунитет при ваксинирани индивиди. Взаимодействието на ваксината с имунните рецептори (TLR) също беше оценено чрез извършване на докинг анализ. Беше установено, че пептидът на ваксината има най-висок афинитет към TLR-2, следван от TLR-5, въпреки че успя да се свърже с други TLRs в по-малка степен. Взаимодействието с TLRs е от съществено значение за предизвикване на защитен имунитет, тъй като предишни проучвания, включващи животински модели, документират, че различни видове Leishmania или техните антигенни компоненти взаимодействат с различни TLRs, което води до интензивен имунен отговор при заразени гостоприемници. За да се изпълнят изискванията за задоволителна експресия на протеина на рекомбинантната ваксина в гостоприемниковата система на E. coli (K12), беше извършена оптимизация на кодон чрез прилагане на инструмента JCat, който коригира съдържанието на CAI и GC на последователността, правейки я подходяща за експресия в E. coli. Клонирането in silico също беше извършено с помощта на базирания на плазмид експресионен вектор pET28a(+), за да се покаже осъществимостта на последователността за клониране и свръхекспресия за постигане на повишено производство на рекомбинантен ваксинен протеин. Беше направено прогнозиране на вторичната структура на иРНК, кодирана от химерната генна последователност, за да се покаже стабилността на сгънатата конформация на иРНК, която ще повлияе на ефективния процес на транслация в бактериалния гостоприемник. Стабилизиращите мутации са създадени чрез добавяне на нови дисулфидни връзки в протеина на ваксината, тъй като това ще допринесе за силата на естествения протеин, правейки го податлив за допълнителни биохимични, имунологични и биотехнологични изследвания.

Фиг. 9 C-immsim базирана на сървър имунна симулация. a Генериране на общ антиген и съответно антитяло, b профил на производство на цитокини, c и d генериране на хелперни Т клетки и общ брой (активни и в покой) цитотоксични Т лимфоцити, e В клетъчен отговор след прилагане на ваксината

Фиг. 10 Молекулярна динамична симулация. a Деформируемостта на основната верига, посочена от панти, b генериран от NMA B фактор, показващ стабилност на протеина, c собствена стойност за деформиране на структурата на докинг комплекса, d индивидуален (лилав) % от дисперсията и кумулативен (зелен) на структурата, e корелирана ковариационна матрица (червено), некорелирано (бяло) или антикорелирано (синьо) между двойки атоми, модел на еластична мрежа, показващ свързани пружини между двойки атоми, по-тъмно сиво, обозначени твърди пружини и обратно

ползи от добавката Cistanche-увеличаване на имунитета

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Заключение

В настоящата работа ние използвахме обратен ваксинологичен подход за проектиране in silico на поливалентна мулти-субединица пептидна ваксина срещу човешка лайшманиоза (както висцерална, така и кожна), която може да осигури хетероложна защита от обикновените паразити на Leishmania, заразяващи хората и, следователно, може да се счита за широкоспектърно по природа. Същото може да се използва за обща програма за ваксиниране за контрол и изкореняване на болестта като допълнителна стратегия заедно с наличните в момента химиотерапевтични средства. В допълнение, използвахме IL-12 като естествен адювант вместо всеки нехуманизиран синтетичен пептид. Използването на IL-12 като адювант ще увеличи имуногенността на ваксината, без да причинява неблагоприятни странични ефекти в тялото на гостоприемника. При условие, че пептидът на ваксината е съставен от различни силно запазени и потенциално имуногенни пептиди, получени от пет вида патогенна Leishmania, е полезно да се предизвика кръстосан имунитет при ваксинирани индивиди, като по този начин също има терапевтични и профилактични предимства. Различни строги имуноинформационни анализи, използващи няколко изчислителни инструмента, установиха, че предложената ваксина е имуногенна, стабилна и възпроизводима като рекомбинантен протеин и безопасна за изпитвания върху хора. Въпреки това остава да се извърши експериментално валидиране, за да се гарантира правилното предизвикване на защитен и дълготраен имунитет и да се изключи токсичността.

Препратки

1. De-Brito RCF, Cardoso JMO, Reis LES, Vieira JF, Mathias FAS, Roatt BM, Agiuar-Soares RDDO, Ruiz JC, Resende DM et al. (2018) Пептидни ваксини за лейшманиоза. Front Immunol 9:1043

2. Okwor I, Uzonna J (2016) Социална и икономическа тежест на човешката лайшманиоза. Am J Trop Med Hyg 94 (3): 489–493. https://doi. org/10.4269/ajtmh.15-0408

3. Mutiso JM, Macharia JC, Gicheru MMJ (2010) Biomed Res 24(1):16–25. https://doi.org/10.1016/S1674-8301(10)60004-8

4. Gillespie PM, Beaumier CM, Strych U, Hayward T, Hotez PJ, Bottazzi ME (2016) Състояние на изследването на ваксината и разработването на ваксини за лайшманиоза. Ваксина 34(26):2992–2995. https:// doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.12.071

5. Joshi S, Rawat K, Yadav NK, Kumar V (2014) Siddiqi MI и Dube A (2014) Висцерална лейшманиоза: напредък в разработването на ваксина чрез класически и молекулярни подходи. Преден имунол 5:380. https://doi.org/10.3389/fmmu.2014.00380

6. Khatoon N, Pandey RK, Prajapati VK (2017) Изследване на секреторни протеини на Leishmania за проектиране на B и T клетъчна мулти-епитопна субединица ваксина с помощта на имуноинформатичен подход. Sci Rep 7:8285

7. Goto Y, Bhatia A, Raman VS, Liang H, Mohammad R, Picone AF, Vidal SEZ, Vedvick TS et al (2011) KSAC, първият дефиниран кандидат за полипротеинова ваксина за висцерална лайшманиоза. Clin Vaccine Immunol 18(7):1118–1124. https://doi.org/10.1128/CVI. 05024-11

8. Kedzierski L (2010) Ваксина срещу лайшманиоза: къде сме днес? J Glob Infect Dis 2(2):177–185. https://doi.org/10.4103/0974- 777X.62881

9. Nagill R, Kaur S (2011) Кандидати за ваксина срещу лейшманиоза: преглед. Int Immunopharmacol 11 (10): 1464–1488. https://doi.org/ 10.1016/j.intimp.2011.05.008

10. Coler RN, Reed SG (2005) Второ поколение ваксини срещу лайшманиоза. Тенденции Parasitol 21 (5): 244–249

11. Fernández L, Carrillo E, Sánchez-Sampedro L, Sanchez C, Ibarra Meneses AV, Jimenez MA, Almeida VDA, Esteban M et al (2018) Антигенност на Leishmania-активиран c-киназен антиген (LACK) в мононуклеари на човешка периферна кръв клетки и защитен ефект от първична усилваща ваксинация с pCI-neo-LACK плюс атенюирани LACK-експресиращи ваксиниа вируси в хамстери. Front Imunol 9:843. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.00843

12. Kelly BL, Stetson DB, Locksley RM (2003) LACK антиген на Leishmania major е необходим за ефективно паразитиране на гръбначни животни. J Exp Med 198 (11): 1689–1698. https://doi.org/10.1084/jem.20031 162

13. De Mendonça SC, Cysne-Finkelstein L, Matos DC (2015) Кинетопластиден мембранен протеин-11 като кандидат за ваксина и фактор на вирулентност при Leishmania. Front Imunol 6:524. https://doi.org/ 10.3389/fmmu.2015.00524

14. Joshi PB, Kelly BL, Kamhawi S, Sacks DL, McMaster WR (2002) Целевата генна делеция в Leishmania major идентифицира лейшманолизин (GP63) като вирулентен фактор. Mol Biochem Parasitol 120(1):33–40. https://doi.org/10.1016/s0166-6851(01)00432-7

15. McMahon-Pratt D, Rodriguez D, Rodriguez JR, Zhang Y, Manson K, Bergman C, Rivas L, Rodriguez JL et al (1993) Рекомбинантни вируси на ваксиния, експресиращи GP46/M-2, предпазват от инфекция с Leishmania. Infect Immun 61(8):3351–3359

16. Holakuyee M, Mahdavi M, Zuhair MH, Abolhasani M (2012) Промастиготи, обогатени с протеин на топлинен шок на Leishmania major, индуциращи Th2 имунен отговор при BALB/c мишки. Iran Biomed J 16(4):209–217. https://doi.org/10.6091/ibj.1098.2012

17. MacLean L, Price H, O'Toole P (2016) Проучване на пътя за износ на Leishmania хидрофилен ацилиран повърхностен протеин B (HASPB) чрез методи за изобразяване на живи клетки. Методи Mol Biol 1459:191–203. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3804-9_13

18. Maharana BR, Tewari AK, Singh V (2015) Преглед на кинетопластидната парафагелна пръчка. J Parasit Dis 39(4):589–595. https:// doi.org/10.1007/s12639-014-0422-x

19. Mahmoudzadeh NH, McKerrow JH (2004) Leishmania tropica: цистеиновите протеази са от съществено значение за растежа и патогенността. Exp Parasitol 106(3–4):158–163. https://doi.org/10.1016/j.exppara. 2004.03.005

20. Mundodi V, Kucknoor AS, Gedamu L (2005) Роля на Leishmania (Leishmania) chagasi amastigote cysteine ​​protease в оцеляването на пътнически паразити: проучвания чрез генно разрушаване и инхибиране на антисенс иРНК. BMC Mol Biol 6:3. https://doi.org/10.1186/ 1471-2199-6-3

21. Rogers ME (2012) Ролята на протеофосфогликаните на leishmania при предаването на пясъчни мухи и инфекцията на гостоприемника бозайник. Front Microbiol 3:223. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00223

22. Bhowmick S, Ali N (2009) Идентифициране на нови антигени на Leishmania donovani, които помагат да се определят корелатите на медиираната от ваксина защита при висцерална лайшманиоза. PLoS One 4(6):e5820. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0005820

23. Assis TM, Mancini DT, Ramalho TC, da Cunha EFF (2014) In silico проучване на Leishmania donovani - тубулин и инхибитори. J Chem. https://doi.org/10.1155/2014/492579