In vivo приложение на чревни бактериални консорциуми репликира уролитинови метаботипове A и B в модел на плъх, който не произвежда уролитинⅠ
Dec 25, 2023
В продължение на десетилетия консумацията на елагитанини (ЕТ) и елагова киселина (ЕА) се свързва с множество биологични ефекти, включително антиоксидантни, противоракови, противовъзпалителни, антибактериални и анти-ХИВ репликационни дейности.1 Въпреки това, абсорбцията и бионаличността на ЕТ и ЕА са много лоши. Предишни проучвания при хора установиха, че екскрецията с урината на EA и EA-O-глюкуронид е по-малко от 1% от приема. 2,3 Въпреки това, докато абсорбцията на ET и EA е ниска, те допълнително се метаболизират от микробиотата на дебелото черво до уролитини (Uros), които са отговорни, поне частично, за благоприятните ефекти на храни, богати на ET и (или) EA.1,4
Първо, ЕА се освобождава чрез хидролизата на естерните връзки на ЕТ от ензима, известен като елагитаназа.5 ЕА претърпява допълнително разграждане, произвеждайки производни на 6H-дибензо[b,d]пиран-6-он, наречени Uros. Тази каскада от реакции започва с разцепване на лактонен пръстен от ензим лактоназа, което води до лутеинова киселина, която след това се декарбоксилира до пентахидрокси-Uro (Uro-M5). Последователното дехидроксилиране я превръща в тетрахидрокси-Uros (Uro-D, Uro-E и Uro-M6) и трихидрокси-Uros (Uro-C, UroM7 и Uro-G), за да се получи накрая дихидрокси-Uros (Uro-A и изоUro-A) и монохидрокси-Uro (Uro-B), като последният обикновено се открива когато се произвежда и изоУро-А.1
Голямото разнообразие на Uro метаболитни профили, открити при хора след консумация на храни, богати на ET, показва междуиндивидуални различия в микробиотата на дебелото черво, отговорна за разграждането на ET.6-8 Многобройните възможни взаимодействия между бактериите на дебелото черво и приемащия организъм биха могли да обяснят различните метаболитни съдби на хранителните (поли) )феноли.6,9 Това двупосочно взаимодействие между чревната микробиота и (поли)фенолите подтикна научната общност да групира популацията въз основа на технитеметаболитен фенотип (метален тип), за да се обяснят разликите в ефектите на полифенолите. 10, 11 По-конкретно, според метаболизма на ET и EA, индивидите могат да бъдат стратифицирани в урометаботипове (UM), свързани със състава и функционалността на чревния микробиом. 7, 8, 12
Три човешки UM (UM-A, UM-B и UM-0), свързани с три различни профила на производство на Uro, са описани в западните и източните популации.13–15 В това отношение, метаботип A (UM-A) индивиди произвеждат няколко междинни Uro, но само уролитин A (Uro-A), основният абсорбиран Uro в този UM, в края на микробния катаболитен път. Индивидите с метаботип B (UM-B) произвеждат някои междинни Uros и три крайни Uros, т.е. уролитин B (Uro-B), уролитин A (IsoUro-A) и Uro-A, които са основните абсорбирани Uros в UM-B. Следователно, междинният Uros може да действа основно в червата, докато крайните могат да имат локални и системни ефекти.6 Обратно, индивиди с метален тип 0 (UM-0) не могат да произведат тези крайни Uros (само досега е открит прекурсор Urolithin-M5, който не се абсорбира в червата).
Наблюдавани са разлики в уропрофилите между UM и по дължината на дебелото черво, показващи преобладаващо производство на Uro в областта на дисталното черво.16–19 Забележително е, че процентът на UM-0 при здрави доброволци от Испания и Китай е приблизително 10% и може да бъде дори по-висок при населението на САЩ.13–15. Бактериалните родове Gordonibacter и Ellagibacter са идентифицирани като способни да метаболизират ЕА в някои Uros.20–23 Въпреки това беше установено, че някои междинни продукти (например Uro-D, Uro-E, Uro- M7 и Uro-G) и крайните Uros (Uro-A и Uro-B) не се произвеждат в чисти култури от тези бактерии, което предполага необходимостта други бактерии да завършат набора от Uros, който конфигурира както UM-A, така и UM-B . Наскоро бяха идентифицирани in vitro консорциуми от чревни бактерии, участващи в метаболизма на ЕА, за да се получат уропродуциращи метаботипове (UM-A и UM-B).
Бактериални консорциуми, съдържащи родовете Gordonibacter plusEnterocloster и Ellagibacter плюс Enterocloster, произвеждат in vitro уролитините, свързани съответно с UM-A и UM-B.25 Въпреки това, способността на тези бактериални консорциуми да репликират човешки Uro профили, свързани с UM-A и UM-B in vivo все още е неизвестен. Освен това, безопасността на консумацията на тези произвеждащи уро-бактерии като нови пробиотици все още не е сигурна, тъй като не е била тествана преди това върху животни или хора. В настоящото проучване горните бактериални консорциуми бяха оценени за способността им да колонизират червата на уро-непродуциращи (UM-0-подобни) плъхове и да ги превърнат в уропродуценти, имитиращи съответно UM-A и UM-B. Безопасността на тези бактериални консорциуми също беше оценена. Освен това бяха разработени две нови базирани на количествена PCR (qPCR) процедури в реално време за откриване и количествено определяне на Ellagibacter и Enterocloster във фекални проби.
Материали и методи
Химикали и реактиви
Uros са химически синтезирани и пречистени от VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Мурсия, Испания). EA е закупен от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS) беше получен от FisherScientific (САЩ), докато метанолът, етанолът и мравчената киселина бяха от Panreac Química (Барселона, Испания). Разтворителите с клас течна хроматография-масспектрометрия (LC-MS) бяха закупени от JT Baker (Девентер, Холандия). Ultrapure Millipore вода (Bedford, MA, USA) е използвана по време на цялото изследване. Всички химикали и реактиви са с аналитичен клас.
Подготовка на бактериални консорциуми
Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T и Enterocloster bolted CEBASS4A9, всички те изолирани и идентифицирани в нашата лаборатория (CEBAS-CSIC, Испания), бяха анаеробно култивирани в 5 mL Wilkins - Епруветки с анаеробна среда на Chalgren (WAM, Oxoid) при 37 градуса за 48 часа в анаеробна камера Concept 400 (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, Южен Уелс, Обединеното кралство) и ресуспендирани в PBS, допълнен с 10% глицерол и 0,05% L-цистеин хидрохлорид (PanReac Química, Барселона, Испания). След анаеробна инкубация бяха приготвени консорциуми.24,25 Накратко, "бактериален консорциум А" съдържаше G. urolithinfaciens и Е. bolteae щамове; "бактериален консорциумB" съдържа култури от E. isourolithinifaciens и E. bolteae; и "контролен коктейл" съдържаше стерилен PBS с 10% глицерол и 0.05% L-цистеин хидрохлорид. Преди администриране, всички коктейли се разпределят в аликвотни части от 3,5 ml и се държат при -80 градуса.
Животни, диети и експериментален дизайн
Експерименталният протокол (референтен номер 624/2020) беше одобрен от местното правителство, Комитета по биоетика на Испанския национален изследователски съвет (Мадрид, Испания) и Комитета по етика на експериментите с животни от Университета на Мурсия (Испания). Експериментите следваха препоръките на Европейския съюз относно опитите с животни (Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и Съвета относно защитата на животните, използвани за научни цели). Плъхове Wistar (n=18; 9 женски и 9 мъжки) с тегло 240 ± 31 g бяха получени от Envigo (Барселона, Испания). Този модел на плъхове беше избран въз основа на неговата неспособност да произвежда Uros, наблюдавана в нашите предварителни проучвания, в които бяха тествани фекални проби от различни модели на плъхове. Три групи (A, B и C) бяха формирани чрез произволно разпределяне на 6 животни всяка (3 женски и 3 мъжки плъха ) на група (фиг. 1).
Всяка група плъхове беше настанена в две различни клетки, разделени по пол, в стая с контролирана температура (22 ± 2 градуса) с 55 ± 10% относителна влажност и контролиран цикъл светлина-тъмнина (12 часа). Плъховете са получили стандартна диета за хранене (Teklad, Барселона, Испания), съдържаща (%/100 g прясно тегло) 14,3% протеини (шрот от царевичен глутен), 48% въглехидрати (пшенични междинни зърна, смляна пшеница, смляна царевица) и 4% мазнини (соево масло ), 2,9 kcal g−1 енергийна плътност и 4,1% сурови влакна, допълнени с EA на прах По-голяма или равна на 95% чистота (3,6 mg на 100 g храна). ЕА се смесва хомогенно със смлян стандартен фураж, повторно се пелетизира и лиофилизира. Диетата, обогатена с EA, се съхранява далеч от влага и светлина. Дозата EA, дадена наплъхове в диетата беше приблизително 0.72 mg на плъх на ден (EA1× диета), човешка еквивалентна доза от 41 mg ден-1.26 Всички групи бяха хранени с EA 1× диета и чешмяна вода ad libitum през целия експеримент ( 5 седмици). Тъй като EA, открит във фекални проби, беше нисък през първата седмица, през следващите дни бяха добавени допълнителни EA. На седмица 3 допълнителна доза от 1,5 mgEA на плъх на ден, разтворена във вода, се прилага перорално чрез сонда на животните (обща=EA 3 × диета), която се дава само за 1 седмица. Накрая, на седмица 4, ≈5 g орехи на плъх на ден (друг източник на EA) бяха добавени към диетата EA 1× и бяха поддържани до края на изследването, за да се оцени въздействието на EA, съдържаща хранителна матрица, върху способността на бактериите за производство на Урос. Теглото, приемът на храна и вода се измерват всеки ден. Чревните бактериални консорциуми се приемат перорално чрез сонда. Група A получи 500 µL бактериален коктейл A, Група B получи 500 µL бактериален коктейл B, а Група C (контрола) получи 500 µL PBS. Пероралната сонда се извършва на всеки 2 дни през първите две седмици и всеки ден през следващите 2 седмици. През последната седмица (дни 28 до 32), животните продължиха със същата диета, допълнена с ЕА и орехи, но без перорално приложение на бактерии. В края на изследването животните бяха умъртвени с помощта на CO2 камера.
Процедури за вземане на проби
Фекални проби бяха събрани по време на изследването за Uro анализ чрез UPLC-ESI-QTOF-MS/MS и чревна микробиота чрез секвениране на 16S rRNA ген и qPCR. Кръвта се екстрахира в различни времеви точки (базова линия, ден 28 и край на изследването) за хематологични и серумни биохимични анализи. Бяха взети кръвни проби от вената на опашката (≈500 µL) и събрани в епруветки, съдържащи хепарин, на изходното ниво и на дни 28 и 32 (фиг. 1). Отделянето на плазмата беше извършено незабавно чрез центрофугиране при 3000 g за 10 минути при 4 градуса и замразено при - 80 градуса до по-нататъшно определяне на серобиохимичните променливи. Черният дроб, бъбреците и далака бяха събрани, претеглени и изследвани, за да се открият всякакви морфологични разлики при умъртвяването.
Проектиране и оптимизиране на праймерите и сондата за количествено определяне на Ellagibacter и Enterocloster чрез qPCR
Последователностите на 16S rRNA гените на Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T и E. bolted CEBAS S4A9 бяха получени от базата данни GenBank (EMBL база данни). Последователностите бяха приведени в съответствие с филогенетично близките бактериални поколения, използвайки софтуера за анализ на молекулярната еволюционна генетика (MEGA 11) и инспектирани за региони на запазени и променливи последователности, за да се проектират праймерите и сондата за откриване и количествено определяне на Ellagibacter и Enterocloster (Таблица 1). Праймерът и сондата са проектирани и валидирани съответно с инструментите Primer Questand Oligo Analyzer (Integrated DNATechnologies, Inc., Белгия). Сондата TaqMan е белязана в 5' и 3' краищата с 6-карбокси-флуоресцеинова група (6FAM) и гасител за къпини (BBQ), съответно. qPCR се извършва с помощта на система за откриване на последователност ABI 7500. Крайните концентрации на всеки праймер и проба бяха 300 и 375 nM за Ellagibacter и 200 и 500 nM за Enterocloster. Беше проведен конвенционален qPCR протокол за ДНК амплификация на Ellagibacter иEnterocloster, респ. Профилът на нарастване за амплификация на Ellagibactera е 1 цикъл при 95 градуса за 5 минути, последван от 45 цикъла от 95 градуса за 15 секунди, 50 градуса за 40 секунди и 72 градуса за 31 секунди. Накрая беше добавен 1 цикъл при 72 градуса за 5 минути . Профилът на нарастване за Enterocloster амплификация е 1 цикъл при 95 градуса за 5 минути, последван от 40 цикъла от 95 градуса за 15 s, 65 градуса за 40 s и 72 градуса за 31 s. Накрая беше добавен 1 цикъл при 72 градуса за 5 минути.
Екстракция на фекална ДНК и анализи на чревни микроби
Извличането на ДНК от фекални проби беше извършено с комплекта за пречистване на тъканна ДНК NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Германия), съгласно инструкциите на производителя с някои модификации. ДНК се определя количествено чрез флуориметрия (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, UK) и чистотата се измерва от съотношението на абсорбция при дължина на вълната 260/280 nm (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, UK) ). Съставът на чревната микробиота се определя чрез секвениране на V3 и V4 променливите области на 16S rRNA гена, следвайки протоколите на Illumina (Illumina Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ) с дължина на четене от 2 × 300 bp сдвоен край (MiSeqReagent Kit v3 , Illumina Inc.). Метагеномното секвениране беше извършено на платформа MiSeq-Illumina (FISABIO sequencingservice, Испания). Обработка на данни, отстраняване на химерна последователност, подравняване на последователност и групиране на 16S rRNA генна последователност бяха извършени, както е описано на друго място, за да се получи таксономичната класификация.8,27 Gordonibacter ДНК амплификация беше постигната в ABI 7500 qPCR система, както е описано по-горе.19,28 Enterocloster и Ellagibacter- специфични праймери и сонди, проектирани в настоящото изследване, бяха използвани, следвайки qPCR протокола, описан по-горе. За количествено определяне бяха използвани стандартни криви на геномна ДНК на Gordonibacter, Enterocloster и Ellagibacter. Всички фекални проби бяха анализирани трикратно.
Екстракция, откриване и количествено определяне на уролитини във фекални проби
Фекални проби ({{0}}.2–0.5 g) се екстрахират в съотношение 1: 10 с разтвор на MeOH/H2O (8{{ 20}}/20), подкиселен с 0.1% HCl и хомогенизиран чрез завихряне в продължение на 2 минути и разклащане при 1500 rpm при стайна температура в продължение на 10 минути в блоков нагревател. Суспензията се центрофугира при 14 000g при 4 градуса за 10 минути и супернатантата се филтрува през 0,22 µm PVDF мембранен филтър (Millipore Corp., Bedford, MA) и се разрежда 3 пъти с МеОН (0,1% мравчена киселина ) преди инжектиране в UPLC-ESI-QTOF-MS система. UPLC система (Agilent 1290Infinity), свързана с квадруполна система за време на полет (QTOF) LC/MS (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Waldbronn, Германия) беше използвана за анализ на фекалните метаболити, като се използва метод на градиентно елуиране, както е описано по-горе .29,30 Накратко, разделянето се извършва в колона с обратна фаза Poroshell 120 EC-C18, като се използват вода и ацетонитрил, и двата подкиселени с 0,1% мравчена киселина, като подвижни фази. Скоростта на потока беше 0.4 mL min-1, а инжекционният обем беше 5 µL. За обработка на данни беше използван софтуерът MassHunter Qualitative Analysis (версия B.10, Agilent Technologies, Waldbronn, Германия). Всички метаболити бяха идентифицирани чрез директно сравнение със стандартите и потвърдени от тяхната молекулна маса. Бяха получени калибрационни криви за EA и различните Uros с добра линейност (R2 > 0,99).
Хематология и клинична химия
Хематологичните променливи бяха определени в хепаринизирана кръв с помощта на автоматизиран хематологичен анализатор със специфичен софтуер за кръвни проби от плъхове (AVDIA 120, Siemens, Мюнхен, Германия). Анализираните променливи бяха среден корпускуларен обем (MCV), среден корпускуларен хемоглобин (MCH), средна корпускуларна концентрация на хемоглобин (MCHC), разпределение на еритроцитите (RDW), среден обем на тромбоцитите (MPV), тромбоцитен крит (PCT), ширина на разпределение на тромбоцитите (PDW) , среден тромбоцитен компонент (MPC), средна тромбоцитна маса (MPM), тромбоцитен брой (PLT), съдържание на ретикулоцитен хемоглобин (CHr) и среден ретикулоцитен корпускуларен обем (MCVr). Биохимичните променливи на плазмата, калций (Ca) и фосфор (P) бяха анализирани с помощта на химичен и токсикологичен анализатор Olympus AU400 (Beckman Coulter, Калифорния, САЩ). Биохимичните променливи бяха общи протеини (PROT), албумин (ALBU), глобулин (GLOB), креатинин (CREA), глюкоза (GLUC), холестерол (CHOL), триглицериди (TRIGL), алкална фосфатаза (ALP), гама-глутамил транспептидаза ( GGT), аспартат аминотрансфераза (AST) и аланин аминотрансфераза (ALT). Накрая, нивата на тироксин (Т4) бяха анализирани с помощта на система за имуноанализ IMMULITE® 1000 (Siemens).
Статистически анализ
Данните са изразени като средно ± стандартно отклонение (SD). Статистическият анализ е извършен със софтуера SPSS версия 27.0 (SPSS Inc., Чикаго, Илинойс, САЩ) и разликите с p < 0.05 се считат за статистически значими. Нормалността на данните беше оценена с теста на Shapiro-Wilk. Сравненията между различни третирани групи бяха извършени с помощта на многократно измерен дисперсионен анализ (RM ANOVA) с пост-хок теста на Тюки или Дънет, в зависимост от това дали данните следват съответно нормално или ненормално разпределение. Разликите между мъже и жени бяха изследвани с помощта на сдвоения t-тест на Student или теста на Wilcoxon signedrank, когато данните бяха съответно нормално или ненормално разпределени. Хи-квадрат линеен дискриминантен анализ размер на ефекта (LEfSe) беше използван за откриване на различни бактериални характеристики между групите. Корелацията на Pearson беше използвана за анализиране на възможни асоциации между променливи в нормално разпределени данни, докато корелацията на Spearman беше приложена в ненормално разпределени данни. Графиките на данни бяха извършени с помощта на Sigma Plot 14.5 (Systat Software, Сан Хосе, Калифорния, САЩ).
Естествено билково лекарство за облекчаване на запек - Cistanche
Cistanche е род паразитни растения, който принадлежи към семейство Orobanchaceae. Тези растения са известни със своите лечебни свойства и се използват в традиционната китайска медицина (ТКМ) от векове. Видовете Cistanche се срещат предимно в сухи и пустинни райони на Китай, Монголия и други части на Централна Азия. Растенията Cistanche се характеризират със своите месести, жълтеникави стъбла и са високо ценени заради потенциалните си ползи за здравето. В TCM се смята, че Cistanche има тонизиращи свойства и обикновено се използва за подхранване на бъбреците, повишаване на жизнеността и поддържане на сексуалната функция. Използва се и за справяне с проблемите на стареенето, умората и общото благосъстояние. Въпреки че Cistanche има дълга история на употреба в традиционната медицина, научните изследвания за неговата ефикасност и безопасност продължават и са ограничени. Въпреки това, той съдържа различни биоактивни съединения като фенилетаноидни гликозиди, иридоиди, лигнани и полизахариди, които могат да допринесат за неговите лечебни ефекти.
на Wecistanche'sцистанче на прах, цистанче таблетки, цистанче капсули,и други продукти са разработени с помощта напустиненцистанчекато суровини, всички те имат добър ефект за облекчаване на запек. Специфичният механизъм е следният: Смята се, че Cistanche има потенциални ползи за облекчаване на запек въз основа на традиционната му употреба и някои съединения, които съдържа. Докато научните изследвания конкретно върху ефекта на Cistanche върху запека са ограничени, се смята, че има множество механизми, които могат да допринесат за потенциала му за облекчаване на запек. Слабителен ефект:Цистанчеотдавна се използва в традиционната китайска медицина като средство за лечение на запек. Смята се, че има лек слабителен ефект, който може да помогне за насърчаване на движенията на червата и да предизвика запек. Този ефект може да се дължи на различни съединения, открити в Cistanche, като фенилетаноидни гликозиди и полизахариди. Овлажняване на червата: Въз основа на традиционната употреба се счита, че Cistanche има овлажняващи свойства, специално насочени към червата. Насърчаването на хидратацията и смазването на червата може да помогне за омекотяване на инструментите и да улесни по-лесното преминаване, като по този начин облекчава запека. Противовъзпалителен ефект: Запекът понякога може да бъде свързан с възпаление в храносмилателния тракт. Cistanche съдържа определени съединения, включително фенилетаноидни гликозиди и лигнани, за които се смята, че имат противовъзпалителни свойства. Чрез намаляване на възпалението в червата може да помогне за подобряване на редовността на движението на червата и облекчаване на запека.
