Изолиране на екстракт от мек коралов симбиотичен микроорганизъм Salinispora Arenicola, упражняващ цитопротективен и антиейдж ефект, част 1

Резюме: Клетките са разработили силно интегрирана система, отговорна за стабилността на протеома, а именно протеостазната мрежа (PN). Тъй като загубата на протеостаза е отличителен белег на стареенето и свързаните с възрастта заболявания, активирането на PN модулите вероятно може да удължи продължителността на здравето. Тук представяме данни за биоактивността на екстракт (SA223-S2BM), пречистен от щама Salinispora arenicola TM223-S2, който е изолиран от мекия корал Scleronefthya lewinsohni; този корал е събран на дълбочина 65 m от мезофотичната екосистема на Червено море EAPC (южен Ейлат, Израел). Третирането на човешки клетки с SA223-S2BM-активирани протеостатични модули намалява оксидативното натоварване и осигурява защита срещу оксидативен и генотоксичен стрес. Освен това, SA223-S2BM засилва активността на протеазомите и лизозомните катепсини при мухи Drosophila и проявява защитни ефекти върху кожата, доказани от ефективното инхибиране на свързаните със стареенето на кожата ензими, еластаза и тирозиназа. Предполагаме, че екстрактът от SA223-S2BM представлява вероятно обещаващ източник за приоритизиране на молекули със свойства против стареене.

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време, ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да улавя свободните радикали DPPH и има способността да улавя реактивни кислородни видове и да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колаген, а също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на аниона от свободните радикали на тимина.

Щракнете върху цистанчес билка

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Ключови думи: стареене; антиоксидантни реакции; морски микроорганизъм; протеостазна мрежа; Salinispora arenicola

1. Въведение

Стареенето се характеризира с зависим от времето спад на функционалния капацитет и устойчивост на стрес, както и с повишени нива на смъртност и заболеваемост [1]. Стареенето не е просто пасивен процес, тъй като се регулира от еволюционно запазени молекулярни и клетъчни сигнални събития [2,3]. Организмите са постоянно изправени пред предизвикателства както от вътрешни (свързани с метаболизма), така и от външни (произхождащи от диета или околната среда) стресори, които могат да доведат до постепенно натрупване на увредени биомолекули и в крайна сметка да компрометират клетъчната хомеостаза [4,5]. Протеините участват във всички основни клетъчни функции и следователно протеомната хомеостаза (протеостаза) е критична за клетъчната функционалност и оцеляване [6].

Целостта на протеома се поддържа от протеостазната мрежа (PN), която се простира до всички субклетъчни отделения и се регулира на клетъчно, тъканно и организмово ниво, за да се осигури здраве и дълголетие на организма [7]. Поддържането на протеостаза изисква клетките да координират и регулират функциите на синтез, сгъване, сортиране, транспорт и разграждане на всички полипептиди [8,9]. Тези клетъчни функции се осъществяват предимно от три основни взаимосвързани клона на PN, а именно мрежата от молекулярни шаперони, протеолитични пътища убиквитин-протеазома-(UPP) и автофагия-лизозома-(ALP) [10,11].

Молекулярните шаперони осигуряват правилното сгъване на протеина и конформационната поддръжка и те също си сътрудничат с пътищата на разграждане [12]. UPP е основното място за контрол на качеството на протеиновия синтез и участва в рециклирането на нормални краткотрайни протеини и на непоправими неправилно нагънати или разгънати протеини [6], докато ALP е отговорен за разпознаването и отстраняването на протеинови агрегати и увредени органели [13]. Загубата на протеостаза е отличителен белег на стареенето [14], както и основен рисков фактор за много свързани с възрастта човешки патологии, включително рак, диабет, сърдечно-съдови заболявания и невродегенеративни заболявания [15]. Следователно активирането на PN се счита за обещаващ подход за забавяне на началото и/или прогресията на стареенето и свързаните с възрастта заболявания [16–18].

Стареенето на кожата се характеризира със структурни и функционални промени в (наред с други) компоненти на извънклетъчния матрикс, като еластин [19]. Еластазата е ензимът, участващ в разграждането на еластина, което води до развитие на бръчки и загуба на еластичност [20]. Тирозиназата е ключов ензим в синтеза на меланин, който е отговорен за пигментацията на (наред с други) човешка кожа [21,22]. Въпреки това, прекомерното активиране на тирозиназата е свързано с няколко кожни заболявания, като хиперпигментация и меланом [22,23]. Следователно, инхибирането на еластазата и тирозиназата представлява важен подход срещу стареенето на кожата.

Естествените продукти (НП) имат дълга история - добре документирана, преди раждането на съвременната наука и технологии, в различни култури - за лечение на човешки заболявания [24-26]. По този начин NPs могат да служат като силно обогатени изходни материали и скелета за разработване на лекарства; наистина, над половината от всички лекарства са или NPs, получени от NPs, или вдъхновени от NPs [27-29]. Морският свят, който съдържа най-голямо биоразнообразие, е до голяма степен неизследван и следователно може да бъде най-големият ресурс за откриване на нови NP [30]. Сред организмите, които живеят в морска среда, меките корали са обещаващи доставчици на биоактивни NPs и е известно, че са домакини на много различни микроорганизми [31,32].

Предвид тези факти, в момента извършваме обширен високопроизводителен скрининг на NP, за да идентифицираме биоактивни молекули, които потенциално биха могли да забавят клетъчното стареене и/или in vivo стареенето. В изследването, представено тук, ние изследвахме метанолов екстракт, а именно SA223-S2BM, от Salinispora arenicola (S. arenicola) TM223-S2 щам чрез прилагане на in vitro анализи, както и базирани на клетки и in vivo бионасочени подходи. Щамът S. arenicola TM223-S2 е изолиран от мекия корал Scleronefthya lewinsohni (S. Levinson) (първоначално наречен Scleronephthya lewinsohni от Verseveldt и Benayahu, 1978), който е устойчиво получен от мезофотичната екосистема на Червено море EAPC ( южен Ейлат, Израел) на дълбочина 65 m. Метаноловият екстракт SA223-S2BM активира цитопротективни механизми както в човешките клетки, така и в мухите на Drosophila melanogaster (D. melanogaster) и упражнява in vitro защитни свойства за кожата. Следователно екстрактът от SA223-S2BM може да бъде източникът за вероятната идентификация на молекули с потенциални цитопротективни свойства и свойства против стареене.

2. Материали и методи

2.1. Произход и изолиране на екстракта SA223-S2BM

2.1.1. Колекция Корал

Мекият корал S. Levinson беше събран от ROV H800 (ECA Robotics), управляван от Sam Rothberg R/V от Междууниверситетския институт за морски науки в Ейлат (IUI). In situ, фотографията беше извършена от черно-бяла камера при слаба светлина VS300 (ECA Robotics) и 1CAM Alpha HD камера (SubC Imaging). Пробите са взети от ръката на ROV от мезофотичния риф на Ейлат, край терминала за петролен кей (29◦300 47.0900 N, 34◦350 56.7100 E), на 65 m, на 7 март 2017. Мястото за събиране се характеризира с умерен наклон със скалисти петна, заобиколени от пясъчно морско дъно. След събирането материалът веднага се замразява при -80 ◦C. Образец от ваучер беше запазен в 70 процента етанол за таксономична идентификация и депозиран в Музея по естествена история Steinhardt, Университета в Тел Авив (SMNHTAU_Co_37500).

2.1.2. Изолиране и идентифициране на щама

S. arenicola TM223-S2 се изолира от 1 ml проба от S. Levinson. Събраната проба от меки корали се смила в стерилна морска вода и се нагрява при 50 ◦C в продължение на 1 час. Получената суспензия се разрежда серийно, поставя се върху агарна среда за селективна изолация и се инкубира при 28 °C в продължение на най-малко 6 седмици. Щамът Salinispora беше изолиран и колонията беше пречистена върху агар с морски бульон (MBA) (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) и консервирана при -20 ◦C в 10% разтвор на глицерол.

2.1.3. Изследване на филогенеза

Филогенният анализ беше извършен с помощта на фрагмент от 16S rRNA гена, амплифициран от геномната ДНК на S. arenicola TM223-S2. Геномната ДНК на щама TM223-S2 беше изолирана с помощта на DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen), съгласно инструкциите на производителя. 16S рибозомният РНК фрагмент се амплифицира чрез PCR, използвайки праймери 16S F 27, AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG (Tm: 56.3 ◦C) и 16S R 1492, TAC GG(CT) TAC CTT GTT ACG ACT T ( Tm: 57,5 ​​◦C). Ампликоните бяха секвенирани чрез секвениране на Sanger и последователностите бяха подравнени спрямо 16S рибозомната РНК база данни на проекта Targeted Loci на NCBI, използвайки MUSCLE. Подравняването беше проверено ръчно и празнините бяха отстранени. Еволюционната история е изведена чрез използване на метода на максималната вероятност и модела на Тамура-Ней [33] с 1000 повторения. Първоначалното дърво за евристичното търсене беше получено автоматично чрез прилагане на алгоритми за присъединяване на съседи и BioNJ към матрица от разстояния по двойки, оценени с помощта на подхода на максималната композитна вероятност (MCL) и след това избиране на топологията с по-висока стойност на логаритмичната вероятност. Еволюционните анализи бяха проведени в MEGA X версия 10.1.7 [34].

2.1.4. Условия за отглеждане

Спорите на S. arenicola TM223-S2 бяха консервирани при -20 ◦C в 10 процента глицерол. Преди култивиране, щамът се съживява за 15 дни върху 15 cm петриево блюдо, съдържащо MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, САЩ), допълнено с 2 процента агар (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA , САЩ). Стерилна морска вода (4 × 10 mL) се излива върху повърхността на плочата и спорите и мицелът се възстановяват от плочата чрез леко надраскване на повърхността със скалпел за генериране на инокулум. Ферментацията в течно състояние (LSF) се провежда в 2 L Ерленмайерова колба в продължение на 20 дни при 28 ◦C и 130 rpm разбъркване. Смола Amberlite XAD16 (30 g/L) (Amberlite XAD16HP N, Certis, Lenntech, Delfgauw, Холандия) беше добавена преди стерилизация, за да се позволи in situ улавяне на микробните метаболити. Пет милилитра от инокулума се използват за инокулиране на 1 L върху MB, съдържащ 30 g смола Amberlite XAD16. Ферментацията в агарно състояние, съчетана с екстракция в твърда фаза (SPE) [35], се извършва върху MB среда (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, САЩ), допълнена с 2 процента агар (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, САЩ) в продължение на 20 дни при 28 ◦C. Стерилизиран Amberlite XAD16 (35 g), смесен с 35 mL инокулум, се разпределя хомогенно върху повърхността на 1 MB агар Петри плака (25 cm × 25 cm).

За LSF, смолата XAD16 се отделя от бульонната култура чрез филтруване и се промива с вода преди да се елуира с етилацетат (100 mL) и след това с метанол (100 mL). Елуатите се концентрират до сухо във вакуум и се разтварят в DMSO при концентрация 10 mg/mL. Полученият екстракт, SA223-S2LAE (екстрахиран с етилацетат), се използва за биологични оценки.

За SPE, смолата XAD16 се възстановява чрез внимателно надраскване на повърхността на агаровата плоча. Възстановената смола се промива с вода, за да се елиминира биомасата, преди да се елуира с етилацетат (100 mL) и след това с метанол (100 mL). Елуатите се концентрират до сухо във вакуум и се разтварят в DMSO при концентрация 10 mg/mL. Получените екстракти, SA223-S2BAE (екстрахиран с етилацетат) и SA223-S2BM (екстрахиран с метанол), бяха използвани за биологични оценки.

2.2. Инхибиторна активност на еластаза и тирозиназа

Инхибиторната активност на еластазата на приоритетния екстракт беше оценена с помощта на еластаза от свински панкреас (PPE) тип IV (Merck KGaA, Дармщат, Германия) и субстрата N-сукцинил-Ala-Ala-Ala-p-нитроанилид (Merck KGaA, Дармщат, Германия), както е описано по-горе [36]. Капацитетът на екстракта да инхибира каталитичното действие на тирозиназата при окисляването на L-DOPA до допахром беше определен, както беше съобщено по-рано [37].

2.3. Клетъчни линии, условия на клетъчна култура и анализ на клетъчната жизнеспособност

Човешки фибробласти на препуциума (BJ клетки) бяха закупени от Американската колекция за тъканни култури (ATCC), докато човешки обезсмъртени кератиноцити (HaCaT клетки) бяха получени от Elabscience, Inc. И двете клетъчни линии бяха култивирани в Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Масачузетс, САЩ), допълнени с 10 процента (v/v) фетален говежди серум (FBS) и 1 процент (v/v) несъществени аминокиселини и се поддържат в условия на 5 процента CO2, 95 процента влажност и 37 ◦C. Във всички приложени експериментални процедури клетките бяха субкултивирани чрез използване на разтвор на трипсин/EDTA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Ефектът на екстракта SA223-S2BM върху клетъчната жизнеспособност беше оценен с помощта на МТТ анализ, както беше съобщено по-рано [38]. Клетъчното третиране с водороден пероксид (H2O2) и доксорубицин (DXR) се извършва, както е описано в легендите на фигурите; H2O2 и DXR бяха получени от Merck KGaA (Дармщат, Германия).

2.4. Drosophila линии и анализ на дълголетието

В това изследване използвахме щама Drosophila w1118, закупен от Bloomington Drosophila Stock Center (Блумингтън, IN, САЩ). Мухите се поддържат при 25 ◦C и 60 процента влажност при цикъл 12 часа светлина: 12 часа тъмнина. Във всички представени експерименти бяха анализирани само соматични тъкани (глава и гръден кош) на мухи, тъй като репродуктивните тъкани показват отчетлива регулация на протеостатичните механизми и скоростите на стареене в сравнение със соматичните тъкани [39].

Дълголетието на мухите се анализира, както е описано преди [40], като се използват женски и мъжки мухи (еднакъв брой за всеки пол), които се култивират във флакони, съдържащи (или не) изследвания екстракт. Мухите се прехвърлят във флакони с прясна храна на всеки два дни и смъртните случаи се отбелязват ежедневно. За кривите на преживяемост и статистическия анализ бяха използвани процедурата на Kaplan-Meier и log-rank (Mantel-Cox) тест; значимостта беше приета при p <0.05.

2.5. Измерване на реактивни кислородни видове (ROS)

Клетки или тъкани на мухи се инкубират с багрилото CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) при концентрация от 10 µM в PBS за 30 минути на тъмно (37 ◦C и 25 ◦C, съответно). След отстраняване на багрилото клетките или тъканите на мухите се инкубират с PBS за 15 минути на тъмно (37 ◦C и 25 ◦C, съответно), лизирани в лизисен буфер [150 mM NaCl, 1 процент (v/v) NP{{ 11}}, 50 mM Tris, рН 8,0] и след това се центрофугира при 14,000 g за 15 минути (4 ◦C). След това съдържанието на протеин беше измерено с теста на Брадфорд (Bio-Rad Laboratories, Inc., Херкулес, Калифорния, САЩ) и произведената флуоресценция беше измерена в многомодов четец на микроплаки Spark® (Tecan Trading AG, Männedorf, Швейцария) при възбуждане и емисионни дължини на вълната съответно 490 и 540 nm. Водородният пероксид (H2O2) се използва като положителна контрола, тъй като е широко известно, че причинява оксидативно увреждане/стрес [41].

2.6. Екстракция на РНК, синтез на cDNA и количествен PCR анализ в реално време (Q-RT-PCR)

Общата РНК се екстрахира от клетки с помощта на RNAiso plus (Takara Bio Inc., Shiga, Япония) и се определя количествено с BioSpec-nano спектрофотометър (Shimadzu Inc., Киото, Япония). Впоследствие 1 µg РНК се преобразува в сДНК с помощта на FastGene Scriptase II cDNA Kit (NIPPON Genetics, Düren, Германия). За извършване на количествени PCR анализи в реално време бяха използвани 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix (Solis BioDyne, Тарту, Естония) и PikoRealTM Real-Time PCR система (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, САЩ). Специфичните праймери за изследваните човешки гени са както е описано по-горе [42]. Генът HMBS се използва като нормализатор.

2.7. Имуноблотинг анализ и измерване на активността на протеазома и катепсини

Изследванията за имуноблотинг бяха проведени, както е описано по-горе [43]. Първични и конюгирани с хрян пероксидаза вторични антитела бяха приложени в продължение на 1 час при стайна температура и бяха разработени имуноблоти с помощта на подобрен хемилуминесцентен реагентен комплект (ClarityTM Western ECL Substrate, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Количественото определяне на имуноблотите се извършва чрез сканираща денситометрия и софтуер ImageJ [44].

Ензимните активности на протеазома и катепсини в клетки или тъкани на мухи бяха измерени на VersaFluor™ Fluorometer System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Херкулес, Калифорния, САЩ) с помощта на Suc-LLVY-AMC (подобна на химотрипсин активност, CT-L) и Z-FR-AMC флуоропептиди (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, САЩ), съответно, както е описано по-рано [42,45,46]. 6-бромоиндирубин-30 -оксим (6BIO) беше използван като положителна контрола, тъй като е известно, че активира UPP както в човешки клетки, така и в мухи Drosophila [42,47]; лекарството Rapamycin, се използва като положителна контрола за ALP и индукция на катепсини [48].

2.8. Използвани антитела

Първични антитела срещу 5 (sc-55009) протеазомна субединица, NQO1 (sc-16464), Beclin 1 (BECN1) (sc-11427), Clusterin (CLU) (sc{{7} }), HSP27 (sc-13132), HSP70 (sc-59570) и GAPDH (sc-25778), както и вторичните антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян, бяха закупени от Санта Круз Biotechnology, Inc. (Далас, Тексас, САЩ). Първичните антитела срещу 53BP1 (4937), фосфо-Histone H2A.XSer139 (H2A.X) (9718) и фосфор-p53Ser15 (9286) бяха получени от Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Антитялото срещу SQSTM1/p62 (BML-PW9860) е закупено от Enzo Life Science, Inc. (Farmingdale, NY, USA).

2.9. Статистически анализи

Експериментите бяха проведени поне в дубликати. За статистическите анализи е използван MS Excel. Статистическата значимост беше оценена с помощта на t-тест на Student (t-тест). Точките от данни съответстват на средната стойност на независимите експерименти, а лентите за грешка означават стандартното отклонение (SD); значимостта при p < 0.05 или p < 0,01 е обозначена в графиките съответно с една или две звездички.

3. Резултати

3.1. Идентифициране на актиномицета, свързан с мекия корал S. Levinson

Целевият микробен щам е изолиран от корала S. Levinson, който е мек корал, ендемичен за Червено море. Колониите на този корал обикновено се намират в дълбоки места, както в екосистемите на горния мезофотичен коралов риф (30–60 m), така и в екосистемите на долния мезофотичен коралов риф (60–105 m) [49]. Освен това, това е азооксантелатен мек корал, който получава енергийните си нужди чрез филтриране и следователно се намира в местообитания, изложени на силни водни течения.

От филогенетичния анализ, базиран на последователността на 16S rRNA, беше установено, че изолатът TM223-S2 принадлежи към рода Salinispora (Фигура 1).

Тъй като S. arenicola може да се разграничи от S. Pacifica и S. tropica въз основа на 16S rRNA последователност [50], ние нарекохме този изолат S. arenicola TM223-S2 с номер за достъп в Genbank MW446171. Щамът се култивира, както е докладвано в раздела за материали и методи и се екстрахира съответно с етил ацетат и метанол. Предварителното биологично изследване показа, че екстрактът от течната култура, SA223-S2BAE, и екстрактът от етил ацетат от твърдата култура, SA223-S2LAE, са лишени от всякаква значителна биологична активност (Фигура S1). Следователно в това изследване е използван само метаноловият екстракт от твърдата култура, свързана с екстракция в твърда фаза, SA223-S2BM.

3.2. Екстрактът SA223-S2BM не показва токсичност в човешките клетки и активира ключови компоненти на PN

Първо, ние изследвахме ефекта на SA223-S2BM върху жизнеспособността на BJ фибробластите на нормалната кожа и обезсмъртените от човека HaCaT кератиноцити чрез извършване на тест за токсичност на MTT. За тази цел клетките се инкубират в продължение на 24 часа с нарастващи концентрации на екстракта и, както е показано на фигура 2A1, A2, екстрактът не упражнява цитотоксичен ефект върху нито една от двете клетъчни линии, изследвани при концентрации до 10 µg/mL ; при по-високи концентрации (над 10 µg/mL), екстрактът намалява клетъчната жизнеспособност най-вече в HaCaT клетките.

След това проучихме ефекта на екстракта върху клетъчните пътища, които осигуряват протеомна стабилност на клетката. Ние наблюдавахме, че краткотрайното (24 часа) излагане на BJ фибробласти на изследвания екстракт значително индуцира експресията на PSMB7 протеазомния ген (при концентрация от 10 µg/mL), докато успоредно с това има тенденция да повишава експресията на PSMB6 ген при същата концентрация (Фигура 2B1). В допълнение, екстрактът индуцира експресията на 20S протеазомния ген, PSMB6, и на 19S протеазомния ген, RPN11 при концентрация от 1 µg/mL в HaCaT клетки (Фигура 2B2). Освен това, третирането на BJ фибробласти с екстракт в продължение на 24 часа доведе до лека индукция на нивата на експресия на 20S 5 протеазомната субединица при концентрация от 1 µg/mL (Фигура 2C). В подкрепа на нашите открития, експозицията на екстракта значително повишава подобната на химотрипсин протеазомна активност както във фибробластите на BJ, така и в кератиноцитите HaCaT след 24 часа инкубация (Фигура 2D1, D2); различните резултати от изследваните концентрации на екстракта сред BJ и HaCaT клетките могат да се отдадат на специфични за типа клетки ефекти.

Освен това анализите на експресията на Q-RT-PCR разкриха, че третирането на BJ фибробласти с екстракт в продължение на 24 часа индуцира нивата на експресия на ALP-свързани гени, наречени CTSB, CTSL, CTSD и SQSTM1, при концентрация от 10 µg/mL ( Фигура 3A1). Освен това наблюдавахме, че излагането на HaCaT клетки на екстракта за 24 часа доведе до индуциране на нивата на експресия на гени, участващи във функционалността на ALP (CTSB, CTSL, CTSD и SQSTM1) (Фигура 3A2).

В съответствие с тези констатации, ние отбелязахме повишаване на регулацията на свързаните с автофагията протеини BECN1 и SQSTM1/p62 след излагане на BJ фибробласти на екстракта при концентрация от 1 µg/mL (Фигура 3B1); повишени нива на експресия на протеините BECN1 и SQSTM1/p62 също се наблюдават в HaCaT кератиноцитите при двете изследвани концентрации (Фигура 3B2). В съответствие с това открихме, че екстрактът засилва ензимната активност на лизозомните катепсини както в BJ, така и в HaCaT клетки (Фигура 3C1, C2); отново, различните резултати от изследваните концентрации на екстракта сред BJ и HaCaT клетките могат да бъдат приписани на специфични за типа клетки ефекти.

Освен това, ние изследвахме ефекта на екстракта върху нивата на експресия на ключови молекулярни шаперони. По този начин имуноблотинг анализите разкриха, че екстрактът индуцира нивата на експресия на молекулярните шаперони CLU (и в двете изследвани концентрации) в BJ клетки (Фигура 3D1), както и на HSP27 (1 µg/mL) и HSP70 (и в двете изследвани концентрации) в HaCaT клетки (Фигура 3D2).

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】