Кората на Jabuticaba (Myrciaria Jaboticaba) като устойчив източник на антоцианини и елагитанини, доставяни от фосфолипидни везикули за облекчаване на оксидативния стрес в човешките кератиноцити, част 2

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

2.3. In vitro изследвания с кератиноцити

2.3.1. Биосъвместимост на везикулите

Изследването, проведено за оценка на физикохимичните свойства на трансферозомите, особено тези, обогатени с полимери, потвърди тяхната по-голяма стабилност и идеален размер за нанасяне върху кожата. Всяка важна разлика беше открита като функция на концентрациите на полимера (1 или 2 mg/mL). За да се оцени това, везикулите, модифицирани с най-висока концентрация на полимер (2 mg/mL), се използват за извършване на следващите изследвания. Тяхната биосъвместимост беше оценена с помощта на кератиноцити и тази на екстракта във водна дисперсия също беше оценена и използвана за сравнение. Кератиноцитите са избрани, тъй като те са най-представителните клетки на епидермиса и е използвана настройка слой по слой, тъй като при тяхната специална диференциация те образуват основната бариера на кожата, която регулира хидратацията на кожата и предотвратява проникването на екзогенни вещества в и през него. Кератиноцитите бяха третирани в продължение на 48 часа с екстракта в дисперсия или включени във везикулите при четири различни разреждания, след което беше измерена клетъчната жизнеспособност (Фигура 3). Жизнеспособността на клетките, инкубирани с екстракта в дисперсия, е ~88 процента (стр<0.05 versus="" the="" viability="" measured="" using="" extract="" loaded="" vesicles),="" indicating="" that="" the="" extract="" is="" not="" toxic.="" the="" viability="" of="" cells="" treated="" with="" extract-loaded="" transfersomes="" and="" hyaluronan-transfersomes="" at="" higher="" dilutions="" was~100%="" (p="">0.05 сред тази група). Третирането с HEcellulose-transfersomes и hyaluronan-transfersomes допълнително подобрява клетъчната жизнеспособност. Всички състави са силно биосъвместими, независимо от използвания полимер и разреждане. Наистина, клетъчната жизнеспособност е равна или по-висока от 100 процента, дори показвайки пролиферативен ефект, свързан с натоварването на везикули.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

2.3.2. Защитен ефект на екстракта, в дисперсия или зареден във везикули, срещу увреждане, предизвикано в кератиноцитите от водороден пероксид

Кератиноцитите се стресират с водороден прекис и след това се третират с екстракта или в дисперсия, или се зареждат в трансфероми. Клетъчната жизнеспособност се измерва на 4 h и това се използва за оценка на защитния ефект на съставите срещу оксидативен стрес (Фигура 4). Пробите се разреждат с клетъчната среда до достигане на две различни концентрации (4 и 0.4 ug/mL). Стресът от водороден пероксид причини висока клетъчна смъртност и намалена жизнеспособност с до ~ 50 процента (стр<0.05 versus="" the="" viability="" of="" cells="" treated="" with="" the="" extract="" in="" dispersion="" or="" loaded="" in="" vesicles)[35].="" hydrogen="" peroxide="" is="" considered="" one="" of="" the="" most="" dangerous="" oxidative="" molecules="" among="" the="" different="" reactive="" oxygen="" species,="" capable="" of="" promoting="" apoptosis="" and="" cell="" death.="" the="" treatment="" of="" stressed="" cells="" with="" the="" aqueous="" dispersion="" of="" the="" extract="" was="" capable="" of="" reducing="" the="" damaging="" effect="" of="" hydrogen="" peroxide="" as="" the="" viability="" increased="" up=""><0.05 versus="" the="" viability="" of="" cells="" treated="" with="" the="" extract="" loaded="" in="" hecelluose-transfersomes="" at="" a="" higher="" dilution="" and="" hyaluronan-transfersomes),="" although="" the="" complete="" restoration="" of="" normal="" conditions="" was="" not="" achieved="" (figure="" 4).="" treatment="" with="" the="" extract-loaded="" transfersomes="" protected="" the="" cell="" to="" the="" same="" extent="" as="" the="" extract="" in="" dispersion="" (~82%,p="">0.05 спрямо жизнеспособността на клетките, третирани с дисперсия). Лечението с най-добър резултат беше екстрактът, зареден с HEцелулозни трансферзоми (при по-високо разреждане) и хиалуронан-трансферзоми, които постигнаха жизнеспособност от ~104 процента (p<0.05 versus="" the="" values="" of="" other="" treatments).="" the="" restored="" normal="" conditions="" and="" even="" slightly="" promoted="" cell="" proliferation,="" probably="" due="" to="" the="" synergic="" effect="" of="" the="" extract="" and="" the="" polymer-immobilized="" vesicles.="" the="" vesicle="" behavior="" was="" not="" affected="" by="" the="" dilution="" levels="" of="" the="">

2.3.3. Ефекти при заздравяване на рани in vitro

In vitro тестът за надраскване беше извършен с монослой от кератиноцити, за да се провери способността на екстракта във водна дисперсия или включен във везикули да стимулира пролиферацията и миграцията на клетките. Празните везикули не са тествани, тъй като в предишно проучване не е установено подобрение в заздравяването на рани, когато са използвани празни хиалурозоми [37]. Затварянето на извършената рана се наблюдава в продължение на 48 часа (Фигура 5) и процентът на затваряне се изчислява чрез измерване на зоните на лезията (Фигура 6). Затварянето на раната на нетретираните клетки става много бавно - 13 процента на 24 часа, 28 процента на 36 часа и само 40 процента на 48 часа. Третирането с екстракт във водна дисперсия леко подобри процеса и доведе затварянето на 48 часа до 50 процента. Третирането с натоварените с екстракт везикули на 48-ия час постига 90 процента затваряне при използване на трансферзоми и HEцелулозни трансферзоми и около 100 процента затваряне при използване на хиалуронан-трансферзоми. Както виждаме, затварянето на раната е почти пълно, потвърждавайки възстановяващите свойства на заредените с екстракт хиалуронан-трансферзоми.

Общите ни резултати потвърдиха високата биосъвместимост на хиалуронан-трансферзомите, които също са най-ефективни при стимулиране на пролиферацията и миграцията на кожни клетки и противодействие на увреждането, причинено в кожата от оксидативния стрес.

3. Материали и методи 3.1. Материали

Lipoid S75 (състоящ се от ~70 процента соев фосфатидилхолин, 9 процента фосфатидилетаноламин и 3 процента лизо-фосфатидилхолин) е закупен от Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Германия). Натриев хиалуронат с ниско молекулно тегло (200-400 kDa) и полидисперсност от 1.4 Mw/Mn, е закупен от DSM Nutritional Products AG Branch Pentapharm (Швейцария). Tween 80, глицерол, DPPH радикал (2,2-дифенил-1-пикрилхидразил), железен хлорид хексахидрат, галова, хлорогенова и аскорбинова киселини, катехин, тетразолиева сол, 3-(4,{ {15}}диметилтиазол-2-vl)-2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT), кверцетин, неоспорин, фенолен реагент на Folin-Ciocalteu,2,4,6-трис( 2-пиридил)-S-триазин (TPTZ) и пврокатехол виолет са закупени от Sigma-Aldrich (Милано, Италия). Калиев хексацианоферат (ⅢI) е получен от Merck (Дармщат, Германия). Безводен натриев ацетат, меден сулфат пентахидрат и меден хлорид дихидрат са получени от VWR Chem-cals BDH⑧ (Франкфурт, Германия). Цианидин 3-О-глюкозид (по-голям или равен на 95 процента) и делфинидин 3-О-глюкозид (по-голям или равен на 95 процента) са закупени от Extrasynthese (Лион, Франция). Ледена оцетна киселина и фосфорна киселина (85 процента) са придобити от JTBaker (Mallinckrodt Baker Inc., Утрехт, Холандия). Всички реагенти и пластмаси за клетъчна култура са закупени от Life Technologies Europe (Монца, Италия).

3.2. Jabuticaba Pees: Екстракция, химическа характеристика и антиоксидантна активност

Плодове на жабутикаба (Myrciaria jabuticaba (Vell.)O.Berg)cv. Sabara беше събрана в зряла фаза на зреене в град Араукария, Парана, Бразилия (географски координати∶25 градуса 2924.7" S49 градуса 2637.8" W) през декември 2018 г. Плодовете бяха измити и дезинфекцирани (NaOCl при 100 mg/L/15 min), изплакнати и пулпирани ръчно. Корите се сушат при 35 градуса в продължение на 50 часа, смилат се до достигане на 42 Tyler mesh и се екстрахират в ускорен екстрактор с разтворител (ASE-350, Dionex, Сънивейл, Калифорния, САЩ), като се използва налягане от 100 бара (98.7 atm) в два цикъла на екстракция при 50 градуса. Като разтворител се използва вода, подкиселена с лимонена киселина (рН 2,10) и екстракциите се повтарят четири пъти. След това екстрактите се филтрират с помощта на качествена хартия и се сушат чрез замразяване под вакуум в продължение на 120 часа. След това се изчислява добивът на екстракция, изразен като процент, по отношение на суровината, използвана в процедурата.

Cistanche може да подобри имунитета

Общото фенолно съдържание (TPC, mg еквивалент на галова киселина на 100 g, mg GAE/100 g) общ кондензиран танин (TCT, mg катехинов еквивалент на 100 g, mg CE/100 g), общи флавоноиди (TF, mg CE /100 g) и общото съдържание на орто-дифеноли (TOD, mg еквивалент на хлорогенова киселина на 100 g, mg CAE/100 g) се измерват трикратно чрез използване на UV-Vis спектрофотометрия съгласно процедурите, напълно описани от do Carmo et al. [20].

Антоцианините (цианидин {{0}}O-глюкозид и делфинидин 3-O-глюкозид) бяха количествено определени чрез високоефективна течна хроматография (HPLC) с помощта на Agilent 110{{37} }(Agilent Technologies Inc., Еспоо, Финландия) устройство, оборудвано с детекция на диодна матрица (DAD). Разделянето се извършва с помощта на колона Gemini C18 （150 mm × 4,6 mm, 5 μm） с градиентно елуиране на ацетонитрил, подкислен с мравчена киселина при 5 процента. Общото съдържание на елагитанин се определя след киселинна хидролиза, съгласно Mattila и Kumpulainen [38], а галовата киселина се определя с помощта на колона Inertsil ODS-3 （150 mm × 4.0 mm , 3 μm）с градиентно елуиране на ацетонитрил в 50 mmol/L H3PO4 (рН 2,5). Анализите се извършват трикратно и резултатите се изразяват като mg/100 g. Свръхвисоко ефективна течна хроматография (UHPLC), комбинирана с масспектрометрия с висока разделителна способност (MS), беше приложена за характеризиране на основните елагитанини и антоцианини. Масспектрометър Acquity UPLC-Xevo G2 QTOF (Waters, Milford, MA, USA) беше оборудван с колона Waters Acquity BEH C18 (1,7 μm, 2,1 mm × 150 mm) и разделянето беше извършено с помощта на градиент на ацетонитрил в подкислена вода с 0,1 процента мравчена киселина, според Santos et al. [39]. Скоростта на потока е 0,55 mL/min, температурата на колонната пещ е 45 градуса и обемът на инжектиране е 1,0 μL. Интерфейсът на електроспрей (ESI) е отрицателен и положителен режим беше използван с капилярни напрежения от -1 kV и плюс 0,5 kV, съответно. Аргон беше използван като сблъсък газ. MS анализите бяха проведени чрез независим от данни придобиване (MSE) центроиден модел на данни в пълно сканиране m /z 50-1500 с време на сканиране от 0,2 s. Във функцията MSE прекурсорните йони на MS бяха фрагментирани с помощта на висока енергия на сблъсък, увеличена от 25 до 45 V.

Антиоксидантната активност на екстракта се анализира в три екземпляра с помощта на различни анализи: активност на улавяне на свободни радикали по отношение на DPPH радикала, антиоксидантна сила на редуциране на желязото (FRAP), антиоксидантен капацитет на медни йони (CUPRAC), редуцираща сила и Cu2 плюс хелатираща способност. Резултатите са изразени съответно като mg GAE/100 g (редуцираща сила), mg еквивалент на аскорбинова киселина на 100 g, mg AAE/100 g (DPPH, FRAP и CUPRAC) и mg EDTA еквиваленти/100 g (метално хелиране). . Всички използвани методи са подробно описани по-рано от do Carmo et al. и Fidelis et al. [9,20].

3.3. Приготвяне на везикули

Трансферзоми, обогатени с хидроксиетилцелулоза трансферзоми (HEcellulose-thansferomes) и трансферзоми, обогатени с натриев хиалуронат (хиалуронан-трансферзоми) бяха получени чрез диспергиране на фосфолипид (S75, 180 mg/mL), Tween 80 (20 mg/mL), екстракт (40 mg/mL) и полимер (хидроксиетилцелулоза или натриев хиалуронат 1 и 2 mg/mL), когато е подходящо, във вода и оставяйки смесите да се хидратират за няколко часа. След това дисперсиите бяха обработени с ултразвук （4 цикъла 2 на 5 при амплитуда от 15,0 μ）, изчаквайки 5 минути между всеки цикъл, за да се насърчи охлаждането и да се избегне прегряване на пробата. Високоефективен соникатор Soniprep 150 (MSE Crowley, Лондон, Обединеното кралство) беше използван за обработка с ултразвук на всички дисперсии, за да се получи хомогенна система с малък размер [15]. Тази процедура избягва загубата на компонентите, използвани за препарата, което води до образуването на ефективни везикули, способни да включат големи количества от екстракта.

3.4. Характеристика на везикулите

Средният диаметър и индексът на полидисперсност (безразмерна мярка за ширината на разпределението на размера) на везикулите бяха измерени чрез фотонна корелационна спектроскопия, използвайки Zetasizer Ultra (Malvern Instrument, UK). Същото оборудване беше използвано за измерване на зета потенциала на везикулите чрез измерване на електрофоретичната подвижност на частиците [40]. Пробите бяха подходящо разредени преди измерването, за да бъдат оптически чисти и да се избегне намаляването на разсеяната светлина, която може да бъде открита. За да се оцени количеството екстракт, действително включен във везикулите, дисперсиите се пречистват от невключения екстракт чрез диализа. Дисперсии на везикули (1 mL) се вкарват в поликарбонатни диализни тръби (Spectra/Pormembranes: 12-14 kDa MW cut-off, с пори 3 nm; Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA, USA) и се потапят в дестилирана вода (2 L) при 25 градуса за 2 часа при разбъркване. Водата се освежава след един час, като по този начин се използват 4 L вода за разтваряне на биоактивните молекули, които не са включени в 1 mL дисперсия на везикули (40 mg). Количеството екстракт в суспензиите на везикулите преди и след диализата се определя количествено чрез измерване на тяхната антиоксидантна активност с помощта на DPPH анализ. Ефективността на улавяне на екстракта във везикулите се изчислява като процентно съотношение между антиоксидантната активност на пробите преди и след процеса на пречистване [41-43].

3.5. Стабилност на везикулите при съхранение

Стабилността на везикулите в дисперсията беше оценена чрез наблюдение на средния им размер, индекса на полидисперсност и повърхностния заряд в продължение на 90 дни, докато дисперсиите се поддържаха при стайна температура (25±1 градуса).

3.6. Измерване на антиоксидантната активност на пробите с помощта на DPPH колориметричния тест. Антиоксидантната активност на екстракта от кора на жабутикаба, зареден във везикули, беше измерена като функция на способността му да извлича DPPH. Дисперсиите（10 μL） се разреждат（1∶100）с метанолов разтвор на DPPH (0,4 ug/mL). Разредените проби се съхраняват при стайна температура и на тъмно в продължение на 30 минути, след което абсорбцията на разтворите се измерва при 517 nm с помощта на UV спектрофотометър. Антиоксидантната активност на съставите се изчислява съгласно уравнение (1): (1) Процент на антиоксидантна активност =[(ABSDPPH-ABSample)/ABSpPPH]×100

3.7. Биосъвместимост и защитен ефект на пробите срещу оксидативен стрес в кератиноцитите

Обезсмъртени човешки кератиноцити (HaCaT) бяха отгледани като монослоеве при 37 градуса, с 100 процента влажност и 5 процента CO2, използвайки Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с високо съдържание на глюкоза, допълнена с фетален телешки серум, пеницилин и стрептомицин като растежна среда. За да се оцени биосъвместимостта на съставите, клетките се посяват в 96-плаки с ямки при плътност от 7,5 × 10 градуса клетки/ямка. След 24 часа клетките бяха третирани в продължение на 48 часа с екстракт от жабутикаба във водна дисперсия или заредени във везикули, правилно разредени с DMEM, за да се достигнат различни концентрации на екстракта (40, 4, 0,4 и 0,04 ug/mL). В края на инкубацията, MTT [3(4,5-диметил тиазолил-2)-2, 5-дифенилтетразолиев бромид]（100 μL, 0,5 mg/mL крайна концентрация ） се добавя към всяка ямка и след три часа образуваните формазанови кристали се разтварят с диметилсулфоксид. Абсорбцията на всяка ямка се измерва при 570 nm с помощта на четец на микроплаки (Synergy 4 Reader, BioTek Instruments, AHSI SpA, Bernareggio, Италия). Всички експерименти се повтарят поне три пъти, всеки път в три екземпляра. Резултатите са показани като процент на клетъчна жизнеспособност в сравнение с нетретирани контролни клетки (100 процента жизнеспособност).

Ин витро защитният ефект на съставите срещу увреждане, причинено от оксидативен стрес, също беше оценен. Клетките се посяват в {{0}}плаки с ямки при плътност от 7,5 × 10 клетки/ямка. След 24 часа инкубация клетките се стресират с водороден пероксид (30 процента разреден 1:40, 000 v/o с PBS) и се третират с екстракта във водна дисперсия или се зареждат във везикули и се разреждат, за да се достигнат две различни концентрации (4 и 0,4 ug/mL,). Клетките, стресирани само с водороден пероксид, се използват като отрицателна контрола, докато нетретираните клетки се използват като положителна контрола. След 4 часа инкубация, клетките се промиват със свежа среда и тяхната жизнеспособност се определя чрез МТТ анализ. Резултатите се отчитат като процент нетретирани клетки (100 процента жизнеспособност).

3.8. Свойства за заздравяване на рани in vitro

Способността на екстракта от кора на жабутикаба, зареден във везикули, да ремоделира кожните лезии и да насърчи тяхното заздравяване беше оценена чрез измерване на клетъчната експанзия върху лезия в клетъчен монослой. Клетките се култивират в 6-ямкови плаки до достигане на пълен и хомогенен монослой. Линейна рана се генерира с помощта на стерилен пластмасов накрайник на пипета. Разпръснатите фрагменти от клетки се отстраняват чрез внимателно промиване със свежа среда. Водна дисперсия на екстракт или натоварени с екстракт везикули се разреждат с клетъчна среда до 4 ug/mL екстракт и се използват за третиране на увредените клетъчни монослоеве. Наблюдават се клетъчните лезии и изображенията се заснемат на 24, 36 и 48 часа инкубация с помощта на оптичен микроскоп с 10 × обектив. Нетретираните клетки се използват като отрицателна контрола. Площните лезии в заснетите изображения бяха измерени от софтуера J на ​​Java за изображения (http://rsb.info.nih.gov, достъпен през април-юни 2021 г.). Затварянето на раните се изчислява с помощта на уравнение (2):

където ao е наранената зона непосредствено след одраскване, а a е наранената площ, измерена на 24, 36 и 48 h [44].

3.9. Статистически анализ

Резултатите са изразени като средно ± стандартно отклонение и значимостта е тествана при ниво на вероятност 0.05 (p). За размер, зета потенциал, вискозитет, натрупване на лекарство и цитотоксичност беше използван еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) за обосноваване на статистическите разлики между групите, последван от теста на Tukey, докато t-тестът на Student беше използван за сравнение между две проби с помощта на XLStatistic за Excel.

4. Изводи

Лиофилизираният екстракт от кора на жабутикаба е включен в трансфероми и обогатени с полимер (хидроксиетилцелулоза и натриев хиалуронат) трансферзоми с цел стабилизиране на екстракта и подобряване на неговата терапевтична ефикасност. Получените везикули бяха малки по размер и хомогенно диспергирани. Добавянето на двата полимера води само до образуването на малко по-големи везикули без разлики между използваните полимерни концентрации. Обогатените с полимер везикули изглеждат идеални за локално приложение и са способни да включват богатия на биоактивни вещества екстракт във високи количества. По-специално, комбинацията от фосфолипид, Tween 80 и натриев хиалуронат за получаване на хиалуронан-трансферзоми е избрана като най-добрата формула по отношение на стабилност и способност за взаимодействие с кератиноцитите, тъй като само тези везикули са в състояние ефективно да противодействат на увреждането индуцирани в клетките при използване на водороден пероксид и за насърчаване на заздравяването на рани в човешки кератиноцити. Като цяло нашите резултати предполагат, че хиалуронан-трансферзомите могат да представляват обещаваща система за лечение на кожни заболявания или кожни рани, свързани с оксидативен стрес. В допълнение, ние показваме за първи път използването на екстракт от кора на жабутикаба в дерматологична система за доставяне.

Авторски принос:DG, MLM, MM: концептуализация, формален анализ, обработка на данни, писане и преглед; IC, MA, JH: формален анализ и писане. Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране:Това изследване не получи външно финансиране. Изявление на институционалния съвет за преглед: Не е приложимо. Изявление за информирано съгласие: Не е приложимо.

Декларация за наличност на данни:Суровите данни са налични и могат да бъдат поискани директно от авторите.

Конфликти на интереси:Авторите декларират липса на конфликт на интереси.

Наличност на проба:Проби от екстракт от кора на жаботикаба са достъпни от авторите.

Тази статия е извлечена от Molecules 2021, 26, 6697. https://doi.org/10.3390/molecules26216697 https://www.mdpi.com/journal/molecules