Взаимодействия между полифенолни антиоксиданти кверцетин и нарингенин определят отличителното свързано с редокс химическо и биологично поведение на техните смеси, част 1

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Изследвания, проведени през последните две десетилетия върху молекулярната основа на неинфекциозни хронични заболявания като напратеросклероза, хипертония, диабетът и особено ракът, който привлича голям интерес, разкри, че всички тези заболявания споделят общ рисков фактор, който е нарушаването на редокс хомеостазата, често наричан оксидативен стрес12. Възниква в резултат на повишено ендогенно ниво на реактивни кислородни видове (ROS) поради повреда на антиоксидантната бариера на тялото и се смята, че насърчава развитието на всички тези заболявания.3. По този начин следва предположението, че екзогенни фактори, способни да неутрализират ROS, например растителни антиоксиданти, могат да противодействат или забавят развитието на хронични заболявания и да подпомогнат лечението им. Проверката на тази хипотеза инициира подробни проучвания на антиоксиданти, присъстващи в храните, които могат да проявят превантивен потенциал4. Наистина, няколко проучвания, обобщени в мета-анализа, сравняващи консумацията на храна и свързаните с диетата хронични заболявания, разкриват намален риск в случай на диети, богати на плодове и зеленчуци, пълнозърнести зърнени храни, както и напитки като вино, кафе и чай, следователно продукти, богати на антиоксидантни фитохимикали. Не е изненадващо, че се предполага, че тези вещества, веднъж изолирани от техните естествени източници, пречистени и след това консумирани под формата на хранителни добавки, съдържащи по-високи дози от тези, постижими с диета, могат да се превърнат в мощни химиопревантивни агенти. Това предположение беше потвърдено от голям брой доказателства, идващи от проучвания, използващи различни експериментални in vitro и in vivo модели на хронични заболявания, включително рак. . Например, два мета-анализа на човешки кохортни и случай-контролни изследвания с витамин Е8 или препарати с микроелементи" заключиха, че ниските нива на антиоксиданти нямат ефект, докато високите дози могат да увеличат както честотата, така и смъртността от рак и сърдечно-съдови заболявания. Когато обаче, добавките са базирани на истински растения, като специфична смес от концентрирани храни, богати на полифеноли (нар, зелен чай, броколи и куркума), се наблюдава значителен защитен ефект при мъже с рак на простатата1.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Обещаващите ефекти на пълнозърнестите храни за разлика от изолираните съединения са в съответствие с концепцията за хранителна синергия, която се определя като добавка или повече от адитивното влияние на комбинацията от различни хранителни съставки върху човешкото здраве. Нашето по-ранно проучване потвърди тази концепция, като сравни биоактивността на истинските храни с техния изолиран основен антиоксидант. Това показа, че биологичните ефекти на екстрактите от ягодоплодни се различават значително от тези, проявени от антоцианин цианидин-3-О-глюкозид. Някои други доклади също посочват важността на взаимодействията между различни биоактивни съединения и компоненти на хранителната матрица, които се оказаха сътрудничещи фактори, които определят крайната биоактивност на храните3-1. Нашите неотдавнашни механистични изследвания, включващи поетапно възстановяване на биоактивния състав на какаото, също подкрепиха идеята за хранителна синергия, но показаха, че биологичните ефекти на проби със сложен състав не са просто комбинация от активностите, проявени от отделните компоненти'3. Всички тези наблюдения предполагат, че когато се разглеждат свързаните с редокс биоактивности на изолирани антиоксиданти спрямо техните смеси, трябва да се вземат предвид взаимодействията между компонентите. Нарастващата сложност на смес отфитохимикалисякаш Създаване на новредокс-активно веществовместо да обогатява сместа с нови дейности, характерни за добавеното съединение, което се извежда от концепцията за хранителна синергия.

Cistanche може да подобри имунитета

В настоящите изследвания ние опростихме експерименталната система, като я ограничихме само до две основни структури, за да се задълбочим в детайлите на техните взаимодействия в контекста на химичната структура, редокс реактивността и биоактивностите, свързани с редокс, така че да позволим по-добро разбиране и предсказване на хемопревантивния потенциал на антиоксидантите. Фитохимикалите, използвани за тази цел, са обикновени антиоксиданти, присъстващи в различни билки, зеленчуци и плодове, особено в цитрусовите плодове, а именно: флавоноли, представени от кверцетин (O) и неговия рамно-рутин ( R) и флаванони от нарингенин (N-) и неговитенеохесперидозиднарингин (N плюс), както и две смеси от тези съединения (QN-, RN плюс). Химичният състав на изследването обхваща определяния, даващи известна представа за термодинамиката и кинетиката на окислителните процеси, т.е. DPPH тест, потенциометрично титруване и диференциална импулсна волтаметрия (DPV). Биологичните тестове изследваха въздействието на изследваните проби върху клетъчния растеж (MTT тест), клетъчната антиоксидантна активност (CAA анализ), генотоксичността (комет анализ), глобалното ниво на метилиране на ДНК (епигенетична версия на комет анализ) и експресията на 84 redox -свързани гени (технологии, базирани на PCR масив в реално време). Биологичните експерименти бяха проведени с помощта на препоръчаната за хранителни изследвания клетъчна линия на аденокарцином на дебелото черво HT29 като модел на чревния епител, който може да бъде изложен на относително високи концентрации на погълнати антиоксиданти.

Резултати

Нашите по-ранни изследвания, които сравняват свързаните с редокс свойствата на какаото на прах и основните му съставки, посочиха значението на взаимодействията между полифенолните компоненти на сместа върху цялостната антиоксидантна активност. В настоящото изследване опростихме експерименталната система, за да изследваме по-подробно такива взаимодействия за двойка флавоноиди, които са обичайни хранителни компоненти. Бяха избрани два флавоноида, и двата под формата на агликони и гликозиди. Флавонолите са представени от кверцетин (Q) и неговиярамнозид-рутин(R) ифлаванониот нарингенин (N-) и неговия неохесперидозид нарингин (N плюс). Тези полифеноли се различават по броя и разположението на редокс-активните хидроксилни групи, както и способността да образуват вътрешномолекулни Н-връзки, т.е. три структурни характеристики, които могат да попречат на намаляването на свойствата на антиоксидантните съединения. Както е показано на фиг. 1, междинните семихинонови радикали, образувани в първия етап на окисление на катехоловата част в пръстен B

на Q или R може да се стабилизира по два начина i8,19. Първият начин е конюгацията както на основната структура върху В и С пръстените, така и образуването на втора Н-връзка със съседна ОН група или заместители в С пръстен, особено в R. присъствието на хидроксилни групи в захарен заместител в позиция 3 на пръстен С може допълнително да засили този стабилизиращ ефект поради повече възможности за образуване на Н-връзки (директно или чрез водна молекула). Обратно, междинният феноксилов радикал в N плюс или N- не е стабилизиран нито чрез конюгирани двойни връзки, включващи също пръстен С, нито Н-свързване със съседни заместители. Освен това, в N плюс, захарната част е прикрепена към пръстен А и по този начин е твърде далеч, за да образува Н-връзка с радикала в пръстен B. Може да се очаква тези структурни характеристики да повлияят на редокс активността на изследваните флавоноиди.

Антиоксидантна активност чрез химически тестове.

Определянето на редуциращите свойства за изследваните полифеноли и техните смеси беше извършено чрез два химични анализа при 37 градуса С, за да съответстват на клетъчните условия на редокс процесите. Първият метод беше често използваният партиден спектрофотометричен DPPH тест; резултатите за отделни флавоноиди и техните смеси са представени на фиг. 2А. Те се изразяват като стехиометрични стойности n, където числото 10 се отнася до продължителността на реакцията - 10 минути. Чрез въвеждане на времевия параметър в измерванията, кинетичният аспект беше включен в оценката на антиоксидантната активност, както беше описано по-рано13. При тези определяния и двата агликона показаха по-силни редуциращи свойства от съответните гликозиди, както беше показано преди с този тест 2021, докато флавонолите бяха повече активен от флаваноните. O беше най-ефективното съединение при извличане на DPPHрадикал и беше последвано от R. Въпреки незначителната реактивност спрямо DPPH, и двата флаванона, включително N, който сам по себе си не показа редокс свойства в рамките на 10-минутен период на реакцията, значително увеличи общата антиоксидантна активност на смеси, в случай както на агликони ON-, така и на гликозиди RN плюс .

Вторият метод включва потенциометрично титруване (PT), което позволява измерване на стандартния редукционен потенциал (E), и по този начин се оценява термодинамичната способност на чистите съединения да получават електрони. Определените стойности на потвърждават, че Q и R са силно редуциращи съединения (фиг. 2B). Въпреки това, в PT, R приема донорни електрони по-охотно от Q. Определянето на E за N- и N плюс не е възможно поради много бавния трансфер на електрони по време на процеса на окисление (по-бавно за N плюс). PT измерва разликата в потенциала между референтния електрод и измервателния електрод след добавяне на всяка порция титрант. Стабилният потенциал означава, че коефициентът на реакцията (Q) между титранта и аналита е стабилен (Q= константа). Ако скоростта на пренос на заряд по време на реакция е ниска (ниски токове при волтаметрия), тогава отнема много време, за да се стабилизира Q в PT. Следователно, за много бавни реакции, потенциометричната крива на титруване е трудна за получаване и по този начин намерената стойност на E" е по-малко надеждна.

Антиоксидантна активност чрез диференциална импулсна волтаметрия,

Използваните химични тестове предполагат, че изясняването на антиоксидантното действие на полифенолите трябва да вземе предвид кинетичните аспекти, където стабилността на междинните радикали може да играе роля. Както е показано на фиг. 1, семихиноновите радикали, образувани при първия етап на окисление на флаванол, са много по-добре стабилизирани от феноксилните радикали, възникващи при окисление на флаванон. Тази връзка е илюстрирана на фиг. 1 и може да повлияе на скоростта на редокс процесите. Следователно, редукционно-окислителните свойства на изследваните чисти антиоксиданти и техните смеси бяха допълнително анализирани с помощта на диференциална импулсна волтаметрия (DPV). Тъй като тази техника позволява наблюдение както на термодинамичните, така и на кинетичните аспекти на окислителните реакции, и двете накрая се комбинират в параметър, наречен антиоксидантна мощност (AOP)15.

Наблюденията, направени с DPV измервания (фиг. 2B-F), противоречат на тези, получени с DPPH теста (фиг. 2A). Изненадващо, DPV разкри, че Q, описан в литературата като отличен редуктор, когато се разглеждат само термодинамичните аспекти (потенциал на аноден пик, Е.), се оказа най-слабият антиоксидант (Фигура 2B, C). Термодинамично, R е малко по-силен антиоксидант. Интересното е, че N- и N плюс се считат в литературата за слаби антиоксиданти, показващи термодинамично най-високите стойности на Е, което означава, че те са много силни редуциращи агенти. И за двата класа флавоноиди гликозидната част повишава антиоксидантната активност на агликоните. Въпреки това параметрите, свързани с кинетиката (фиг. 2E, F), т.е. аноден ток (I,.) и плътност на заряда (Q), разкриват, че окисляването на N plus е по-бавният процес в сравнение с окисляването на Q и R. По подобен начин , анодният ток (I) е по-нисък за N- отколкото за Q и R, но преносът на заряд за това съединение достига най-високата стойност.

В случай на смеси бяха открити два анодни пика (1-ви и 2-ри) на волтаметричните криви, както може да се очаква за двукомпонентната смес. Определените стойности на анодни пикови потенциали (E.) показват, че 1-ви наблюдаван пик отразява окисляването на флавоноли, докато 2"d пик окисляването на флаванони (допълнителни материали-фиг. S1). В повечето случаи присъствието на другия компонент в смес повлиява термодинамиката и/или кинетиката на окислително-редукционния процес в сравнение с окисляването на чистите съединения.Например, за QN-, стойността на E., за 1-ви пик на окисление е равна на потенциала на анодния пик на Q Въпреки това, 2" анодният пик, съответстващ на N-окисление и потенциалът на този преход е по-висок от анодния потенциал на чистия N-(фиг. 2C). Обратната ситуация се наблюдава за кинетиката на тази реакция. I и Q на 1s анодния пик на QN са близки до кинетичните параметри на окислението на чистите компоненти (фиг. 2E, F), докато зарядът, обменен по време на 2n стъпка на ON-окисление, е много по-нисък от този за N-окисление (Фиг.2F). Тези комбинирани термодинамични и кинетични ефекти доведоха до повишаване на AOP (фиг. 2D) на тази смес, което е в съответствие с резултатите от DPPH теста.

Оценка на цитотоксичността.

Влиянието на изследваните флавоноидни агликони (Q, N-), гликозиди (R, N плюс) и техните смеси (QN-, RN плюс) върху растежа на чревните клетки беше оценено чрез МТТ теста. Клетъчната линия HT29 на човешкия аденокарцином на дебелото черво беше избрана като модел на епител на храносмилателния тракт, т.е. тъканта в пряк контакт с погълнати хранителни съставки като полифеноли. Клетките бяха третирани с отделни флавоноиди и техни смеси при физиологични концентрации, потенциално съществуващи в кръвта (0.01-1 uM)22-2 или концентрации, постижими в храносмилателния тракт (10-100 uM) след поглъщане на храна25-27. Кривите доза-отговор за 6, 24 и 72 h лечения са представени на Фиг.3.

Индивидуалните съединения не повлияват значително клетъчния растеж при никоя от изследваните концентрации, нито за кратко, нито за продължително лечение. Изключение е най-високата концентрация на N-, която след 72 часа инхибира клетъчния растеж до 75 процента в сравнение с контролата. Обратно, изследваните смеси (QN-, RN плюс) значително стимулират клетъчния растеж по зависим от концентрацията начин за всички тествани времена на експозиция. Този ефект се наблюдава при ниски концентрации (0.01-1 uM), които са достъпни в кръвния поток и е още по-мощен при по-високи концентрации (10-100 uM), към които епителните клетки на храносмилателния тракт могат да бъдат изложени. Само в случай на най-висока концентрация на QN-, след 72 часа лечение, стимулацията престава, вероятно поради инхибиторни ефекти, наблюдавани при такива условия за N-. Клетъчна антиоксидантна активност. Ефективността на пречистените флавоноиди и техните смеси в поддържането на ендогенната антиоксидантна бариера на клетките НТ29 беше потвърдена с помощта на CAA анализ. Този метод разчита на способността на проба, съдържаща редокс-активни съединения, да инхибира или насърчава окислението на абсорбираната проба от клетките до неговата флуоресцентна форма. Затихването на окислението на сондата, наблюдавано като потушаване на флуоресценцията, е мярка за редуциращия капацитет на антиоксидантите в клетките (положителни стойности на CAA), докато увеличаването на окислението на сондата означава тяхната прооксидативна активност (отрицателни стойности на CAA)28 . Определянията са извършени за агликони и гликозиди при концентрации, отразяващи както физиологичните — ендогенни — така и получените от храната — екзогенни — експозиции на червата. Инкубацията с изследваните флавоноиди се провежда за стандартен препоръчителен период от 1 h18 за агликони и гликозиди. Продължителните лечения (3 и 6 часа), насочени към проследяване на кинетиката на редокс отговора в приложения клетъчен модел, се използват само в случай на агликони, поради тяхното по-забележимо въздействие върху клетъчната антиоксидантна активност.

Изследваните флаванони и флавоноли се различават по влиянието си върху редокс статуса на клетките НТ29. В случай на отделни агликони, дефинираните зависими от концентрацията реакции се наблюдават след 1 час експозиция. Въпреки това антиоксидантната активност на флавонол-Q се повишава с приложената концентрация, докато в случая на флаванон-N- се наблюдава постепенно засилване на прооксидативния ефект (фиг. 4А). Зависимостта от дозата на отделните гликозиди е по-малко очевидна; само R в най-високата си концентрация убедително повишава клетъчната антиоксидантна активност (фиг. 4А). Интересното е, че и двете смеси показват повишена антиоксидантна активност, очевидно не повлияна от прооксидативния ефект, наблюдаван за отделните съединения.

Фигура 4В представя кинетиката на промените в стойностите на CAA, определени след 1,3 и 6h третиране на НТ29 клетки с агликони. За най-ниската концентрация (1 μM), съответстваща на физиологичните експозиции, зависимостта от времето не се наблюдава нито за отделни агликони, нито за тяхната смес. Въпреки това, влиянието на по-високата концентрация върху стойностите на CAA е ясно зависимо от времето. Продължителните експозиции намаляват както прооксидативния ефект на N-, така и антиоксидантната активност на Q и QN-.

Изследваните агликони показват различна нутригеномна активност, допълнително модифицирана от концентрацията, приложена към клетките.

Флаванон N-при 1 μM значително намалява експресията на CCL5, CYGB, GTF2I, MT3 (p<0.05) as="" well="" as="" showing="" some="" tendency="" to="" down-regulate="" alox12="" and="" ucp2="" transcription=""><><0.09). the="" increased="" expression="" caused="" by="" n-was="" observed="" for="" the="" ncf2="" gene="" only=""><0.05). these="" genes,="" though="" in="" one="" or="" another="" way,="" related="" to="" cellular="" redox="" status,="" do="" not="" fall="" into="" any="" specific="" common="" pathway="" nor="" are="" involved="" in="" any="" coordinated="" process.="" the="" protein="" encoded="" by="" ccl5="" belongs="" to="" a="" group="" of="" inflammation-relevant="" genes,="" while="" the="" cytoglobin="" gene(cygb)functions="" as="" a="" tumor="" suppressor="" gene2930.="" gtf2i="" protein="" acts="" as="" a="" general="" transcription="" factor="" and="" is="" involved="" in="" the="" coordination="" of="" cell="" growth="" and="" division31.="" so,="" the="" other="" gene="" down-regulated="" by="" the="" n-at="" l="" um="" gene—mt3—may="" cooperate="" with="" it,="" because="" although="" it="" plays="" a="" role="" in="" zinc="" and="" copper="" homeostasis,="" it="" is="" also="" known="" as="" growth="" inhibition="" factor2.="" the="" enzyme="" encoded="" by="" alox12="" acts="" on="" different="" polyunsaturated="" fatty="" acid="" substrates="" to="" generate="" bioactive="" lipid="" mediators3.="" the="" protein="" coded="" by="" ucp2="" has="" been="" described="" as="" a="" mitochondrial="" scavenger="" of="" ros.="" the="" only="" up-regulated="" gene="" by="" n-at="" 1="" um="" was="" ncf2="" which="" encodes="" a="" cytosolic="" protein="" required="" for="" the="" activation="" of="" the="" nadph="" oxidase="" system="" responsible="" for="" superoxide="">

Този флаванон, приложен към HT29 клетки при 10 uM, повлиява експресията на 5 гена, които също са регулирани надолу от по-ниската му доза, а именно: CCL5, CYGB.MT3(p<0.05)as well="" as="" gtf2i="" and=""><><0.09).additionally,in contrast="" to="" lower="" dose,="" n-at="" 10="" um="" showed="" tendency="" to="" decrease="" expression="" of=""><><0.09). the="" latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" with="" superoxide="" dismutase="" activity,i.e.,="" the="" antioxidant="" enzyme="" catalyzing="">

дисмутация на супероксидни радикали до водороден пероксид и кислород6. Лекото увеличение на експресията, причинено от N-при 10uM, се наблюдава само за VIMP гена (0,05<><0.09)that is="" involved="" in="" the="" degradation="" process="" of="" misfolded="" endoplasmic="" reticulum(er)luminal="">

Тази статия е извлечена от www.nature.com/scienticreports