In vitro инхибиране на бъбречната секреция на OCT2 и MATE1 от антиеметични лекарства
Mar 18, 2022
Блеси Джордж1, Ся Уен1, Едгар А. Джеймс2, Мелани С. Радост3,4,5,†и Лорън М. Алексунес
Резюме:Преносителят на органични катиони 2 (OCT2) и мултилекарствен и токсинен екструзионен протеин 1 (MATE1) медиират бъбречната секреция на лекарства. Скорошни проучвания показват, че ондансетрон, 5-HT3 антагонист, използван за предотвратяване на гадене и повръщане, може да инхибираOCT2- и MATE1-посредничен транспорт. Целта на това проучване беше да се тества способността на пет 5-HT3 антагонистични лекарства да инхибиратOCT2и MATE1 транспортери. Транспортирането на субстрата на сондата OCT2/MATE1 ASP plus беше оценено с помощта на два модела: (1) HEK293бъбрекклетки, свръхекспресиращи човешкиOCT2или MATE1, и (2) MDCK клетки, трансфектирани с човешкиOCT2and MATE1. In HEK293 cells, the inhibition ofASP+ uptake by OCT2 listed in order of potency was palonosetron (IC50: 2.6 µM) > ondansetron >granisetron > tropisetron > dolasetron (IC50: 85.4 µM) and the inhibition of ASP+ uptake by MATE1in order of potency was ondansetron (IC50: 0.1 µM) > palonosetron = tropisetron > granisetron >доласетрон (IC50: 27,4 µM). Ондансетрон (0.5–20 µM) инхибира базолатералния към апикалния трансцелуларен транспорт на ASP плюс до 64 процента. По-високи концентрации (10 и 20 µM) на палоносетрон, трописетрон и доласетрон по подобен начин намаляват трансцелуларния транспорт на ASP plus. В двойно трансфектирани OCT2-MATE1 MDCK клетки, ондансетрон в концентрации от 0,5 и 2,5 µM причинява значително вътреклетъчно натрупване на ASP plus. Взети заедно, тези данни предполагат, че 5-HT3 антагонистичните лекарства могат да инхибират бъбречната секреция на катионни лекарства чрез намеса във функцията OCT2 и/или MATE1.
Ключови думи:OCT2; MATE1; катионен; 5-НТ3 антагонист;бъбрек; секреция; транспорт
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com
Cistanche tubulosa предотвратявабъбрекзаболяване, щракнете тук, за да получите пробата
1. Въведение
Бъбречната секреция се постига чрез координирано поглъщане и изтичане на лекарства през тубулния епител. За лекарства и токсиканти, които са органични катиони, техният трансепителен транспорт във филтрата първо се постига от транспортера на органични катиони 2 (OCT2) на базолатералната повърхност и впоследствие от транспортера за мултилекарство и екструзия на токсини 1 (MATE1) на границата на четката мембрана. Преди откриването на гените OCT2/SLC22A1 и MATE1/SLC47A1 беше добре разбрано, че секрецията на органични катиони може да бъде инхибирана фармакологично [1]. Използвайки различни експериментални подходи в различни предклинични видове, беше демонстрирано, че органичните катиони претърпяват активен транспорт и бъбречна секреция [2–4]. След тези ранни наблюдения, изследванията напреднаха, за да разберат не само молекулярните механизми на секрецията на органични катиони, но и потенциала за клинично значими лекарствени взаимодействия след разрушаването на OCT2 и MATE1 (прегледано в [5]).
Антагонистите на серотониновия 5-HT3 рецептор се очертаха като критични лекарства за справяне с гадене и повръщане. Серотонинът се освобождава от ентерохромафинните клетки на тънките черва. 5-HT3 антагонистите инхибират йонотропния лиганд-зависим йонен канал на аферентните нерви от вагуса и предотвратяват рефлекса на повръщане [6]. Ондансетрон е първият 5-HT3 антагонист, одобрен за предотвратяване на гадене и повръщане, причинени от химиотерапия [7,8]. Оттогава са разработени допълнителни лекарства в този клас (включително трописетрон, гранисетрон, доласетрон и палоносетрон) [9]. Въпреки че основното терапевтично показание на 5-HT3 антагонистите е превенцията на химиотерапия и индуцирано от радиация повръщане, те също са одобрени за лечение на следоперативно гадене и повръщане и се използват не по предназначение за лечение на сутрешно гадене, хиперемезис при бременност , следоперативен делириум и пруритус [10–14].
Като се има предвид катионната природа на 5-HT3 антагонистите (Фигура 1), те са се появили като субстрати и инхибитори на OCT и MATE транспортери. Проучванията in vitro разкриват, че ондансетрон и трописетрон са субстрати и инхибитори на OCT1 и OCT2 [15–20]. Освен това е доказано, че индивиди с варианти на загуба на функция в гена OCT1/SLC22A1 имат променена фармакокинетика на трописетрон и подобрена клинична ефикасност [16]. По същия начин, ондансетрон може да инхибира MATE транспортерите, което води до бъбречно натрупване на антидиабетното лекарство метформин, както и повишена нефротоксичност на противораковото лекарство цисплатин [19]. При хора ондансетрон намалява бъбречния клирънс на метформин, вероятно чрез инхибиране на ефлукса на MATE1 [21]. Заедно тези данни сочат потенциала на 5-HT3 антагонистите да инхибират трансепителната секреция на лекарства чрез OCT2 и MATE1. Следователно, ние се опитахме систематично да сравним пет 5-HT3 антагонисти за тяхната способност да инхибират човешки OCT2 и MATE1-медииран транспорт на пробен катионен субстрат, използвайки единично и двойно трансфектиранбъбрекклетки. Трябва да се отбележи, че настоящото проучване се фокусира основно върху MATE1, като нива на MATE2-K протеин в човешкиябъбрекпо-рано беше показано, че са под долната граница на количествено определяне с помощта на масспектрометрия [22].
2. Резултати
2.1. Характеризиране на ASP plus като флуоресцентен субстрат в HEK293 клетки, свръхекспресиращи OCT2 и MATE1
Първоначалните проучвания характеризират поемането на ASP plus в клетки, свръхекспресиращи празен вектор (EV), OCT2 или MATE1 (Фигура 2). ASP plus показва зависим от времето (Фигура 2A) и зависим от концентрацията (Фигура 2B) поглъщане както в OCT2-, така и в MATE1-експресиращи клетки и показва кинетика на насищане (OCT2: Vmax 8,1 nmol/mg/min , Km 2,9 uM, R2 0.95; MATE1: Vmax 3,4 nmol/mg/min, Km 8,2 uM, R2 0.96). EV клетките показват минимално натрупване на ASP плюс (Vmax 1,9 nmol/mg/min, Km 37,3 uM, R2 0.92). Въз основа на тези констатации, поглъщането на ASP плюс се определя количествено след 1 минута (линеен диапазон за OCT2 и MATE1 транспорт) при концентрация от 10 uM, което осигурява достатъчна чувствителност за флуоресцентно откриване и скрининг на 5-HT3 антагонисти като инхибитори.
За да се гарантира, че тези условия отразяват активния транспорт от всеки транспортер, бяха определени IC5{{10}} стойностите на циметидин, добре установен инхибитор на OCT2 и MATE1 (Фигура 3 и Таблица 1). IC50 за циметидин е 24,5 ± 4,0 uM в OCT2-експресиращи клетки и 0,23 ± 0,2 uM в MATE1-експресиращи клетки, в съответствие с публикуваните данни, показващи инхибиране на MATE1 при по-ниски концентрации [18,20]. Циметидин няма влияние върху ASP плюс поглъщането в EV клетки.
2.2. Инхибиране на OCT2- и MATE1-медииран транспорт от антиеметично лекарство в HEK293 клетки
Пет различни 5-HT3 антагонисти (ондансетрон, палоносетрон, гранисетрон, трописетрон и доласетрон) бяха оценени за тяхното инхибиране на OCT2 и MATE1 транспорта в HEK293 клетки, като се използва ASP plus като субстрат (Фигура 3). Зависимо от концентрацията намаление на ASP плюс поглъщането се наблюдава в OCT2- и MATE1-експресиращи клетки в присъствието на всичките пет 5-HT3 антагонисти, тествани в диапазон от концентрации. Стойностите на IC50 за инхибирането на ASP плюс натрупването от 5-HT3 антагонисти, използващи тествани диапазони на концентрация, са показани в таблица 1. С изключение на гранисетрон, другите 5-HT3 антагонисти инхибираха MATE1 по-мощно, отколкото те. OCT2. OCT2-медиираният транспорт беше инхибиран до ~90 процента, докато MATE1-медиираният транспорт беше инхибиран до ~70 процента при тестваните концентрации.
Като цяло поглъщането на ASP plus от EV клетки не се променя в голяма степен от 5-HT3 антагонистите. Беше отбелязано обаче, че палоносетрон и трописетрон стимулират допълнително усвояване на ASP плюс в клетките на EV и най-високата концентрация на гранисетрон причинява леко намаляване на натрупването на ASP плюс.
2.3. Характеризиране на трансклетъчния транспорт и вътреклетъчното натрупване на ASP плюс в OCT2/MATE1-експресиращи MDCK клетки
За да се изследва комбинираният принос на OCT2 и MATE1 в трансепителна секреция, бяха проведени последващи експерименти в MDCK клетки, които поляризират с базолатерални (OCT2) и апикални (MATE1) повърхности. Експресията на OCT2 и MATE1 протеина беше потвърдена в двойно трансфектирани MDCK клетки, използвайки Western blotting (Фигура 4А). Трансцелуларният транспорт на субстрата на катионната проба ASP плюс (25 uM) беше тестван в тези клетки с използване на Transwell вложки. Базолатералният към апикален (B-към-A) транспорт на ASP plus е много по-голям (до 28-кратно за 120 минути), отколкото апикален към базолатерален (A-към-B) транспорт в OCT2/MATE1 двойно трансфектирани клетки (Фигура 4В). Съотношението B-към-A/A-към-B ефлукс на 120 min се оценява на 2,7 за OCT2/MATE1 клетки, поддържащи активната секреция на ASP plus. Обратно, контролните клетки показват много по-нисък ASP плюс транспорт в двете посоки в сравнение с OCT2/MATE1 клетките. Транспортът B-to-A на ASP plus е само значително по-висок в сравнение с транспорта A-to-B в контролните клетки на 90 (1{40}}кратно) и 120 минути (1.7-кратно ). Всички допълнителни анализи на инхибиране бяха извършени в посока В-към-А.
Способността на химикалите да инхибират ASP плюс потока и да се натрупват в OCT2/MATE1 двойно трансфектирани клетки при определените тестови условия беше оценена с помощта на три инхибитора на положителна контрола (циметидин 5 и 50 uM, пириметамин 1 uM и оланзапин 20 uM) (Фигура 4C). Циметидинът е известен инхибитор на OCT2 и MATE1, с по-голяма ефективност за MATE1 (Таблица 1) [18]. Пириметаминът е специфичен инхибитор на MATE1 [23], докато за оланзапин е установено, че инхибира OCT2 по-мощно (допълнителна фигура S1) [18,20]. И трите химикала инхибират трансцелуларния поток на ASP плюс (18 процента циметидин 5 uM, 40 процента циметидин 50 uM, 36 процента пириметамин 1 uM и 28 процента оланзапин 20 uM за 120 минути).
Натрупването на ASP плюс вътреклетъчно също беше количествено определено в лизати на 120 min. Циметидин и пириметамин повишават вътреклетъчното натрупване на ASP plus съответно с 18- пъти и 1.3-пъти (основно поради инхибирането на MATE1), докато оланзапин намалява вътреклетъчното натрупване на ASP plus с 51 процент (поради инхибирането на OCT2). В контролните клетки не е наблюдавано значително инхибиране на B-към-A транспорта на ASP plus в нито една от точките от време. В контролните клетки също няма значителни промени във вътреклетъчното натрупване на ASP плюс в сравнение с контролните клетки на носителя, с изключение на умерено намаление на натрупването на ASP плюс в присъствието на оланзапин 20 uM.
2.4. Инхибиране на трансцелуларния транспорт на ASP plus от 5-HT3 антагонисти в OCT2/MATE1-експресиращи MDCK клетки
Петте 5-HT3 антагонисти (ондансетрон, палоносетрон, гранисетрон, трописетрон и доласетрон) бяха оценени за тяхната способност да повлияват трансцелуларния транспорт и вътреклетъчното натрупване на ASP плюс в OCT2/MATE1 двойно трансфектирани клетки (Фигури 5 и 6). Циметидин (50 uM) беше включен във всеки експеримент в паралелен набор от Transwells като положителна контрола. Интересно е, че всичките пет 5-HT3 антагонисти показват различни степени на инхибиране на трансцелуларния В-към-А транспорт на ASP плюс (Фигура 5). В сравнение с клетките, третирани с носител, ондансетрон инхибира B-към-A транспорта на ASP plus по начин, зависим от концентрацията, с 36 процента инхибиране на 120 min при най-високата тествана концентрация (20 uM). Палоносетрон и трописетрон също показаха зависимо от концентрацията инхибиране на ASP плюс секреция, което беше значимо при 10 и 20 uM за всички времеви точки. Инхибиране на ASP плюс секреция се наблюдава с палоносетрон и трописетрон при 20 uM. Доласетрон при 10 и 20 uM инхибира ASP плюс транспорт само на 120 min. И накрая, гранисетрон не променя B-към-A транспорта на ASP plus при нито една тествана концентрация. Контролните клетки не показват значително инхибиране на транспорта от В към А на ASP плюс с който и да е от 5-HT3 антагонистите (данните не са показани).
2.5. ASP плюс вътреклетъчно натрупване в OCT2/MATE1-Експресиращи MDCK клетки, следващи
Лечение с 5-HT3 антагонисти
Ниските концентрации (0.5 и 2.5 uM) на ондансетрон доведоха до 1.3-кратно увеличение на вътреклетъчния ASP плюс натрупване в OCT2/MATE1-експресиращи клетки, докато нямаше разлика в сравнение с носители при по-високи концентрации (10 и 20 uM) (Фигура 6). Въпреки това, в контролните клетки има намаление (40 процента) в натрупването на ASP плюс при високи концентрации на ондансетрон. В OCT2/MATE1 клетки трописетрон и гранисетрон повишават ASP плюс натрупването (съответно 1,5 и 13-кратно) при най-високата концентрация (20 uM). Не са наблюдавани значителни промени в натрупването на ASP плюс при палоносетрон или доласетрон.
3. Дискусия
OCT2 и MATE1 са ключови транспортери, които координират бъбречната секреция на органични катиони. Те споделят редица припокриващи се субстрати, включително метформин, цисплатин, ламивудин и ентекавир, както и избрани 5-HT3 антагонисти [15–20,24]. Предишни проучвания предполагат, че 5-HT3 антагонистите могат също да инхибират транспорта от OCT2 и MATE1. Най-вече е доказано, че ондансетрон намалява транспорта на цисплатин и метформин от MATE1 [19]. Настоящото проучване имаше за цел да разшири тази предишна работа, за да сравни пет 5-HT3 антагонисти за способността им да инхибират OCT2 и MATE1 поотделно, когато са свръхекспресирани в HEK293 клетки и когато са коекспресирани в MDCK клетки и се отглеждат върху Transwell вложки. Ондансетрон и палоносетрон успяха да инхибират усвояването на пробен катионен химикал, ASP plus, в HEK293 клетки, експресиращи OCT2 или MATE1, най-вече при ниски концентрации като 0.1–0.5 uM . По подобен начин, гранисетрон, трописетрон и доласетрон също са в състояние да инхибират всеки транспортер (при по-високи концентрации обаче). Използвайки OCT2/MATE1 двойно трансфектирани MDCK клетки, ондансетрон инхибира базолатералната към апикалната ASP плюс секреция при всички тествани концентрации (0,5–20 uM), което се наблюдава само при по-високи концентрации за палоносетрон, трописетрон и доласетрон. Тези данни, получени с помощта на флуоресцентен субстрат на проба, предполагат потенциал за OCT2- и MATE1-медиирани лекарствени взаимодействия с 5-HT3 антагонисти.
Данните, генерирани в OCT2/MATE1 двойно трансфектирани клетки, до голяма степен се съгласуват с данните от HEK293, с изключение на гранисетрон. Ондансетрон, палоносетрон и трописетрон показват зависимо от концентрацията инхибиране на транспорта B-към-A на ASP плюс с ред на мощности, отразяващи наблюдаваното при инхибиране на MATE1, наблюдавано в HEK293 клетки. Изненадващо, гранисетрон не проявява никакво значително инхибиране в OCT2/MATE1 MDCK клетки, дори при концентрации пет пъти над концентрацията IC50, наблюдавана в HEK293 клетки, експресиращи OCT2 или MATE1. Тъй като MDCK клетките приличат на нативните тубулни клетки в по-голяма степен, отколкото клетките HEK293, има потенциал за промяна на разположението на гранисетрон поради експресията на ендогенни транспортни ортолози на OCT2 или MATE1, или потенциално други транспортери. Например, MDCK клетки силно експресират кучешкия P-гликопротеинов транспортер [25], което може да доведе до ефлукс на гранисетрон. В подкрепа на тази спекулация е фактът, че единичен нуклеотиден полиморфизъм в човешкия транспортер MDR1/ABCB1 подобрява клиничната ефикасност на гранисетрон за лечение на повръщане [26]. Тези данни предполагат, че гранисетрон може да бъде субстрат за кучешки P-гликопротеин, причинявайки промяна във вътреклетъчната концентрация, изложена на транспортера MATE1.
Въпреки че има много припокриване между субстратите и инхибиторите на OCT и MATE транспортерите, съществуват разлики. Базираните на транспортер взаимодействия лекарство-лекарство често могат да зависят от идентичността на субстрата на жертвата, който се оценява, както е показано за OCT2 [27–29]. За OCT2 изборът на катионния субстрат има както количествено, така и качествено въздействие върху степента и вида на инхибирането [27,28]. Обратно, привидната константа на Михаелис на транспортирания субстрат и стойностите на IC50 за инхибирането на MATE1 в четири различни субстрата са сходни [30]. Тези данни предполагат, че има споделено място на свързване за взаимодействието на субстрати и инхибитори на външната повърхност на hMATE1. В резултат на това взаимодействията на 5-HT3 антагонисти с OCT2 и MATE1 могат да възникнат чрез различни механизми, въпреки споделения им катионен характер. Необходими са бъдещи проучвания за напредък в настоящото проучване, като се използва пробен субстрат и се оценяват взаимодействията със специфични лекарствени субстрати като циметидин, метформин и цисплатин.
Допълнителни класове лекарства извън 5-НТ3 антагонистите също се използват за предотвратяване на гадене и повръщане. В предварителни проучвания ние оценихме способността на други антиеметични лекарства да инхибират OCT2 и MATE1-медиирания транспорт на ASP плюс в HEK293 клетки. Интересно е, че оланзапин, прохлорперазин и метоклопрамид инхибират активността на OCT2 в диапазон от концентрации (допълнителна фигура S1). Нито едно от тези лекарства не инхибира активността на MATE1 при концентрация от 10 uM (данните не са показани). Други антиеметици, включително апрепитант и дексаметазон, не оказват влияние върху ASP плюс усвояването в OCT2- или MATE1-експресиращи HEK293 клетки (данните не са показани). В резултат на това може да има потенциал за други лекарства против повръщане (оланзапин, прохлорперазин и метоклопрамид), прилагани едновременно с 5-HT3 антагонисти, също да повлияят на бъбречната секреция на катиони, най-вече чрез способността им да инхибират усвояването на OCT2.
Важно е да се обмисли колко добре in vitro моделите рекапитулират характеристиките на ендогенния транспорт при човекабъбреци. Нивата на човешки OCT2 и MATE1 протеини преди това са били количествено определени в двойно трансфектирани MDCK клетки чрез LC-MS/MS (hOCT2 и hMATE1 бяха съответно 28,6 и 6,9 fmol/ug мембранен протеин) [31]. За сравнение, проучванията, определящи експресията на протеин в кората на човешкия бъбрек и мембраните на човешкия бъбрек, разкриват по-скромна разлика в експресията между двата транспортера или дори по-голяма експресия на MATE1 (OCT2 7).4 pmol/mg, MATE{{14 }}.1 pmol/mg) [22] и (OCT2 5 fmol/ug, MATE1 10 fmol/ug) [32]. Тези разлики между in vitro моделите и ендогенната човешка експресия на OCT2 и MATE1 трябва да бъдат взети предвид и включени в разработването на физиологично базирани фармакокинетични модели за потенциални катионни лекарствени взаимодействия в бъбреците.
Настоящото проучване се фокусира до голяма степен върху бъбречната секреция на катионни лекарства. Въпреки това е важно да се признае, че черният дроб също експресира OCT1 и MATE1, които позволяват жлъчния клирънс на катионни химикали. Това е важно, тъй като 5-HT3 антагонистите се различават по своята структура, метаболизъм, протеиново свързване и пътища на изчистване. Структурно 5-HT3 рецепторните антагонисти съдържат основен амин, ароматна или хетероароматна пръстенна система и карбонил (или подобна структура), който е копланарен на ароматния регион (Фигура 1) [33]. Трябва да се отбележи, че структурата на аминовата част се различава за ондансетрон и включва имидазол, докато 6-членните пръстени са включени в другите 5-HT3 антагонисти. Уместността на тези структурни разлики при взаимодействието с OCT2 и/или MATE1 изисква допълнително изследване, но може да обясни по-значимите ефекти на ондансетрон при по-ниски концентрации. В допълнение, някои 5-HT3 антагонисти се изчистват екстензивно отбъбрецикато родители или метаболити (като палоносетрон и трописетрон). Много от 5-HT3 антагонистите (включително ондансетрон, трописетрон, палоносетрон и гранисетрон) се метаболизират силно (48–95 процента) от ензимите на цитохром Р450 в черния дроб. Наскоро проучвания показват, че метаболитите могат да играят по-голяма роля във взаимодействията между лекарства, отколкото се смяташе преди [34]. По-нататъшно тестване на OCT2 и MATE1 транспорта с основните метаболити на 5-HT3 антагонисти, които надвишават 25 процента от родителската системна експозиция, е оправдано. По същия начин в химическия клас има лекарства с кратък полуживот (< 6="" h,="" ondansetron,="" and="" tropisetron),="" moderate="" half-lives="" (8–9="" h,="" granisetron,="" and="" dolasetron),="" and="" a="" long="" half-life="" (40="" h,="" palonosetron).="" these="" factors="" should="" be="" considered="" when="" evaluating="" potential="" drug-drug="" interactions="" using="" in="" vitro="" transporter="">
Въз основа на 2020 Ръководство на FDA за in vitro метаболизъм и проучвания за взаимодействие лекарство-лекарство, медиирано от транспортер [35], дадено лекарство има потенциал да инхибира транспортера in vivo, ако: стойността на Cmax (несвързан)/IC50 е по-голямо или равно на 0,1. Въз основа на тези насоки стойностите на MATE1 Cmax/IC50 за ондансетрон показват потенциални in vivo лекарствени взаимодействия при използване на ASP плюс като субстрат на пробата. Сравнението на стойностите на IC50 за другите 5-HT3 антагонисти с техните Cmax стойности (диапазон от високо наномоларно до ниско микромоларно) не предполага риск от лекарствено взаимодействие, поне с ASP плюс като субстрат на жертвата. По същия начин понастоящем не знаем интрареналните концентрации на 5-HT3 антагонистите, което би било важно за оценка на потенциални лекарствени взаимодействия MATE1. Има ограничени клинични данни, оценяващи свързаните с ондансетрон лекарствени взаимодействия с OCT/MATE субстрати. Например нивата на креатинин и метформин се повишават при здрави индивиди от ондансетрон поради инхибиране на бъбречния транспортер [21,36]. Интересно е, че ондансетрон не само намалява бъбречния клирънс на метформин, но също така подобрява показателите за глюкозен толеранс [21]. В други клинични проучвания се съобщава, че ондансетрон повишава нефротоксичността на субстратно лекарство, като потенциално променя медиираната от транспортера секреция в рамките набъбрек[37–39]. Заедно тези данни изискват по-нататъшно изследване на лекарствените взаимодействия на ондансетрон чрез инхибиране на OCT и MATE транспортери.
В обобщение, тези in vitro данни показват, че много от 5-HT3 антагонистите имат по-голяма ефективност спрямо инхибирането на MATE1, което повишава потенциала за повишена тубулна концентрация на катионни лекарства. Освен това, ондансетрон е достатъчно мощен, за да повиши вътреклетъчната концентрация на пробен субстрат, ASP плюс при концентрации, близки до клинично значимата Cmax. Тези данни са в съответствие с предишни in vivo проучвания при мишки, при които се наблюдава повишена медиирана от цисплатин нефротоксичност при едновременно приложение на ондансетрон [19]. Въз основа на настоящите критерии за оценка на потенциала за клинично взаимодействие лекарство-лекарство, другите 5-HT3 антагонисти, както и антиеметични лекарства, тествани в нашето проучване, вероятно представляват по-малък риск от клинично значимо лекарствено взаимодействие поради много по-ниските терапевтични плазмени концентрации и по-високи константи на инхибиране.
4. Материали и методи
4.1. Химикали
4-(4-(Диметиламино)стирил)-N-метил пиридиниев йодид (ASP плюс) е закупен от Life Technologies (Гранд Айлънд, Ню Йорк, САЩ). Трописетрон е закупен от Abcam (Кеймбридж, Масачузетс, САЩ). Всички останали химикали са от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ).
4.2. Клетъчни линии и клетъчна култура
Empty Vector (EV) контрол (pcDNA5-трансфектиран) и Flp-In човешки ембрионален бъбрек (HEK)293 клетъчни линии, стабилно експресиращи човешки MATE1 и OCT2 транспортери, бяха щедро предоставени от д-р Кати Джакомини от Калифорнийския университет, Сан Франциско. Клетките HEK293 се култивират в модифицирана на Dulbecco среда на Eagle (DMEM), допълнена с 10 процента фетален волски серум, 2 mM L-глутамин, 100 U/mL пеницилин, 100 ug/mL стрептомицин и 200 ug/mL хигромицин В. Вектор (pcDNA3. 1 плюс и pcDNA3.1/Hygro( plus )) и човешки OCT2/MATE1 двойно трансфектирани клетъчни линии Madin-Darby кучешки бъбрек (MDCK) бяха щедро предоставени от д-р Джоан Уанг от Университета на Вашингтон, Сиатъл, Вашингтон. MDCK клетките се поддържат в минимална есенциална среда (MEM), допълнена с 10 процента фетален волски серум, 500 ug/mL G418 и 200 ug/mL хигромицин В. Всички клетъчни линии се култивират в овлажнен инкубатор при 37oC с 5 процента CO2.
4.3. Тестове за инхибиране на поглъщане и ефлукс в клетки HEK293
OCT2- и MATE1-свръхекспресиращи HEK293 клетки се посяват в прозрачни покрити с поли-D-лизин 24-плаки с ямки (Fisher Scientific, Хановер Парк, Илинойс, САЩ) и се отглеждат в продължение на 24 часа до приблизително 90 процента конфлуент. След еднократно промиване с предварително загрят буфериран физиологичен разтвор на Hank (HBSS), клетките се инкубират предварително за 30 минути при 37oC с различни 5-HT3 антагонисти за OCT2 клетки или в 30 mM разтвор на NH4Cl в HBSS при pH 6,5 за MATE1 клетки за вътреклетъчни подкисляване. Поглъщането в OCT2 клетки беше инициирано чрез излагане на 10 uM флуоресцентен субстрат ASP плюс директно в инкубационната среда. Поглъщането в MATE1 клетки беше инициирано чрез прилагане на HBSS при рН 7.4, съдържащ 5-HT3 антагонисти и 10 uM флуоресцентен субстрат ASP плюс. След инкубиране в продължение на 1 минута при 37°С на шейкър, поглъщането на субстрата се спира чрез добавяне на леденостуден HBSS, съдържащ 500 uM циметидин. Средата се отстранява и се промива четири пъти с ледено студен HBSS. Клетките бяха лизирани с 1% Triton X-100. Флуоресценцията беше открита с помощта на Spectramax Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) при следните дължини на вълната (възбуждане 485 nm/излъчване 495 nm). Вътреклетъчната флуоресценция се нормализира до общата протеинова концентрация на клетъчни лизати от всяка ямка, като се използва анализ на бицинхонинова киселина (BCA) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Експериментите се повтарят три отделни пъти, с три до четири повторения във всеки експеримент.
4.4. Transwell изследвания в MDCK-OCT2/MATE1 клетки
Control and OCT2/MATE1-expressing MDCK cells were evaluated for protein expression of OCT2 and MATE1 using SDS-PAGE and western blotting with specific primary antibodies (OCT2, sc292622 1:500 and MATE1, sc133390 1:250, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), followed by an antirabbit HRP-conjugated secondary antibody (1:1000, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) and Super Signal Western Dura Extended Duration Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Detection was performed with a FluorChem imager (ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA). Both MDCK cell lines were seeded on 0.4 um transwell inserts (VWR, Radnor, PA, USA) at a density of 2 × 105 cells/cm2. Transport experiments were performed 3 to 5 days after seeding. The integrity of MDCK monolayers was verified by measuring transepithelial electrical resistance (TEER) >150 o*cm2 с помощта на епителен волт омметър, EVOM2 (World Precision Instruments, Сарасота, Флорида). Правилното образуване на плътни връзки също беше потвърдено чрез измерване на пасивната пропускливост на луциферово жълто в базолатерална към апикална посока (B-към-A). Lucifer yellow (20 uM) се прилага към базолатералната камера за 1 час и средата се събира от апикалната камера. Жълтата флуоресценция на Луцифер се отчита при дължина на вълната на възбуждане от 430 nm и дължина на вълната на излъчване от 538 nm. Средните стойности на пасивната пропускливост (Papp) са 7 × 10-7 cm/s, което е в съответствие с литературните стойности [40].
След еднократно промиване на клетките с буфериран физиологичен разтвор на Ханк (HBSS) рН 7,4, бяха започнати изследвания на транспорта след аспириране на промивния буфер както от апикалната, така и от базалната камера. Клетките се инкубират с 5-HT3 антагонисти в апикалната камера в HBSS pH 6.0 и 5-HT3 антагонисти с ASP плюс (25 uM) в базолатералната камера в HBSS pH 7,4 и се инкубират при 37 oC за 120 минути. За измерване на зависим от времето трансцелуларен транспорт, аликвотна част от инкубационната среда (100 uL) от апикалната камера (приемащата камера) се събира на 40, 60, 90 и 120 минути и се заменя с равен обем пресен буфер, съдържащ {{ 19}}HT3 антагонист или положителен контролен химикал в първоначалната концентрация. След 120 минути средата за третиране се отстранява и Transwells се промиват три пъти с ледено студен HBSS. Клетките бяха лизирани с 1% Triton X-100. Флуоресценцията се открива с помощта на Spectramax Microplate Reader при следните дължини на вълната (възбуждане 485 nm/излъчване 495 nm). Вътреклетъчната флуоресценция се нормализира до обща протеинова концентрация на клетъчни лизати от всяка трансямка, като се използва BCA анализ. Експериментите бяха проведени в три отделни Transwell вложки.
4.5. Статистически анализ
GraphPad Prism v6 (GraphPad Software, La Jolla, Калифорния, САЩ) беше използван за статистически анализ. Km и Vmax бяха изчислени с помощта на нелинейна регресия (уравнение за кинетика на ензима на Майкълис-Ментен, (Y=Vmax × X/(Km плюс X), подходящо за най-малките квадрати). Данните с две променливи бяха анализирани с помощта на дву- начин ANOVA, последван от еднопосочен ANOVA и/или posthoc тест на Dunnett за множество сравнения. Стойностите на IC50 бяха изчислени чрез нелинейна регресия, за да се поберат на най-малките квадрати. Разликите се считат за статистически значими при p <>
Допълнителни материали:Следното е достъпно онлайн на https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms22126439/s1.
Авторски принос:Концептуализация, BG, MSJ, LMA; методология, BG, XW; формален анализ, BG, LMA; ресурси, LMA; писане—изготвяне на оригинална чернова, BG, LMA; писане— преглед и редакция, MSJ, LMA; администриране на проекти, LMA; придобиване на финансиране, MSJ, EAJ, LMA Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.
Финансиране:Това изследване е финансирано от Националния институт по общи медицински науки (грант GM123330) и Националния институт по здравни науки за околната среда (грантове ES005022, ES007148), Националния институт по рака (грантове CA072720, CA046934, CA008748) и Националния институт по диабет и Храносмилателни и бъбречни заболявания (Грант DK093903), компоненти на Националните здравни институти.
Изявление на институционалния съвет за преглед: Не е приложимо.
Декларация за информирано съгласие:Не е приложимо.
Декларация за наличност на данни:Не е приложимо.
Благодарности:Ние високо ценим щедрите HEK293 транспортни клетъчни линии от Kathy Giacomini и трансфектираните MDCK клетъчни линии от Joanne Wang.
Конфликти на интереси:Авторите декларират липса на конфликт на интереси.
Препратки
1. Акара, М.; Rennick, B. Двуфазният ефект на органичните катиони върху екскрецията на други органични катиони. J. Pharmacol. Exp. Там. 1976, 199, 32–40. [PubMed]
2. Holohan, PD; Ross, CR Механизми на транспортиране на органични катиони във везикули на бъбречната плазмена мембрана: 1. Проучвания за насрещния транспорт. J. Pharmacol. Exp. Там. 1980, 215, 191–197.
3. Кинсела, JL; Holohan, PD; Песа, NI; Ross, CR Транспорт на органични йони в бъбречни кортикални луминални и антилуминални мембранни везикули. J. Pharmacol. Exp. Там. 1979, 209, 443–450.
4. Уолд, JS; Miller, BL Инхибиране на ефлукса на органични йони от бъбречни кортикални срезове. Experientia 1978, 34, 630–631. [CrossRef] [PubMed]
5. Геснер, А.; König, J.; Fromm, MF Клинични аспекти на медиираните от транспортер взаимодействия лекарство-лекарство. Clin. Pharmacol. Там. 2019, 105, 1386–1394. [CrossRef]
6. Смит, HS; Кокс, LR; Smith, EJ 5-HT3 рецепторни антагонисти за лечение на гадене/повръщане. Ан. Палиат. Med. 2012, 1, 115–120. [CrossRef] [PubMed]
7. Костал, Б.; Gunning, SJ; Нейлър, RJ; Tyers, MB Ефектът на GR38032F, нов 5-HT3-рецепторен антагонист върху изпразването на стомаха при морско свинче. бр. J. Pharmacol. 1987, 91, 263–264. [CrossRef]
8. Крис, М.Г.; Грала, RJ; Clark, RA; Tyson, LB Оценка на дозата на серотониновия антагонист GR-C507/75 (GR38032F), когато се използва като антиеметик при пациенти, получаващи противоракова химиотерапия. J. Clin. Oncol. 1988, 6, 659–662. [CrossRef]
9. Трико, AC; Блондал, Е.; Вероника, АА; Soobiah, C.; Vafaei, A.; Айвъри, Дж.; Strifler, L.; Кардосо, Р.; Рейнен, Е.; Нинчич, В.; et al. Сравнителна безопасност и ефективност на антагонистите на серотониновите рецептори при пациенти, подложени на химиотерапия: систематичен преглед и мрежов мета-анализ. BMC Med. 2016, 14, 216. [CrossRef]
10. Boelig, RC; Бартън, SJ; Saccone, G.; Кели, AJ; Едуардс, SJ; Berghella, V. Интервенции за лечение на хиперемезис gravidarum: Систематичен преглед и мета-анализ на Cochrane. J. Matern. Fetal Neonatal Med. 2018, 31, 2492–2505. [CrossRef]
11. Хак, Н.; Naqvi, RM; Dasgupta, M. Ефикасност на ондансетрон при превенцията или лечението на следоперативен делириум - систематичен преглед. Мога. гериатр. J. 2019, 22, 1–6. [CrossRef] [PubMed]
12. Макпарлин, С.; О'Донъл, А.; Робсън, SC; Бейер, Ф.; Moloney, E.; Bryant, A.; Брадли, Дж.; Muirhead, CR; Nelson-Piercy, C.; Newbury-Birch, D.; et al. Лечения за Hyperemesis Gravidarum и гадене и повръщане по време на бременност: систематичен преглед. JAMA 2016, 316, 1392–1401. [CrossRef] [PubMed]
13. Wang, W.; Джоу, Л.; Sun, L. Ondansetron за невроаксиален морфин-индуциран сърбеж: Мета-анализ на рандомизирани контролирани проучвания. J. Clin. Pharm. Там. 2017, 42, 383–393. [CrossRef]
14. Йокой, А.; Михара, Т.; Ка, К.; Goto, T. Сравнителна ефикасност на рамосетрон и ондансетрон при предотвратяване на следоперативно гадене и повръщане: актуализиран систематичен преглед и мета-анализ с пробен последователен анализ. PLoS ONE 2017, 12, e0186006. [CrossRef]
15. Morse, BL; Колур, А.; Хъдсън, LR; Hogan, AT; Чен, LH; Brackman, RM; Савада, Джорджия; Fallon, JK; Smith, PC; Хилгрен, К. М. Фармакокинетика на субстрати на органичен катионен транспортер 1 (OCT1) при мишки с нокаут Oct1/2 и видова разлика в чернодробното OCT1-медиирано поемане. Лекарство Metab. Dispos. 2020 г., 48, 93–105. [CrossRef] [PubMed]
16. Цветков, М.В.; Саадатманд, Арканзас; Бокелман, К.; Майнеке, И.; Кайзер, Р.; Brockmoller, J. Ефекти на полиморфизмите на OCT1 върху клетъчното усвояване, плазмените концентрации и ефикасността на 5-HT(3) антагонистите трописетрон и ондансетрон. Фармакогеномика. J. 2012, 12, 22–29. [CrossRef] [PubMed]
17. Джу, П.; Йе, З.; Гуо, Д.; Xiong, Z.; Хуанг, С.; Guo, J.; Джан, В.; Поли, JE; Джоу, Х.; Li, Q.; et al. Иринотекан променя разпределението на морфина чрез инхибиране на органичен катионен транспортер 1 (OCT1) и 2 (OCT2). Pharm. Рез. 2018, 35, 243. [CrossRef]
18. Кидо, Й.; Matsson, P.; Giacomini, KM Профилиране на библиотека с лекарства с рецепта за потенциални бъбречни взаимодействия лекарство-лекарство, медиирани от транспортера на органични катиони 2. J. Med. Chem. 2011, 54, 4548–4558. [CrossRef] [PubMed]
19. Ли, К.; Гуо, Д.; Донг, З.; Джан, В.; Джан, Л.; Huang, SM; Поли, JE; Shu, Y. Ondansetron може да засили индуцираната от цисплатин нефротоксичност чрез инхибиране на множество токсини и екструзионни протеини (MATE). Токсикол. Приложение Pharmacol. 2013, 273, 100–109. [CrossRef]
20. Wittwer, MB; Зур, АА; Хури, Н.; Кидо, Й.; Косака, А.; Джан, X.; Morrissey, KM; Сали, А.; Huang, Y.; Джакомини, К. М. Откриване на мощни, селективни инхибитори на мултилекарства и екструзионен транспортер 1 на токсини (MATE1, SLC47A1) чрез профилиране на лекарства с рецепта и изчислително моделиране. J. Med. Chem. 2013, 56, 781–795. [CrossRef] [PubMed]