Интерференция на фенилетаноидни гликозиди от Cistanche Tubulosa с МТТ анализ

1. Въведение

Паразитното растениеCistanche tubulosa(Шренк) Р. Уайт (Orobanchaceaeсемейство) е широко разпространено в северноафриканските, арабските и азиатските страни [1]. Произлиза отC. тубулозаиC. deserticolaса важни в традиционната китайска медицина, като са били използвани за лечение на импотентност, стерилитет, лумбаго и запек поради инерция на дебелото черво [2]. Освен това етаноловият екстракт отC. тубулозае доказано, че има значителен защитен ефект срещу церебрална хипоксия при мишки [3].

Ендотелните клетки играят решаваща роля в патогенезата на хипоксичната белодробна хипертония. Ендотелната клетъчна линия EA.hy926 е значително подобна на първичните ендотелни клетки. По време на нашето изследване на антихипоксичния ефект на етаноловия екстракт от C. tubulosa върху ендотелните клетки на EA.hy926 забелязахме, че 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил){{7 }},5-дифенилтетразолиев бромид (МТТ) анализ, който обикновено се използва за оценка на клетъчната жизнеспособност в проучвания за цитотоксичност и цитостатична активност, генерира противоречиви резултати, като показва повишена клетъчна жизнеспособност на EA.hy926 след лечение.

Точната оценка на клетъчната жизнеспособност е от съществено значение за идентифициране на потенциалните цитотоксични или цитопротективни ефекти на лекарствения агент. Ето защо ние проучихме кои компоненти, присъстващи в етаноловия екстракт от C. tubulosa, могат да бъдат отговорни за противоречивите резултати, наблюдавани с МТТ анализа. Изолирахме две основнифенилетаноидни гликозиди (PhGs)от етанолов екстракт от C. tubulosa,ехинакозид (оттук нататък съединение 1) и актеозид (оттук нататък съединение 2). Ние определихме техния ефект върху жизнеспособността на клетките EA.hy926, използвайки различни методи. Освен това, за да изясним допълнително кой заместител на съединения 1 и 2 може да е отговорен за противоречивите резултати, тествахме техните агликони, кафеена киселина (оттук нататък съединение 3) и 3,4-дихидроксилфенилетанол (оттук нататък съединение 4), върху EA .hy926 клетъчна жизнеспособност, използвайки същите методи.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ИНХИБИРАНЕ НА АПОПТОЗАТА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2. Резултати и дискусия

2.1. Идентификация на съединенията

Структурите на двете съединения, изолирани отЕтанолов екстракт от C. tubulosaбяха идентифицирани чрез анализи с ядрено-магнитен резонанс (NMR) и масспектрометрия (MS), както е показано на Фигура 1. Съединение 1 беше идентифицирано като ехинакозид чрез сравнение с докладвани по-рано ЯМР (Таблица 1) и MS (m/z 785 [M−H ]− ) данни [4]. ЯМР спектрите на съединение 2 бяха много подобни на тези на съединение 1, с изключение на отсъствието на -D-глюкопиранозилова група (Таблица 1). Съединение 2 (m/z 623 [M-H]-) се идентифицира катоактеозид[5]. Важно е, че и двете съединения имат един и същ агликон, който включва кафеена киселина (съединение 3) и 3,4-дихидроксилфенилетанол (съединение 4).

2.2. Тестове за клетъчна жизнеспособност

MTT и CCK{{0}} анализи бяха използвани за анализиране на ефекта на съединения 1-4 върху жизнеспособността на клетките EA.hy926. МТТ анализът показа, че жизнеспособността на клетките EA.hy926 се повишава значително след третиране с 25 и 50 μM съединения 1, 2 или 3 (166,3% и 174,1% за съединение 1, 205,8% и 224,3% за съединение 2 и съответно 164,8% и 189,6% за съединение 3; р <0,05) в сравнение с контролните клетки (Фигура 2А). Освен това, морфологичната инспекция на клетките установи, че третирането с 50 μM съединение 1, 2 или 3 увеличава образуването на лилави формазанови кристали, които са пряка индикация за дела на живите клетки (Фигура 3). Обратно, анализът CCK-8 предполага, че клетъчната жизнеспособност намалява значително след третиране с 12,5, 25 и 50 μM съединение 1, 2 или 3 (75,5%, 45,1% и 43,7% за съединение 1, 85,5%, 51,8% и 34,3% за съединение 2 и 64,5%, 48,2% и 36,4% за съединение 3, съответно; р <0,05) в сравнение с контролните клетки (Фигура 2В). Съединение 4 не повлиява клетъчната жизнеспособност нито в МТТ, нито в CCK-8 анализа. Несъответствието между резултатите, получени с двата анализа, предполага, че единият от двата анализа може да не отразява точно ефектите на съединения 1 и 2 върху жизнеспособността на клетките EA.hy926.

2.3. Оценка на апоптоза от Hoechst

Оцветяване Hoechst 33342 е клетъчно пропускливо ДНК оцветяване, което се възбужда от ултравиолетова светлина и излъчва синя флуоресценция при 460 до 490 nm. Кондензираният хроматин на апоптотичните клетки се оцветява по-ярко от хроматина на нормалните клетки [6]. Докато контролните клетки показват равномерно диспергиран хроматин, нормални органели и непокътнати клетъчни мембрани, клетките, инкубирани с 50 μM съединения 1, 2 или 3 в продължение на 48 часа, показват типичното оцветяване на апоптотични клетки (Фигура 4А). Обратно, излагането на клетки на 50 μM от съединение 4 не увеличава броя на апоптотичните ядра в сравнение с контролното лечение.

2.4. Поточен цитометричен анализ на апоптотични клетки

Тестът за двойно оцветяване с анексин V-FITC/PI идентифицира апоптотичните клетки чрез високоафинитетното свързване на анексин V-FITC с фосфатидилсерин, който се екстернализира в клетки, подложени на апоптоза [7]. В този анализ жизнеспособните клетки не се свързват нито с анексин V, нито с PI и следователно не се оцветяват (долния ляв квадрант), ранните апоптотични клетки се оцветяват в зелено чрез свързването на анексин V-FITC (долния десен квадрант), а късните апоптотични клетки са оцветени в зелено и червено от свързването на анексин V-FITC съответно с фосфатидилсерин и PI с некротични клетки (горен десен квадрант). Както е показано на Фигура 4В, клетките, инкубирани с 50 μM съединения 1, 2 или 3 за 48 часа, процентът на апоптотичните клетки се повишава от 3,74% (контролни клетки) до 10,32%, 12,95% и 11,30%, съответно. В сравнение с контролните клетки, съединение 4 не повишава процента на апоптотичните EA.hy926 клетки.

В съответствие с резултатите, получени с анализа CCK-8 и чрез оцветяване с Hoechst 33342, анализът с поточна цитометрия показа, че съединения 1, 2 и 3 индуцират апоптоза в клетки EA.hy926. Като цяло, тези наблюдения предполагат, че повишаването на жизнеспособността на клетките EA.hy926, наблюдавано с МТТ анализа след третиране със съединения 1-3, представлява фалшиво положителен резултат.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОВИШАВАНЕ НА ИМУНИТЕТА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.5. Дискусия

През 1983 г. Mosmann разработи колориметричен МТТ анализ на микроплака за измерване на клетъчна пролиферация и цитотоксичност [8]. Този прост анализ и неговите модификации сега се използват широко в лабораториите по клетъчна биология по целия свят. Изследванията на фракциониране в клетки на бозайници показват, че намаленият пиридинов нуклеотиден кофактор, NADH, е отговорен за по-голямата част от редуцирането на МТТ. Това беше подкрепено от проучвания, използващи цели клетки [9]. Следователно намаляването на МТТ е свързано с метаболитно активните клетки и не е свързано само с митохондриалното дишане, но също и с цитоплазмата и немитохондриалните мембрани, включително отделението за ендозома/лизозома и плазмената мембрана [10]. Нетният положителен заряд на молекулата на МТТ е основният фактор за нейното клетъчно усвояване чрез потенциала на плазмената мембрана.

Трябва да се отбележи, че анализът на МТТ понякога може да не отразява точно действителния ефект, който тестваното съединение има върху специфични клетки. Въпреки това, химичните структури или групи, които могат да причинят противоречиви резултати в MTT анализа, не са идентифицирани. Скорошни проучвания показват, че МТТ анализът може да подцени антипролиферативния ефект на (-)-епигалокатехин-3-галат, най-разпространеният полифенол в зеления чай [11]. В проучвания, използващи МТТ анализ за откриване на химиочувствителност на тумора, противораковите химиотерапевтични средства, като епирубицин, паклитаксел, доцетаксел и иматиниб мезилат (Gleevec), показват повишена клетъчна жизнеспособност [12,13]. Освен това, няколко проучвания съобщават, че някои растителни екстракти и редокс-активни полифеноли могат да повлияят на МТТ анализа, тъй като те директно редуцират МТТ тетразолиевата сол в отсъствието на клетки [14].

Необходимостта от разтваряне на формазанови кристали МТТ преди спектрофотометричен анализ в четец на микроплаки и присъщият характер на крайната точка на реакцията ограничават използването на МТТ анализа до определени приложения. Това доведе до разработването на тетразолиеви аналози, в които фениловите части бяха украсени с отрицателно заредени сулфонатни групи, като 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро- 5- сулфофенил)-2Н-тетразолиум-5-карбоксанилид (XTT), отрицателно заредена вътрешна сол [15] и 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил) -5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сулфофенил)-2Н-тетразолий (MTS), слабо кисела вътрешна сол, тясно свързана с МТТ [16] . Тези модификации доведоха до производството на формазанови продукти, разтворими в хранителна среда, които елиминираха изискването за етап на разтваряне преди количественото определяне. Съответно, тъй като повишеният отрицателен заряд на тези молекули намалява способността им да се движат през клетъчните мембрани [17], междинните акцептори на електрони (IEA), като 1-метокси-5-метил феназин метил сулфат ({{25 }}метокси PMS) бяха необходими за улесняване на редуцирането на тетразолното багрило или за повишаване на скоростта на редукция.

Съвсем наскоро беше разработено ново поколение водоразтворими тетразолиеви соли, чийто прототип е WST-1 [18]. WST-1, отрицателно заредена дисулфонирана вътрешна сол, съдържаща йоден остатък, е по-стабилна от XTT и MTS в присъствието на 1-метокси PMS, това е задължително IEA. Това доведе до пускането на пазара на WST-1/1-methoxy PMS като удобен комплект за клетъчна пролиферация с единичен реагент. Разработени са няколко други тетразолиеви соли от серията WST, най-полезната от които може би е WST-8 [19]. Изглежда, че WST-8 има много сходни свойства на клетъчна редукция с WST-1 и се предлага на пазара независимо като анализ CCK-8. WST-8 е клетъчно непропусклив и следователно се редуцира извънклетъчно, чрез електронен транспорт от вътреклетъчния NADH до WST-8 през плазмената мембрана, медииран от 1-метокси PMS. Въпреки че както MTT, така и WST-8/1-метокси PMS намаляването се управлява от вътреклетъчния NADH, източникът на NADH изглежда се различава в тези два метода. WST-8/1-метокси Намаляването на PMS е по-силно зависимо от малат/аспартатната совалка, която свързва цикъла на митохондриалната трикарбоксилна киселина-NADH с екстрамитохондриалното пространство [20].

В предварителните експерименти ние потвърдихме, че съединения 1, 2, 3 и 4 не могат директно да редуцират МТТ тетразолиевата сол (не е показано). В настоящото изследване директното влияние на самите съединения с реагента беше елиминирано чрез внимателно измиване на микроплаките с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) преди да се добави разтвор на MTT или CCK-8, както е посочено в протоколите на производителя. Въпреки това, резултатите, получени с помощта на двата метода, все още са противоречиви (Фигура 2). Както се очаква, инкубирането на клетки със съединения 1, 2 и 3 повишава редуцирането на тетразолиевата сол в лилав формазан, в сравнение с контролната група (Фигура 3), което предполага, че простото редуциране на тетразолиевата сол в присъствието на специфично съединение не е достатъчно, за да се прецени способността на съединението да повлияе на МТТ анализа.

За да се определи дали съединения 1, 2, 3 и 4 могат да индуцират апоптоза в EA.hy926 клетки, бяха оценени клетъчни морфологични промени и екстернализация на фосфатидилсерин. В съответствие с намалението на клетъчната жизнеспособност, наблюдавано с анализа CCK-8, резултатите от оцветяването на Hoechst и анализа на поточната цитометрия с използване на анексин V-FITC/PI предполагат, че инхибирането на растежа, наблюдавано след третиране със съединение 1, 2 и 3, е дължащо се, поне отчасти, на клетъчна апоптоза на EA.hy926. Нашите резултати също подкрепиха идеята, че кофеилната група, присъстваща в двете съединения 1 и 2, е отговорна за противоречивите резултати, получени с МТТ анализа.

Подобно на нашите открития, Rottlerin, мощен инструмент за отваряне на калиеви канали с голяма проводимост, не проявява реактивност към MTT in vitro. Въпреки това, той силно засилва образуването на формазанови кристали вътре в клетките, резултат, който е в очевиден конфликт с инхибирането на NF-κB и клетъчната пролиферация на Rottlerin, наблюдавани чрез анализ на включването на [3H]-тимидин в ДНК [21]. Механизмът, чрез който Rottlerin засилва намаляването на MTT, се дължи на неговия митохондриален разединяващ ефект [22]. Ротлерин има заместителна група на цинамоилова киселина. В сравнение с цинамоиловата киселина, съединение 3 притежава два допълнителни хидроксилни остатъка, които са разположени при C-3 и C-4. Следователно, ние спекулираме, че механизмът, чрез който съединения 1 и 2 причиняват противоречиви резултати в МТТ анализа, може също да бъде свързан с техните ефекти на митохондриално разединяване. За да се тества тази хипотеза, са необходими сравнителни изследвания между съединения 1 и 2 и химичен разединител, като трифлуорокарбонилцианид фенилхидразон (FCCP).

 ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Експериментален участък

3.1. Реактиви и химикали

Съединение 3 (кафеена киселина на прах, чистота=98.6%) е закупено от Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Китай). Съединение 4 (3,4-дихидроксилфенилетанол–масло, чистота=98.5%) е получено от Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Китай). МТТ и диметилсулфоксид (DMSO) са получени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, МО, САЩ). Анализът CCK-8 е закупен от Dojin Laboratories (Кумамото, Япония). Комплекти за откриване на апоптоза Hoechst 33342 и анексин V-FITC/PI бяха закупени от Института по биотехнологии Beyotime (Haimen, Китай).

3.2. Растителен материал

C. тубулозастъблата са събрани от префектура Ютиан, Синдзян-Уйгурски автономен регион, Китай. Образците от ваучери бяха депозирани в Ключовата лаборатория по медицина на голяма надморска височина, Трети военномедицински университет (Чонгкинг, Китай) и удостоверени от Yi Zhang от Университета по традиционна китайска медицина Ченгду (Чънду, Китай).

3.3. Извличане и изолиране на растителен материал

Въздушно изсушените стъбла на C. tubulosa (0.6 kg) се стрити на прах и се екстрахират с 50% етанол за 2 часа при 70 градуса. След отстраняване на разтворителя при понижено налягане, етаноловият екстракт (212.5 g) се разтваря и суспендира във вода (2 L) и се екстрахира с n-бутанол (2 L × 3). Екстрактът от n-бутанол (110 g) се хроматографира върху полиамидна колона и се елуира с етанол/вода (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50), като се получават пет фракции (A–E) . Фракция В (65 g) се фракционира на ODS колона; елуиране с етанол: вода (1:9) отделя съединение 1 (3 g). Фракция D (10.5 g) се фракционира на ODS колона; елуиране с етанол/вода (1:4) отделя съединение 2 (1 g).

ЯМР спектрите се записват на спектрометър Bruker Avance 600 в CD3OD с тетраметилсилан (TMS) като вътрешен стандарт. Масспектрите се извършват на BioTOF-Q масспектрометър.

3.4. Клетъчна култура

Клетъчните линии EA.hy926 бяха получени от American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Клетките се култивират в среда RPMI 1640, допълнена с 10% (v/v) фетален волски серум и 1% (v/v) пеницилин-стрептомицин във влажна среда с 5% CO2 при 37 градуса.

3.5. Клетъчна жизнеспособност

Клетъчната жизнеспособност беше оценена с помощта на MTT и CCK{{0}} анализи. Съединения 1 и 2 и техните агликони, кафеена киселина (3) и 3,4-дихидроксилфенилетанол (4) се разтварят в DMSO до крайна концентрация на DMSO < 0,1% (v/v) в културална среда.

Клетките EA.hy926 се посяват върху 96-плаки с ямки при 4 × 103 клетки/ямка. След инкубиране в продължение на 24 часа, клетките бяха третирани с 6.25–50 μM съединение 1, 2, 3 или 4 в продължение на 24 часа. Културалната среда се отстранява и клетките се промиват два пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Аликвотни части (10 μL) от основния разтвор на МТТ (5 mg·mL-1) се добавят към всяка ямка, съдържаща 100 μL среда, и се инкубират с клетки в продължение на 4 часа. След инкубацията, средата се отстранява и към всяка ямка се добавят 150 μL аликвотни части от DMSO, за да се разтворят кристалите формазан. Абсорбцията се измерва при 490 nm с помощта на четец на микроплаки (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Клетъчната жизнеспособност се изразява като процент на редукция на МТТ, присвоявайки 100% стойност на абсорбцията на контролните клетки. Всички експерименти бяха проведени три пъти и представени като средно ± стандартно отклонение (SD).

Анализът CCK-8 беше извършен в съответствие с литературата с леки модификации [23]. По-конкретно, клетките бяха третирани с 6.25–50 μM съединения 1, 2, 3 или 4 за 24 часа и се промиха два пъти с PBS преди добавянето на 10 μL CCK-8 разтвор и 100 μL културална среда. След инкубиране на микроплаката при 37 градуса за 2 часа, абсорбцията се измерва при 450 nm с помощта на четец за микроплаки. Клетъчната жизнеспособност се изразява като процент на жизнеспособни клетки спрямо контролните клетки (100%). Всички експерименти бяха проведени три пъти и изразени като средно ± SD.

3.6. Оценка на апоптоза чрез оцветяване Hoechst 33342

Апоптозните морфологични промени се наблюдават чрез оцветяване с Hoechst 33342. Накратко, EA.hy926 клетки се посяват върху 48-плаки с ямки (2 × 104 клетки/ямка) и се третират с 50 μM съединение 1, 2, 3 или 4 за 48 часа при 37 градуса, промиват се два пъти с PBS, и се фиксира с 4% (v/v) параформалдехид за 15 min при стайна температура. След двукратно изплакване с PBS, клетките се оцветяват с Hoechst 33342 (10 ug·mL-1) в продължение на 5 минути при стайна температура и се промиват два пъти с PBS. Оцветените с Hoechst ядра се визуализират с помощта на флуоресцентен микроскоп (Olympus, Токио, Япония).

3.7. Анализ на апоптоза чрез поточна цитометрия

Апоптозните клетки бяха открити чрез анексин V-FITC/PI двойно оцветяване и анализ на поточна цитометрия. Накратко, след третиране с 50 цМ съединение 1, 2, 3 или 4 в продължение на 48 часа, клетките бяха събрани и ресуспендирани в PBS при 1 × 105 клетки · mL-1. След центрофугиране при 500 × g за 5 минути при 25 градуса бяха добавени 195 μL от анексин V-FITC свързващ буфер и 5 μL от анексин V-FITC. След внимателно вортекс смесване, сместа се инкубира в продължение на 10 минути при стайна температура на тъмно. След центрофугиране при 500 × g за 5 минути при 25 градуса бяха добавени 190 μL FITC-конюгиран анексин V свързващ буфер и 10 μL PI. След леко вихрово смесване, пробите бяха анализирани с помощта на FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) в рамките на 30 минути.

3.8. Статистически анализ

Всички експериментални данни бяха изразени като средно ± SD. Значимостта на разликите между експерименталните проби и съответната контрола беше оценена чрез еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) с помощта на софтуера SPSS (версия 11.5). Статистическата значимост беше определена на p < 0.05.

4. Изводи

Нашите резултати предполагат, че надценяването на броя на жизнеспособните клетки, наблюдавани при МТТ анализа, може да маскира цитотоксичността на определени съединения. Ето защо, по време на процесите на скрининг на лекарства, препоръчваме използването на различни методи за определяне на ефекта на конкретното съединение върху клетъчната жизнеспособност (като CCK-8 и 3 H-TdR анализи), за да се избегне генерирането на подвеждащи резултати.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА НАСЪРЧАВАНЕ НА СЕКРЕЦИЯТА НА ТЕСТОСТЕРОН PHGS75% ECH 30% ACT 12%