In vitro оценка на най-активните пробиотични щамове, способни да подобрят функциите на чревната бариера и да предотвратят възпалителни заболявания на стомашно-чревната системаⅡ

2. Материали и методи

2.1. Клетъчни култури

Клетки Caco{{0}} от човешки кавказки аденокарцином на дебелото черво (ATCC® HTB-37™) и HT29-MTX клетки, отделящи епителна слуз от човешко дебело черво (Sigma Aldrich) за първи път са култивирани поотделно, като и двете са използвали DMEM (Gibco) среда, допълнена с 10% фетален говежди серум (Gibco), 100 IU/mL пеницилин, 100 mg/mL стрептомицин (Gibco) и 2 mM глутамин (Gibco), при 37 ◦C в 5% CO2 атмосфера. След това съвместните култури бяха поставени в 12-плаки wellTranswell® (с 12 mm поликарбонатна вложка и 0,4 µm пори) чрез посяване на клетките в базолатералното отделение в съотношение 75:25 Caco-2:HT 29-MTX и се извършва в продължение на 21 дни, като се сменя средата на всеки 2 дни.

Кликнете, за да облекчите бързо запека

2.2. Бактериални щамове

Щамове Lactobacillus, включително Limosilactobacillus fermentum, изолиран от биволско мляко [32], Levilactobacillus brevis SP-48, Lacticaseibacillus rhamnosus IMC501, Limosilactobacillus reuteri LR92 и Lacticaseibacillus paracasei IMC502, предоставени от ръководителя на проекта Incube, R&D—IBSA Farmaceutici Italia, са култивирани във ферментация в биореактор обработва и се изсушава чрез замразяване, за да се получат праховете, използвани като изходен материал. Преди експеримента праховете бяха ресуспендирани и отгледани в бульон на Man, Rogosa и Sharpe (MRS-Oxoid) при 37 ◦C в микроаерофилни условия в продължение на 24 часа.

2.3. Клетъчно лечение

Ко-култивирани клетки бяха третирани с различни щамове на Lactobacillus spp. (108 CFUs/mL) при множество инфекции (MOI) от 100, самостоятелно или в комбинация с 20 µg/mL липополизахарид (LPS) от S. Typhimurium, за 24 часа при 37 ◦C при 5% CO2 в DMEM без антибиотици.

2.4. PCR в реално време

За да се оцени експресията на про- и противовъзпалителни цитокини, HBD-2 и TJs, клетките в края на лечението се промиват три пъти със стерилен PBS и общата РНК се екстрахира с помощта на High Pure RNA Isolation Kit ( Roche Diagnostics). Общо 2{{20}}0 ng клетъчна РНК бяха обратно транскрибирани (Expand Reverse Transcriptase, Roche) в комплементарна ДНК (cDNA) с помощта на произволни хексамерни праймери (randomhexamers, Roche) при 42 ◦C за 45 минути, съгласно инструкциите на производителя. PCR в реално време за IL-6, IL-8, TNF- , IL-1 , TGF- , HBD-2, Occludin, Zonulin-1 и Claudin{{ 14}} беше проведено с комплекта LC Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche Diagnostics), използвайки 2 µL cDNA, съответстващи на 10 ng обща РНК в 20 µL краен обем, 3 mMMgCl2 и 0,5 µM сенс и антисенс праймери ( Маса 1). След усилване, анализът на кривата на топене се извършва чрез нагряване до 95 °C за 15 s при скорост на температурен преход от 20 °C/s, охлаждане до 60 °C за 15 s със скорост на температурен преход от 20 °C/s и след това нагряване на пробата при 0,1 ◦C/s до 95 ◦C. След това резултатите бяха анализирани с помощта на софтуера LightCycler (Roche Diagnostics). Стандартната крива на всяка двойка праймери беше установена със серийни разреждания на cDNA. Всички PCR бяха проведени в три екземпляра. Спецификатана продуктите на амплификацията се проверява с помощта на електрофореза върху 2% агарозен гел и визуализация чрез оцветяване с етидиев бромид [6].

2.5. ELISA анализ

Наличието на IL-6, IL-8, IL-1, TNF-, TGF-, HBD-2, Zonulin-1, Occludin и Claudin{{7 }} в клетъчните лизати на ко-култури Caco-2/HT29-MTX, заразени с различни щамове лактобацили със или без LPS, се анализира с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA; Invitrogen, IL{{12) }}, IL-8, IL-1 алфа, TNF алфа и TGF бета-1 HumanELISA комплект; Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Defensin 2, бета (човешки)—ELISA комплект; Elabscience Biotechnology Човешки зонулин, човешки OCLN (оклудин) и човешки CLDN1 (Claudin 1) ELISA комплект).

2.6. Тест за адхезия и инвазивност

Способността на L. brevis, L. reuteri и L. rhamnosus да намаляват способността за адхезивност и инвазивност на S. Typhimurium и EIEC в чревни кокултури беше изследвана в три различни експериментални типа: (i) конкурентен анализ, при който чревните епителни клетки бяха инкубирани едновременно с лактобацили (108 CFUs/mL) и S. Typhimurium или EIEC (108 CFUs/mL) за 2 часа. (ii) Тест за инхибиране, при който клетките се инкубират предварително с лактобацили (108 CFUs/mL) в продължение на 2 часа и след това се добавя S. Typhimurium или EIEC (108 CFUs/mL) и се инкубират за допълнителни 2 часа. (iii) Анализ на изместване, при който клетките бяха предварително инкубирани със S. Typhimurium или EIEC (108 CFUs/mL) за 2 часа и след това бяха добавени лактобацили (108 CFUs/mL) и допълнително инкубирани за 2 часа. В края на това време, заразените монослоеве бяха обилно промити в PBS, след това лизирани с разтвор от 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) в PBS за 10 минути при стайна температура температура за преброяване на интернализираните бактерии. Аликвотните части от клетъчни лизати бяха серийно разредени и поставени върху Hektoen агар (OXOID) и инкубирани при 37 ◦C за една нощ, за да се определи количествено общата жизнеспособна клетъчно-асоциирана бактерия (CFU/mL). За анализи за инвазивност, след инкубиране с бактерии, заразените монослоеве бяха обилно промити със стерилен PBS и допълнително инкубирани за допълнителни 2 часа в DMEM среда, допълнена с гентамицинсулфат (250 µg ml-1) (Sigma-Aldrich), за да се убият извънклетъчните бактерии, след това клетките бяха лизирани и поставени, както е описано по-горе, за количествено определяне на общия брой интернализирани бактерии (CFU/mL).

2.7. Статистически анализ

Значимите разлики между групите бяха оценени чрез двупосочен ANOVA с помощта на GraphPad Prism 8.0 и сравнението между средните стойности беше изчислено с помощта на t-теста на Стюдент. Данните са изразени като средно ± стандартно отклонение (SD) от три независими експеримента.

Естествено билково лекарство за облекчаване на запек - Cistanche

Cistanche е род паразитни растения, който принадлежи към семейство Orobanchaceae. Тези растения са известни със своите лечебни свойства и се използват в традиционната китайска медицина (ТКМ) от векове. Видовете Cistanche се срещат предимно в сухи и пустинни райони на Китай, Монголия и други части на Централна Азия. Растенията Cistanche се характеризират със своите месести, жълтеникави стъбла и са високо ценени заради потенциалните си ползи за здравето. В TCM се смята, че Cistanche има тонизиращи свойства и обикновено се използва за подхранване на бъбреците, повишаване на жизнеността и поддържане на сексуалната функция. Използва се и за справяне с проблеми, свързани със стареенето, умората и цялостното благосъстояние. Въпреки че Cistanche има дълга история на употреба в традиционната медицина, научните изследвания за неговата ефикасност и безопасност продължават и са ограничени. Известно е обаче, че съдържа различни биоактивни съединения като фенилетаноидни гликозиди, иридоиди, лигнани и полизахариди, които могат да допринесат за лечебните му ефекти.

на Wecistanche'sцистанче на прах, цистанче таблетки, цистанче капсули, и други продукти са разработени с помощта напустиненцистанчекато суровини, всички те имат добър ефект за облекчаване на запек. Специфичният механизъм е следният: Смята се, че Cistanche има потенциални ползи за облекчаване на запек въз основа на традиционната му употреба и някои съединения, които съдържа. Докато научните изследвания конкретно върху ефекта на Cistanche върху запека са ограничени, се смята, че има множество механизми, които могат да допринесат за потенциала му за облекчаване на запек. Слабителен ефект:Цистанчеотдавна се използва в традиционната китайска медицина като средство за лечение на запек. Смята се, че има лек слабителен ефект, който може да помогне за насърчаване на движенията на червата и да предизвика запек. Този ефект може да се дължи на различни съединения, открити в Cistanche, като фенилетаноидни гликозиди и полизахариди. Овлажняване на червата: Въз основа на традиционната употреба се счита, че Cistanche има овлажняващи свойства, специално насочени към червата. Насърчаването на хидратацията и смазването на червата може да помогне за омекотяване на инструментите и да улесни по-лесното преминаване, като по този начин облекчава запека. Противовъзпалителен ефект: Запекът понякога може да бъде свързан с възпаление в храносмилателния тракт. Cistanche съдържа определени съединения, включително фенилетаноидни гликозиди и лигнани, за които се смята, че имат противовъзпалителни свойства. Чрез намаляване на възпалението в червата може да помогне за подобряване на редовността на движението на червата и облекчаване на запека.