Вроден имунен отговор на гладуване и повторно хранене в бъбрека на рибката зебра

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zongzhen Liao, Dihang Lin, Jirong Jia, Ran Cai, Yang Yu и Wensheng Li *

Държавна ключова лаборатория за биоконтрол, Ключова лаборатория на провинция Гуангдонг за водни стопански животни, Изследователски център за инженерни технологии на провинция Гуангдонг за здравословно отглеждане на важни стопански риби, Училище по науки за живота, Университет Сун Ят-Сен, Гуанджоу 510275, Китай;

liaozzh@mail2.sysu.edu.cn (ZL); lindihang2018@sibcb.ac.cn (DL); jiajr3@mail.sysu.edu.cn (JJ); Alan6382@163.com (RC); yuyang65@mail2.sysu.edu.cn (ГГ)

* Кореспонденция: lsslws@mail.sysu.edu.cn

Цистанче е много полезно за бъбречната функция

Резюме: Животните придобиват хранителни вещества и енергия чрез хранене, за да постигнат баланс между растежа и здравето на организма. Когато има промяна в усвояването на хранителни вещества, състоянието на растеж се променя и може също да причини промени във вътрешната имунна система. Компенсаторният растеж (CG), специфичен феномен на растежа, включва въпроса дали промените в растежа могат да бъдат придружени от промени във вродения имунитет. Рибката зебра (Danio rerio), добре познат моделен организъм на риба, може да служи като подходящ модел. В това проучване рибката зебра е била подложена на 3 седмици гладуване и повторно хранене за периоди от 3 до 7 дни. Установено е, че CG може да се постигне при рибки зебра. Чувствителността на зебрата към Streptococcus agalactiae се увеличава след гладуване. В допълнение, броят на центровете на меланомакрофагите се увеличава след гладуване и делът на увредените тубули се увеличава след повторно хранене съответно за 3 и 5 дни. Освен това,бъбрециот рибките зебра, страдащи от глад, са били подложени на оксидативен стрес и активността на няколко антиоксидантни ензима се повишава след гладуване, включително каталаза, глутатион пероксидаза и супероксид дисмутаза. Вродените имунни параметри са били повлияни от гладуването. Освен това активността на алкалната фосфатаза и лизозима се повишава след гладуване. Експресията на иРНК на свързани с имунитета гени като il-1 беше повишена в различна степен след гладуване със или без липополизахариди (LPS) предизвикателство. Това проучване показа, че функцията на вродената имунна система при рибките зебра може да бъде повлияна от хранителния статус.

Ключови думи: вродена имунна система; бъбрек; оксидативен стрес; компенсаторен растеж; рибка зебра

1. Въведение

Основните жизнени дейности зависят от енергийното осигуряване на организма. Хранителното състояние на животинското тяло може да повлияе на функционирането на имунната система [1,2]. Компенсаторният растеж (CG) е период на бърз растеж след фаза на потискане на растежа, което може да бъде причинено от недостиг на храна и други фактори на околната среда [3,4]. Това явление е регистрирано за първи път при бозайници и в крайна сметка е открито при птици [3] и коси кости [5]. CG е разделен на две фази: катаболна фаза и хиперанаболна фаза [6]. Един от основните модели на CG е гладуването и повторното хранене. След повторно хранене рибите могат да получат частична, пълна, свръхкомпенсация или никаква компенсация [4]. Специалният режим на хранене на CG се разглежда като потенциален начин за подобряване на производствената ефективност при отглежданите видове [7].

Вроденият имунен отговор е първата граница на защитата на гостоприемника, защитавайки организмите от патогени. При рибите органите на имунната система включват тимуса,главабъбрек, опашен бъбрек, хриле, черен дроб,и червата [8,9]. Широка гама от типове клетки участват в неспецифичните клетъчни защитни реакции при рибите, включително моноцити/макрофаги, неспецифични цитотоксични клетки и гранулоцити (неутрофили). Имунометаболизмът е взаимодействието между имунологични и метаболитни процеси [10]. Метаболитният статус на рибите може да повлияе на имунната им функция. При хората състоянието на хранене влияе върху броя на имунните клетки и тяхната активност [11]. Установено е, че функцията на имунната система при мишки може да бъде повлияна от тяхното метаболитно състояние [12–14]. Периодичното гладуване при каракуда (Carassius auratus) променя общностите на чревните бактерии и повишава активността на супероксиддисмутазата (SOD) и лизозима [15]. Гладуването също променя генната експресия на вродените имунни отговори в черния дроб на сьомга [16]. В допълнение, изследвания върху ефектите на метаболитното състояние върху имунната система могат да бъдат намерени при други телеости [17–19]. Въпреки това, влиянието на метаболитното състояние върху имунната система при телеостите все още е слабо разбрано. Оксидативният стрес може да ограничи функционалността на вродената имунна система и да индуцира компоненти като подобни на такса рецептори [20,21]. Междувременно гладуването може да увеличи производството на ROS и да причини автофагия [22,23]. Струва си да се проучи дали оксидативният стрес медиира връзката между гладуване и имунитет.

Районът на рибката зебра (Danio rerio) е широко прилаган модел в изследването на имунитета и болестите. Вродената имунна система на рибката зебра започва да се развива на първия ден от ембриогенезата, а адаптивната имунна система отсъства до 4-6 седмици след оплождането. Това прави рибката зебра чудесен модел за изследване на вродената имунна система [9]. Бъбрекът е основният лимфоиден орган при рибката зебра [24]. Генът havcr1 кодира трансмембранен тубуларен протеин, нареченбъбречно увреждане молекула-1 (KIM-1) [25]. KIM-1 е индикаторът за тъканно увреждане в бъбреците и свръхекспресията на KIM-1 причинява увреждане на бъбреците при рибките зебра [26]. Установено е, че гладуването може да промени метаболитното състояние при рибките зебра [27]. Гладуването доведе до намалена консумация на кислород и съдържанието на чернодробни липиди и гликоген. Той също така повишава активността на 8-окислението и глюконеогенезата в черния дроб. Междувременно, реактивни кислородни видове (ROS) взеха участие в CG при рибки зебра [28]. ROS, произведени в черния дроб, са необходими за CG в рибките зебра, тъй като те индуцират AMPK пътя. В настоящото изследване ние приехме стратегия за гладуване и повторно хранене, за да изследваме модела на CG при рибките зебра. Streptococcus agalactiae причинява тежък сепсис и менингит при рибките зебра и може да зарази повече от 30 вида риби [29]. Избрахме Streptococcus agalactiae и липополизахариди (LPS) за инжектиране, за да изследваме влиянието на CG върху вродената имунна система, съчетано с промени в свързаните с имунитета параметри и генната експресия.

2. Материали и методи

2.1. Рибка зебра, режими на хранене и телесно тегло

Възрастните рибки зебра, използвани в експеримента, са закупени от Yuehe Fish-Bird-Flower market (Гуанджоу, Китай) и са аклиматизирани в продължение на две седмици. Цялото отглеждане на риба беше извършено в експерименталната станция за отглеждане на риби в университета Сун Ятсен, провинция Гуангдонг, Китай. Всички експерименти с животни са извършени в съответствие с насоките и одобрението на Комитета за грижа и използване на животните към Университета Сун Ятсен. По време на експерименталния период pH варира от 7,8 до 7,9, разтвореният кислород варира от 6,95 до 7,23 mg/L, а температурата на водата варира от 26,5 до 28 oC. Концентрациите на амонячен N и нитратен азот се поддържат по-ниски от 0.2 и 0.{{20}}05 mg/L, съответно. Солеността на водата е 0,2 ppt. Рибката зебра беше поддържана в 12:12-h цикъл светло-тъмно. За да се изследват промените в телесното тегло по време на гладуване и повторно хранене, телесното тегло се записва веднъж седмично. Първоначалното телесно тегло на рибките зебра в експеримента беше 0,35 ± 0,06 g и те бяха на възраст около 3 месеца. Рибките зебра бяха разделени произволно в 24 L резервоари и всеки резервоар съдържаше 30 риби. Предложена им е търговска диета два пъти дневно с насищащо хранене. Режимите на хранене за всеки експеримент са показани в таблица 1. След третиране рибките зебра бяха анестезирани чрез свръхдоза MS-222 (Sigma, Burlington, MA, USA) и умъртвени. След това бъбрекът се отстранява в епруветката Eppendorf и незабавно се поставя в течен азот. Пробата се прехвърля от течен азот и се съхранява при -80 oC.

2.2. Streptococcus agalactiae Challenge

Рибките зебра, подложени на гладуване и повторно хранене, бяха заразени със Streptococcus agalactiae. Щамът Streptococcus agalactiae беше любезно предоставен от професор Anxing Li, Училище по науки за живота, Университет Сун Ятсен [30]. Рибките зебра във всяка група бяха допълнително разделени на четири малки групи, с 15 риби във всяка малка група. Рибките зебра в три от тези групи бяха анестезирани с 80 mg/L MS-222 и интраперитонеално инжектирани с 5 uL, съдържащи 5 × 106 образуващи колонии единици от Streptococcus agalactiae. Останалите рибки зебра се инжектират с 5 uL PBS. Всички рибки зебра бяха наблюдавани в продължение на 4 дни без хранене. Записана е смъртността.

2.3. LPS инжекция

Рибките зебра, подложени на гладуване и повторно хранене (F24, S24 и F21R3), бяха заразени с LPS (Sigma, Burlington, MA, USA). LPS прах се разтваря в стерилна вода до крайна концентрация от 1 mg/mL. Преди употреба, 1 mg/mL LPS се разрежда с PBS и крайната концентрация е 20 ug/mL. Рибките зебра във всяка група бяха разделени на две малки групи и във всяка малка група имаше 12 риби. Рибите в двете групи бяха инжектирани с LPS и PBS. Рибките зебра бяха анестезирани с MS-222 и интраперитонеално инжектирани с 5 uL от 20 ug/mL LPS или PBS. След 3 часа рибките зебра бяха анестезирани и умъртвени. След това бъбрекът се отстранява и се съхранява при -80 oC.

2.4. Хистопатология

Рибките зебра бяха държани с повторно хранене в продължение на 14 дни след гладуване в продължение на 21 дни. Пробите са взети на дни 21, 24, 28 и 35. След умъртвяването, бъбреците на рибките зебра се отстраняват и се потапят в 4 процента формалдехид. След това бъбреците бяха подложени на парафинови секции. Срезовете се оцветяват с хематоксилин-еозин (HE) (Beyotime, Шанхай, Китай) и се наблюдават със светлинен микроскоп (Olympus, Токио, Япония). За да се определи количествено промяната на увредените тубули и мелано-макрофагалните центрове (MMCs), от всеки слайд бяха заснети 5 снимки без припокриване. Площите на увредените тубули и цялата проба бяха измерени с помощта на софтуера Cellsens (Olympus, Токио, Япония). От всяка снимка делът на увредените тубули се изчислява чрез разделяне на площта на увредените тубули на площта на цялата проба. Количеството MMCs се преброява във всяка снимка, след което се разделя на площта на цялата проба. След това промените на сгъването на MMCs бяха изчислени с група F21 като стандарт.

2.5. Анализ на свързани биохимични параметри

Съдържанието на малондиалдехид (MDA) и азотен оксид (NO) и ензимните активности на SOD, алкална фосфатаза (ALP), каталаза (CAT), глутатион пероксидази (GSH-Px) и лизозим в бъбреците бяха измерени със съответните търговски комплекти в съответствие с протоколите на производителя. Накратко,бъбрециотстранени от рибките зебра се поставят в течен азот и се съхраняват при -80 oC. Преди тестването, всеки бъбрек беше изваден и направен в хомогенат в предварително охладен PBS с тъканен разрушител.Бъбречен хомогенатсе центрофугира при 4 oC и 12,000× g за 10 минути и супернатантата се приема катобъбрекекстракт за откриване. Съдържанието на MDA беше открито с комплект за анализ на липидна пероксидация MDA (Beyotime, Шанхай, Китай) и откриването се основаваше на цветната реакция между MDA и тиобарбитуровата киселина. Използваната дължина на вълната е 535 nm. Съдържанието на NO се измерва чрез реактивна система Griess (Promega, Madison, WI, USA). Системата с реагенти на Griess се основава на реакцията на нитрит със сулфаниламид и N-1-нафтил етилендиамин дихидрохлорид при киселинни условия. Съдържанието на NO се изчислява чрез стандарт на натриев нитрит и се нормализира до съдържание на протеин. Абсорбцията се измерва с филтър при 490 nm. Активността на лизозима се открива с комплект за анализ на лизозим (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), следвайки протокола на производителя. Бъбречен екстракт се инкубира с флуоресцеин-конюгирана клетъчна стена на Micrococcus lysodeikticus. Флуоресценцията се измерва след 45 минути инкубиране при 37 oC, при дължини на вълната на възбуждане и излъчване от 485 и 535 nm. Стойността на лизозима се изчислява чрез стандартна крива и се нормализира спрямо съдържанието на протеин. Ензимните активности на SOD, ALP, CAT и GSH-Px се откриват поотделно с комплекти за анализ тип SOD, комплекти за анализ на алкална фосфатаза, комплекти за анализ на каталаза и комплекти за анализ на глутатион пероксидаза (Nanjing Jiancheng, Nanjing, Китай). Единица активност на SOD се дефинира като количеството SOD, съответстващо на 50 процента инхибиране на скоростта на редукция на нитросиния тетразолий на mg протеин в 1 ml система. Използваната дължина на вълната е 570 nm. Единица активност на ALP се дефинира като обем на ензим, който реагира със субстрата, за да произведе 1 mg фенол за 30 минути при 37 oC и нормализиран до съдържание на протеин. Използваната дължина на вълната е 490 nm. Активността на CAT се основава на консумацията на водороден пероксид. Използваната дължина на вълната е 405 nm. Активността на GSH-Px се измерва чрез скоростта на катализираща реакция между водороден пероксид и GSH. Като се извади неензимната реакция, единица активност на GSH-Px се дефинира като намаляване на концентрацията на GSH с 1 mol/L във всяка система. Използваната дължина на вълната е 405 nm. Концентрацията на протеин се измерва с BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanghai, China). Използваната дължина на вълната е 570 nm.

2.6. ROS производство

Съдържанието на ROS вбъбрексе определя с флуоресцентна сонда 2/,7/- дихлорофлуоресцеин диацетат (DCF-DA) (Sigma, Burlington, MA, USA), както е описано по-горе [28]. Накратко, бъбрекът, отстранен от рибка зебра, се поставя в предварително охладен 100 uL PBS и се превръща в хомогенат с тъканен разрушител. След центрофугиране в продължение на 10 минути с 10,000 × g при 4 oC, 20 uL отбъбрекекстрактсе добавя към 96-черни микроплаки с ямки и към всяка ямка се добавят 25 uM DCF-DA. Микроплаката се инкубира при 37 oC в продължение на 30 минути. Флуоресценцията беше измерена в четец на плаки с много етикети (PerkinElmer Victor X5, Waltham, MA, USA) с филтри за възбуждане и излъчване, настроени на 485 и 535 nm. Съдържанието на протеин в бъбречния екстракт се измерва с BCA Protein Assay Kit. Съдържанието на ROS за всяка проба се изчислява чрез нормализиране на стойността на флуоресценция към съдържанието на протеин. Концентрацията на протеин се измерва с BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanghai, China). Използваната дължина на вълната е 570 nm.

2.7. Тест за респираторен взрив

Рибки зебра, подложени на гладуване и повторно хранене (F24, S24 и F21R3), бяха използвани за измерване на активността на дихателния взрив. Протоколът за анализ на респираторен взрив беше извършен съгласно публикуван по-рано метод [31,32]. Накратко,бъбрецисе отделят от анестезираните рибки зебра и се поставят в {{0}}ямкови микроплаки със 100 uL модифицирана среда на Dulbecco на Eagle (DMEM)/F-12. След инкубиране на плаката в продължение на 30 минути при 28 oC, 100 uL DMEM/F-12, съдържащ DCF-DA, диметилсулфоксид (DMSO) и форбол миристат ацетат (PMA) (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) се добавят добавени към всяка открита ямка. Междувременно, 100 uL DMEM/F-12, съдържащ DMSO, се добавят към всяка контролна ямка. Крайните концентрации на различните разтвори са както следва: 500 ng/mL DCF-DA, 0,2 процента DMSO и 200 ng/mL PMA. Флуоресценцията беше измерена в четец на плаки с множество етикети с филтри за възбуждане и излъчване, настроени на 485 и 535 nm. Флуоресценцията на всяка ямка

се измерва веднага след добавянето на разтвори към ямката и на всеки 15 минути след това в продължение на 150 минути. Времевата точка за сравняване на стойностите на флуоресценция е 150 минути. Стойностите на флуоресценцията на неиндуцираната контролна група бяха извадени от флуоресценцията

стойности на отделните PMA-индуцирани групи. Изчислени са нормализираните стойности на флуоресценция. Тези нормализирани стойности на флуоресценция бяха сортирани в три колони.

2.8. Екстракция на РНК и PCR в реално време

Замразениятбъбрецибяха смлени в TRIzol (Omega, Norcross, GA, USA) и общата РНК беше отделена съгласно протокола [33]. След смилане с DNase1 (NEB, Ipswich, MA, USA), cDNA беше произведена от RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) с Random Hexamer Primer. qRT-PCR беше поставен в 10 uL реакционни смеси, съдържащи 5 uL от 2 × SYBR Green qPCR Master Mix (Bike, Houston, TX, USA). Всички проби се провеждат в два екземпляра и се нормализират до eEF1a1a експресия. Последователностите на олигонуклеотидните праймери, използвани в настоящото изследване, са описани в допълнителна таблица S1. Относителното количествено определяне на иРНК на мишената спрямо референтната се определя с помощта на 2-AACT метода [34].

2.9. Статистически анализ

Количествените данни са показани като средна стойност ± SD. Статистическите анализи бяха извършени със SPSS версия 24 (SPSS Inc., Чикаго, Илинойс, САЩ). Статистическите сравнения между две групи бяха извършени с помощта на t-тест на Стюдънт или непараметричен тест, в зависимост от резултата от теста за нормалност. Анализите за множество групи с нормално разпределение бяха извършени с помощта на еднопосочен ANOVA, а останалите бяха извършени с помощта на непараметрични тестове. Всички статистически данни и методи могат да бъдат проверени в таблица S2.

3. Резултати

3.1. Промени в телесното тегло и антибактериалните свойства на рибката зебра по време на гладуване и повторно хранене

Пълният компенсаторен растеж се реализира при рибките зебра. След гладуване в продължение на 7 до 14 дни, рибата зебра е загубила поне 15 процента телесно тегло. След 14 дни повторно хранене, телесното тегло на рибките зебра в групата на гладуване се изравнява с това на контролната група (Фигура 1A-C). След гладуване и повторно хранене, за да се изследва устойчивостта на рибките зебра към патогени, те бяха интраперитонеално инжектирани със Streptococcus agalactiae. Рибките зебра в групата на гладуване имат повишена смъртност в сравнение с контролната група. С удължаването на повторното хранене, смъртността продължи да намалява (Фигура 1D).

Фигура 1. Модел на компенсаторен растеж при рибките зебра. A до C: промяна на телесното тегло на рибката зебра по време на гладуване и повторно хранене. (A) Рибките зебра бяха гладни в продължение на 7 дни и хранени отново в продължение на 28 дни. (B) Рибките зебра бяха гладни в продължение на 14 дни и хранени отново в продължение на 21 дни. (C) Рибките зебра бяха гладни в продължение на 21 дни и хранени отново в продължение на 14 дни. n=21–22. (D) Степента на оцеляване на рибки зебра, които са били интраперитонеално инжектирани със S. agalactiae; F: хранене; S: гладуване; R: подхранване. n=3, *: p < {{10}}.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" р=""><>

3.2. Морфологични промени в бъбреците на зебрата по време на гладуване и повторно хранене

Theбъбреке основната имунна тъкан при рибките зебра. Гладуването причинява морфологични промени вбъбреци. След 21 дни гладуване, бъбрекът показва очевидни морфологични промени. Установихме, че повече наранени тубули с хиалинови капчици се появяват след повторно хранене за 3 и 5 дни. Тази ситуация се подобри на 7 дни. Освен това се наблюдава, че броят на центровете на меланомакрофаги (MMCs) вбъбрексе увеличава след гладуване (Фигура 2A–C). Заедно с повторното хранене този симптом беше спасен. Експресията на иРНК на havcr1 се увеличава след гладуване (Фигура 2D), което показва, че гладуването може да причинибъбрекнараняване.

Фигура 2. Морфологични промени вбъбрецириба зебра по време на гладуване и захранване. (A) HE-оцветяване набъбрекпри рибки зебра по време на гладуване и повторно хранене. Черен триъгълник обозначава наранени тубули. Червената стрелка обозначава MMC. Червената звезда означава хиалинови капчици. (B) Статистически анализ на дела на увредените тубули вбъбрек. (C) Статистически анализ на MMCs в бъбреците. n=3–4. (D) Относителната експресия на иРНК на havcr1 ген вбъбрекриба зебра по време на гладуване и захранване. n {{0}}–10. F: хранене; S: гладуване; R: подхранване. *: p <>

3.3. Оксидативният стрес се задейства по време на гладуване и повторно хранене

Съдържанието на MDA се повишава значително след гладуване в продължение на 21 и 24 дни и намалява след 3 дни повторно хранене (Фигура 3A). Съдържанието на ROS обаче намалява с 24 дни глад и се възстановява с повторно хранене за 7 дни (Фигура 3B). Съдържанието на NO се повишава след гладуване в продължение на 21 дни (Фигура 3C). Активността на антиоксидантните ензими, включително SOD, GSH-Px и CAT, се повишава след гладуване. Дейностите на GSH-Px и CAT бързо намаляват и се възстановяват на 3-ия ден от повторното хранене. Въпреки че активността на SOD намалява с повторно хранене, тя все още е по-висока от тази на контролата (Фигура 4).

Фигура 3. Оксидативен стрес в бъбреците на рибка зебра по време на гладуване и повторно хранене. (A) Съдържанието на MDA в бъбрека. (B) Промяната на ROS в бъбрека. (C) Съдържанието на NO в бъбрека. F: хранене; S: гладуване; R: подхранване. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" р=""><>

Фигура 4. Активността на ензимите в антиоксидантните системи вбъбрецириба зебра по време на гладуване и захранване. (A) Активността на SOD в бъбреците. (B) Активността на GSH-Px в бъбрека. (C) Активността на CAT в бъбрека. F: хранене; S: гладуване; R: подхранване. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" р=""><>

3.4. Вродената имунна система на бъбрека на рибката зебра е повлияна от гладуване и повторно хранене

Активността на ALP се увеличава в бъбреците след гладуване и намалява след повторно хранене (Фигура 5А). При повторно хранене в продължение на 7 дни няма значителна разлика между групата на повторно хранене и контролата. Активността на лизозима в бъбреците показва подобна тенденция на ALP, която се увеличава с гладуване (Фигура 5B). Намаля бързо след повторно хранене. Отговорът на респираторен взрив в бъбреците не показва значителни промени в различните групи, но отговорът е по-висок в групата на гладуване и повторно хранене (Фигура 5C). Експресията на иРНК на провъзпалителния цитокин il-1 показва забележително увеличение във всички групи на гладно, но незабавно намалява след повторно хранене (Фигура 6А). Експресията на mRNA на tgfb1a и tgfb1b показва същата тенденция като il-1 (Фигура 6E,F). Въпреки това, експресията на mRNA на nfkb1 се увеличава значително след гладуване в продължение на 24 дни и намалява след повторно хранене в продължение на 3 дни. Експресията на mRNA на nfkb2 показва тенденция, подобна на тази на nfkb1 (Фигура 6B, C). Генът arg2 кодира аргиназа II, която е свързана с провъзпалителния отговор. В допълнение, експресията на mRNA на arg2 се увеличи забележително във всички групи на гладно и беше намалена след повторно хранене (Фигура 6D). След като предизвикаха рибките зебра, които преминаха през гладуване и повторно хранене, отговорът беше по-силен в групата на гладуване. Експресията на mRNA на il-1 и mmp9 в групата на гладно, лекувана с LPS, е значително по-висока от тази в третираната с LPS контролна група или групите с повторно хранене (Фигура 7).

Фигура 5. Параметрите на вродената имунна система вбъбрецириба зебра по време на гладуване и захранване. (A) Активност на ALP в бъбрека на риба зебра по време на гладуване и повторно хранене. (B) Лизозимна активност вбъбрекриба зебра по време на гладуване и захранване. (C) Реакция на респираторен взрив на бъбрека при риба зебра след гладуване и повторно хранене. (C1) Стойността на флуоресценцията/протеина на бъбрека по различно време. (C2) Стойности на флуоресценция/протеин набъбрекна 150 мин. (C3) Нормализиране на стойността на флуоресценция/протеин на бъбрека на 150 min. F: хранене; S: гладуване; R: подхранване. n=12. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" р=""><>

Фигура 6. Относителната експресия на иРНК на имунно-свързани гени в бъбреците на рибка зебра по време на гладуване и повторно хранене. (A–F):il-1, nfkb1, nfkb2, arg2, tgfb1a и tgfb1b. F: хранене; S: гладуване; R: подхранване. n=8–1{{10}}. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" р=""><>

Фигура 7. Относителната експресия на иРНК на имунно-свързани гени вбъбрецириба зебра, провокирана с 5 uL от 20 ug/mL LPS след гладуване и повторно хранене. (A–C) il-1, mmp9 и nfkb1. F: хранене; S: гладуване; R: подхранване. n=8–12. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" р=""><>

4. Обсъждане

В настоящото проучване открихме, че пълната CG може да се реализира в рибки зебра след различна продължителност на гладуване. Дори след 3 седмици гладуване телесното тегло на рибките зебра достига това на контролната група след две седмици. Този резултат е в съответствие с предишна работа [28]. Проучванията показват, че гладуването и повторното хранене влияят върху метаболитното състояние на рибката зебра [27,28]. При отглежданите видове, значението на CG е, че подобрява ефикасността на производството. За отглежданите видове е важно да поддържат антибактериални свойства по време на гладуване и повторно хранене. По време на този процес рибката зебра има потенциала да страда от патогени. Съобщава се, че гладуването не е повлияло на имунния отговор при инфектиран Piaractus mesopotamicus [18]. За съжаление гладуването повишава чувствителността на рибките зебра към S. agalactiae. Едновременно с това, биохимичните параметри и експресията на иРНК на вродената имунна система бяха повлияни от гладуването.

При рибката зебра липсват лимфни възли, а бъбрекът е основният лимфоиден орган, еквивалентен на костния мозък на бозайник [24]. При възрастни рибки зебра бъбрекът е основното място на хематопоезата [35]. Популациите в бъбречния мозък съдържат много видове хематопоетични клетки, включително макрофаги, неутрофили и лимфоцити [36,37]. Правилната функция на бъбреците е важна за вродената имунна система при рибките зебра. В настоящото изследване наблюдавахме някои морфологични промени в бъбреците на риба зебра, подложена на глад. Отлагането на ММС в бъбреците значително се увеличава след гладуване. По-рано беше установено, че гладуването може да причини отлагането на мелано-макрофаги (ММ) в бъбреците и далака при рибите [38]. MMCs се появяват главно в бъбреците, черния дроб и далака и са дифузни и по-малко структурирани в бъбреците [39]. Смята се, че ММС функционират както в имунната защита, така и в нормалните, неимунологични, физиологични процеси. Основната функция на MMC е фагоцитоза. Смята се, че MMC могат да участват както във вродени, така и в адаптивни имунни отговори. Добавянето на MMC след гладуване може да се дължи на хемофагоцитоза и изчистване на клетъчни остатъци. В допълнение, в първите дни на повторно хранене се наблюдава структурата на хиалиновите капчици. Смята се, че наличието на хиалинови капчици е показателно главно за alpha2u-глобулин в тубулните епителни клетки [40]. В допълнение, в модел на хистиоцитен сарком, неопластични хистиоцити произвеждат лизозим и лизозимът се натрупва в тубулни епителни клетки [41]. В обобщение, образуването на хиалинови капчици възниква, защото бъбреците не могат да усвоят протеина, който се натрупва в тубулните епителни клетки. Нивото на KIM-1 (кодирано от havcr1) може да покаже структурното увреждане на тубулите [42]. След гладуване, експресията на mRNA на havcr1 значително се увеличава и намалява с повторно хранене. Можем да прогнозираме, че функцията на бъбреците е нарушена от гладуване и с повторно хранене бъбречната функция се възстановява. Изискванията обаче са натоварващи в началото на захранването.

Фагоцитозата е важен процес на защита на вродената имунна система при рибите. Оксидативният стрес ще ограничи имунния отговор [20]. Антиоксидантната защита зависи главно от ензимите. SOD, GPx и каталазата са важни компоненти на антиоксидантните системи [43]. SOD медиира превръщането на супероксиден анион и H2O2. Каталазата участва в детоксикацията на H2O2 до вода. GPx катализира хидропероксиди (напр. H2O2 и липидни хидропероксиди) до H2O чрез окисляване на глутатион (GSH) в глутатион дисулфид (GSSH) [43–45]. MDA е един от основните продукти на липидното окисление и се произвежда от полиненаситени мастни киселини (PUFA) чрез химични реакции и реакции, катализирани от ензими. ROS може да пероксидира PUFA, за да генерира MDA. Съдържанието на MDA е биомаркер, който обикновено се използва за оценка на оксидативния стрес [46]. В настоящата работа, въпреки че съдържанието на ROS намалява, съдържанието на MDA в бъбреците се повишава значително и активността на всички ензими, принадлежащи към антиоксидантната система, също се повишава. Откриването на ROS е преходен отговор. Промяната в активността на антиоксидантния ензим е резултат от дългосрочно гладуване. Противоположните тенденции между ROS и антиоксидантните ензими може да се дължат на факта, че нормалните процеси на клетъчна активност произвеждат ROS, докато продължителното гладуване води до намалена клетъчна активност. Този резултат показва, че гладуването причинява оксидативен стрес в бъбреците по хроничен начин. Продължителният оксидативен стрес може да причини увреждане на вещества в клетките като липиди и протеини и накрая да доведе до апоптоза и натрупване на окислени молекулни агрегати [20]. При телеостите се съобщава, че индуцираното от гладуване съдържание на MDA в черния дроб и червата и повишава активността на антиоксидантните ензими [47–49]. Тези резултати предполагат, че въпреки че антиоксидантната система е активирана, тя не е достатъчна, за да изчисти щетите, причинени от гладуването. Междувременно оксидативният стрес може да активира голям набор от транскрипционни фактори, като NF-kB, Nrf2 и HIF-1a. Впоследствие тези транскрипционни фактори индуцират експресията на много цитокини и хемокини. По този начин оксидативният стрес може да доведе до хронично възпаление [44].

Предизвикани със Streptococcus agalactiae, рибките зебра в групата на гладуване претърпяха по-висока смъртност от тези в контролната група. Междувременно активността на ALP и лизозима се подобрява при гладуване. Лизозимът е важен компонент във вродената имунна система на рибите и участва в процеса на фагоцитоза [50]. Според резултатите, гладуването е причинило експресията на иРНК на il-1, nfkb1, tgfb1a, tgfb1b и arg2. Тези промени могат да бъдат причинени от оксидативен стрес. TGFB1 е цитокин, който има както про-, така и противовъзпалителни ефекти [51]. Рекомбинантният TGFB1 показва имуносупресивна активност и понижава експресията на провъзпалителни цитокини в левкоцитите на телеостите. При рибките зебра експресията на tgfb1a причинява възпаление в черния дроб [52]. Хроничната индукция на tgfb1a активира възпаление и неговата експресия индуцира чернодробна фиброза в ранен хепатоцелуларен карцином при рибка зебра. Аргиназата е първичен ензим и е отговорен за превръщането на L-аргинин в L-орнитин и урея. Аргиназата има два изоензима (аргиназа I и аргиназа II) [53,54]. Аргиназа II е свързан с имунитета ген и е установено, че е свързан с провъзпалителни реакции в макрофагите чрез митохондриална ROS. Тези данни показват, че гладуването може да предизвика имунен отговор в бъбреците. При мишки гладуването намалява чувствителността към LPS и не повлиява експресията на il-1 [55]. Въпреки това, рибките зебра, стимулирани с LPS, показват груб отговор на LPS и експресията на il-1 и mmp9 е значително по-висока, отколкото в другите групи. За разлика от мишките, рибките зебра стават по-чувствителни към LPS след гладуване, така че гладуването може да наруши способността им да изчистват патогените.

5. Изводи

В настоящото изследване ние предварително проучихме влиянието на гладуването и повторното хранене върху вродената имунна система на рибката зебра. Реализира се компенсаторен растеж при рибките зебра, придружен от повишена чувствителност към патогени след гладуване. Оксидативният стрес - причинен от гладуване и свързаните с опасността молекулярни модели, произведени от увредени бъбречни тубули - може да са допринесли за възпалението. Необходими са допълнителни проучвания, за да се проучи как гладуването увеличава податливостта и как метаболитното състояние влияе на различни видове имунни клетки.

Допълнителни материали: Следното е достъпно онлайн на https://www.mdpi.com/article/10.3390/biom11060825/s1, Таблица S1: Списък на праймерите, използвани в това изследване; Таблица S2: Статистическият резултат от експеримента.

Авторски принос: Концептуализация, ZL и WL; Подреждане на данни, JJ; Формален анализ, ZL и DL; Придобиване на финансиране, WL; Разследване, ZL, DL, RC и YY; Методика, ЗЛ; Надзор, WL; Писане - оригинална чернова, ZL; Писане—преглед и редактиране, WL Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране: Тази работа е финансирана от Националната ключова научноизследователска и развойна програма на Китай (2018YFD0900101), Китайската система за изследване на селското стопанство на MOF и MARA (CARS-46) и Програмата за китайски изявени таланти в научните изследвания в селското стопанство ({{3 }}) до Веншен Ли.

Декларация на институционалния съвет за преглед: Проучването е проведено в съответствие с насоките на Декларацията от Хелзинки и е одобрено от Комитета за грижа и използване на животните към Университета Сун Ят-Сен.

Изявление за информирано съгласие: Не е приложимо.

Изявление за наличност на данни: Не е приложимо.

Конфликт на интереси: Авторите декларират, че нямат конфликт на интереси.