Кемпферолът облекчава LD-митохондриалното увреждане чрез насърчаване на автофагията: Последици при болестта на Паркинсон, част 1

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:Новопоявилите се доказателства сочат, че неочакваното отлагане на липидни капчици (LD) и пероксидацията могат да ускорят стреса на органелите и играят решаваща роля в патогенезата на невродегенеративните заболявания (NDDs). В предишното ни проучване ние потвърдихме, че кемпферол (Ka), малка естествена флавоноидна молекула , показват невропротективни ефекти върху мишки с LPS-индуцирана болест на Паркинсон (PD). В допълнение, предишни проучвания показват, че автофагията играе важна роля в регулирането на клетъчното отлагане на LD. В настоящото проучване ние показахме, че Ka защитава срещу TH плюс загуба на неврони и поведенчески дефицити в MPTP/p-индуцирани PD мишки, придружени от намален липиден оксидативен стрес в substantia nigra pars compacta (SNpc). В култивираните невронални клетки Ka проявява относително безопасен диапазон на концентрация и значително потиснато натрупване на LD и клетъчна апоптоза, предизвикана от MPP plus. По-нататъшно проучване показва, че защитният ефект на Ка зависи от аутофагията, по-специално липофагията. Критично, Ka насърчава аутофагията, за да медиира разграждането на LD в лизозомите, което след това облекчава отлагането на липиди и пероксидацията и произтичащото от това увреждане на митохондриите, като впоследствие намалява невронната смърт. Освен това, AAV-shAtg5-медиираният нокдаун на Atg5 премахва невропротективните ефекти на Ka срещу липидното окисление при PD мишки. Тази работа демонстрира, че Ka предотвратява допаминергичната невронална дегенерация при PD чрез инхибиране на митохондриално увреждане, медиирано от липидна пероксидация, чрез насърчаване на автофагия на устните и осигурява потенциална нова терапевтична стратегия за PD и свързани с него NDD.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

1. Въведение

Болестта на Паркинсон (PD) е често срещано невродегенеративно заболяване (NDD), което се характеризира патологично с прогресивна загуба на допаминергични (DA) неврони в substantia nigra pars compacta (SNpc)[]. Въпреки че точната етиология и естественият ход на това заболяване все още не са напълно изяснени, множество процеси и дисфункции на системно ниво, включително митохондриални функции, допаминова хомеостаза, невровъзпаление и автофагия, са замесени в патогенезата на PD [1, 2]. Последните доклади разкриват, че липотоксичността, свързана с липидните капчици (LD), може да участва в патологията на PD [3,4]. LD са силно динамични органели, които излизат от мембраната на ендоплазмения ретикулум (ER) и обикновено служат като вътреклетъчни места за съхранение на неутрални липиди [5]. Наскоро беше показано, че LDs играят много по-широка роля от съхранението на мастни киселини (FA) и участват в много заболявания. Например миелоидните клетки, включително макрофаги, левкоцити и еозинофили, образуват LDs в отговор на възпаление и стрес, а LDs са места за производство и съхранение на възпалителни цитокини и допълнително участват в представянето на антигена и изчистването на патогена [6]. Важно е, че при атеросклерозата е доказано, че богатите на LD пенести клетки са вредни във всички стадии на заболяването [7].

Cistanche може да помогне за подобряване на имунитета

Въпреки това, LDs не са широко проучени в централната нервна система (ЦНС), като малко статии съобщават за хистологично присъствие на LDs в човешката мозъчна тъкан [8,9]. Дори и така, LD могат да имат важни функции в мозъка, тъй като последните проучвания потвърждават, че агрегираните LD в глията ускоряват невродегенерацията в модел на Drosophila [10]. Наскоро беше съобщено, че при мишки масленочервени О-позитивни натоварени с липиди клетки, включително неврони, глиален фибриларен киселинен протеин (GFAP) плюс астроцити и йонизирана калций-свързваща адапторна молекула -1 (IBA-1 ) микроглия присъстват в много области на мозъка и е доказано, че участват в процесите, свързани с възрастта [11]. Нашата предишна работа също демонстрира повишено натрупване на LD в мозъка в модел на PD мишка [12]. Взети заедно, тези проучвания предполагат, че LDs могат да бъдат включени в патогенезата на PD, както и други NDDs.

Обикновено вътреклетъчните LD се разграждат в лизозомите и доставят FA на митохондриите за тяхната консумация като алтернативен източник на енергия по време на периоди на изчерпване на хранителните вещества [13]. Въпреки това, невроните имат нисък капацитет за потребление на митохондриална FA за производство на енергия [14]. Тази характеристика прави невроните особено чувствителни към натрупване и пероксидация на LD. Освен това, натрупването на LDs повишава скоростта на окисляване на FA и налага постоянен натиск върху митохондриалната верига за транспортиране на електрони, което увеличава производството на реактивни кислородни видове (ROS) от комплексите на транспортната верига на електрони I и II [15] за усилване на оксидативния стрес. Липидното претоварване също води до производство на ROS от екстрамитохондриални източници като никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидази и други окислителни ензими. В комбинация с намалената експресия на антиоксидантни ензими и ниския капацитет за консумация на FA в невроните, натрупването на LD медиира оксидативния стрес и може допълнително да доведе до митохондриално увреждане, лизозомна дисфункция, дефектна аутофагия и активиране на възпалителни реакции [16,17]. Освен ако натрупаните LDs не могат да бъдат инхибирани или отстранени, силно активните неврони претърпяват патофизиология, което води до невродегенерация [17]. Доказателствата показват, че лизозомно-медиираният катаболен процес, наречен аутофагия, играе ключова роля в поддържането на клетъчната LD хомеостаза в множество тъкани [17,18]. В детайли, LDs могат да бъдат селективно изолирани в автофагозоми и доставени до лизозоми за разграждане от лизозомни киселинни липази, процес, специално известен като липофагия [19]. Следователно, насочването към LD и техния път на автофагично отстраняване може да представлява нов подход за управление на невродегенерацията.

Изследването на естествени продукти и диетични агенти като източници за потенциални лечения и стратегии за NDD придоби огромен интерес през последните години [20]. Кемпферол (Ka) е естествена полифенолна малка молекула, която може да се намери в редица китайски лечебни билки и хранителни източници [21]. Съобщава се, че Ka упражнява антибактериални, против стареене и имуномодулиращи ефекти, както и антиоксидантни и невропротективни дейности [20,22,23]. По-рано се съобщава, че Ka инхибира възпалението в BV2 микроглиални клетки in vitro [24] и повишава резистентността на DA невроните към невровъзпаление in vivo [25]. Въпреки това, ефектът на Ka върху LDs при PD все още не е изследван.

Като се има предвид значението на LDs и интимната връзка между LDs, митохондриите и аутофагията [16], които всички участват в PD, ние предполагаме, че Ka инхибира LD пероксидацията и предотвратява DA невродегенерацията при PD. В настоящото изследване ние демонстрирахме, че Ka значително защитава срещу невродегенерация в миши PD модел чрез инхибиране на натрупването на LD. По-нататъшно проучване разкрива, че Ka предизвиква аутофагия и намалява натрупването на окислени LD, за да облекчи митохондриалната дисфункция и производството на митохондриална ROS (mtROS), като по този начин предотвратява невроналната апоптотична смърт. Констатациите, получени в това проучване, могат да помогнат за насочване на клинични решения относно употребата на естествената молекула Ka при NDDs като PD.

2. Материали и методи

2.1. Опитни животни

C57BL/6J мишки (мъжки, 4-месечни) са получени от Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing). Мишките се поддържат и отглеждат в Центъра за животински ресурси на Факултета по медицина, Медицинския университет в Нанкин и в съоръжението за животни в болницата Нанкин Drum Tower. Мишките имат свободен достъп до храна и вода в стая с околна температура от 22 градуса ± 2 градуса и цикъл светлина/тъмнина от 12:12 часа. Всички процедури с животни бяха извършени в строго съответствие с насоките на Ръководството на Националните здравни институти за грижа и използване на лабораторни животни.

2.2. Реактиви

MPTP (M0896),3-MA (M9281), penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol(HPLC>99.0 процента,96,353) за in vitro експерименти е получен от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) са закупени от Thermo Fisher Scientific. За експерименти с животни Ka се разтваря в разтвор от 10 процента DMSO в 16 процента SBE- -CD в стерилен физиологичен разтвор. За клетъчни експерименти, Ka се приготвя в DMSO (Sigma-Aldrich) и PBS (крайната концентрация на DMSO е 0.01 процента), рН 7.4.

2.3. Индуциране и лечение на метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрахидропиридин (MPTP)-индуциран миши модел на PD

За да се оценят ефектите на Ka в PD модела на MPTP/p-токсичност, мишки (мъжки, на възраст 4-5 месеца) бяха разделени на случаен принцип в група, третирана с физиологичен разтвор, група, третирана с MPTP, MPTP плюс Ka-третирана група и група, лекувана само с Ka. В групата, третирана с MPTP, мишките получават хронично приложение на MPTP с протокол, подобен на описания по-рано [26]: MPTP се разтваря във физиологичен разтвор и се инжектира подкожно при 25 mg/kg, последвано от 250 mg/kg пробенецид (разтворен в диметилсулфоксид) интраперитонеално (ip) инжектиране на интервали от 1 час на всеки 3,5 дни за период от 5 седмици. Контролните мишки получиха инжекция с физиологичен разтвор и пробенецид. В групата, лекувана с MPTP плюс Ka, мишките получават Ka (50 mg/kg, единична инжекция/ден по време на експерименти, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Китай) интраперитонеално (.p.) дневно 3 дни преди лечението с MPTP и през 5-те Седмици на инжектиране на MPTP. Една седмица след последната MPTP инжекция, мишките бяха подложени на поведенчески тестове, заслепени за групи. След това всички мишки бяха анестезирани с 40 mg/kg натриев пентобарбитал и умъртвени за откриване на мозъчни протеини и имунохистохимия или qPCR анализ.

2.4. In vivo стереотаксична хирургия и експериментални лечения

Стереотаксичната хирургия под анестезия с натриев пентобарбитал (40 mg/kg, ip) се извършва, както е описано [25]. Миши Atg5 и контролна shRNA бяха трансфектирани с опаковъчни вектори (AAV-U6-CMV-shR-NA-EGFP), за да се генерира AAV. За микроинжектиране, анестезирани мишки се поставят в стереотаксичен апарат. Те бяха инжектирани с 1μLAAV чрез стъклен електрод, насочен към DG(AP:-0.3 mm; ML:±0.13 mm; DV:-0.45 mm） със скорост от 0,25 μL/мин. След това иглата се задържа за допълнителни 2- минути 2 седмици след микроинжектирането на вируса, мишките се подлагат на МРТР-индуцирано PD моделно провеждане и (или) Ka лечение.

Atg5 shRNA беше получена от Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. За мълчанието на Atg5, праймерите бяха показани в допълнителна таблица 1.

2.5. Поведенчески анализ

Една седмица след последното инжектиране на MPTP или физиологичен разтвор, тестът с въртяща се пръчка и полюсният тест бяха извършени, както е описано по-горе [27]. За теста с ротарод, мишките бяха аклиматизирани към ротарод в два опита (6 минути с ускорена скорост от 12-20 rpm) на ден в продължение на 2 последователни дни преди началото на експеримента. След това мишките бяха тествани при 20 rpm за 300 s за други 3 последователни дни. Закъснението до падане беше регистрирано с помощта на Rotarod Analysis System (Jiliang, Шанхай, Китай). За теста с стълб, мишките бяха поставени с главата нагоре върху върха на вертикален дървен стълб (с груба повърхност, височина 50 cm, диаметър 1 cm). Всички мишки бяха свикнали с апарата 2 дни преди тестването и след това бяха тествани три пъти на третия ден. Бяха записани общото време (T-общо, докато мишката достигне пода с четирите си лапи) и времето за завъртане (T-завъртане, за да се обърне напълно главата надолу на мишката). Експериментът беше заслепен за групи мишки за всяко поведенческо тестване и тестът беше извършен три пъти.

2.6. Събиране на мозъчни проби

След окончателните поведенчески тестове, мишките бяха анестезирани с натриев пентобарбитал (40 mg/kg, ip). За qPCR, Western blotting и високоефективна течна хроматография (HPLC) анализ, целите мозъци бяха бързо извлечени от животните, след това средният мозък и тъканите на стриатума бяха бързо дисектирани, предварително замразени с течен азот. Всички проби се съхраняват при -80 градуса до анализа.

За имунохистохимичен анализ мишките се перфузират транскардиално с 4% параформалдехид (PFA). Мозъците бяха екстрахирани, постфиксирани, дехидратирани, вградени в OCT (Tissue-Tek) и серийни срезове на мозъците бяха криосекционирани (30 um на срез) през всеки цял стратум и среден мозък с помощта на замразяващ микротом (Leica CM1950, Nussloch, Германия ). Всички срезове бяха събрани в шест отделни серии и срезовете на мозъка бяха съхранени в 50 процента глицерин и замразени при -20 степен до анализа.

За ТЕМ мишките се перфузират с 2,5 процента глутаралдехид и 2 процента параформалдехид, както е описано 【12】. Малка порция (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Имунохистохимичен анализ

Мозъчните срезове се промиват в PBS, последвано от 3 процента H2O2 за 10 min, след което се инкубират с 0.3 процента Triton X-100 в PBS, допълнен с 5 процента BSA за 1 час. След това слайдовете се инкубират с първичните антитела при 4 градуса за една нощ в PBS, съдържащ 5 процента BSA при 4 градуса за една нощ, след това се промиват и инкубират във вторични антитела за 1 час при стайна температура, последвано от инкубиране с диаминобензидин (DAB) или монтиране в DAPI (Life Technologies, Cat P36931) като имунофлуоресцентно оцветяване за 5 минути. За оцветяване по Nissl слайдовете се смесват в разтвор на крезил виолет (CV) (0,1 g крезил виолет, 99 ml H2O и 1% оцетна киселина 1 ml) за 30 минути при стайна температура, след което се дехидратират с алкохол и ксилен. Изображенията бяха наблюдавани и снимките бяха заснети под микроскоп Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Съединени щати). Общият брой на TH-позитивните и Nissl-позитивните неврони в SNpc беше получен серологично чрез използване на метода на оптичния фракционатор със софтуер MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7. Анализ с високоефективна течна хроматография (HPLC).

Пробите от стриатума на мишки се хомогенизират с {{0}}.1 М перхлорна киселина （1 mg тъкани в 100 μL перхлорна киселина） и 0,1 mM EDTA, третирани с

2.17. Поточна цитометрия

Клетките се усвояват и се изплакват с D-hank, след което се оцветяват с Анексин V-FITC （5 ul, разредени в 500 ul PBS）/PI（0,1 ul, разредени в 500 ul PBS) апоптозен комплект (CA1020, Solarbio, Пекин, Chian) съгласно протокола на производителя. След това апоптотичните клетки бяха анализирани с помощта на поточна цитометрия (guava easyCyteTM 8, Millipore, САЩ). Измерванията на митохондриалната ROS и потенциала на митохондриалната мембрана бяха извършени, както е публикувано 【12】. SH-SY5Y клетките бяха оцветени с MitoSOX （2,5 μM, Invitrogen, САЩ） или с JCl（10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, САЩ ） при 37 °C за 30 минути. След двукратно промиване с PBS, клетките се ресуспендират в студен PBS, съдържащ 1% FBS за поточен цитометричен анализ. Данните бяха анализирани със софтуер FCS Express (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, USA).

2.18. Тестове за дишане на морско конче

Митохондриалната респираторна функция в живи SH-SY5Y клетки се измерва с помощта на анализатора на екстрацелуларен поток Seahorse (XFe96) (Agi-lent, Санта Клара, САЩ) чрез промени в скоростта на консумация на кислород (OCR). Клетките SH-SY5Y, посяти при 3 × 103 клетки/ямка, бяха оставени да прилепнат към плаките с клетъчна култура Seahorse и да достигнат приблизително 80 процента сливане по време на експеримента. На следващия ден клетките се третират предварително с Ka и след това се излагат на MPP плюс за още 24 часа. OCR се открива при базални условия, последвано от последователно добавяне на 1 μM олигомицин, 1 μM FCCP, както и 1 μM ротенон и антимицин А.

2.19. Статистически анализ

Данните бяха представени като средно ± SEM. Значимостта на разликата се определя чрез t-тест на Student, двупосочен анализ на дисперсията или еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA), последван от post hoc теста на Tukey. Разликата се счита за значителна при P<>

3. Резултати

Резултат 1. Ka възстановява двигателната дисфункция и повишава нивата на допамин в стриатума на MPTP/p PD модел мишки

За да се изследва невропротективният ефект на патогенезата на Kaon PD, 4-месечни мъжки мишки C57BL/6 бяха инжектирани с невротоксина MPTP, за да се установи моделът на MPTP/p PD и бяха третирани с Ka (фиг. la). След индукция на модела, тестът с ротарод и полюсният тест бяха използвани за оценка на двигателните и поведенческите характеристики на мишките в различните групи. Както е показано, времето за изпълнение на ротарод е значително намалено при мишки, третирани с MPTP, и този ефект е предотвратен от Ka (фиг. 1b). Ka също така възстановява поведенческите дефицити, предизвикани от MPTP, както е показано от намаленията на времето за завъртане и общото време в полюсния тест (Фиг.lc и d), без да се засягат телесните тегла на мишките (Фиг.1e). Освен това, HPLC анализът показа, че нивото на допамин в стриатума е значително намалено при MPTP/p-провокирани мишки и това ниво е възстановено чрез лечение с Ka (фиг. 1f). Лечението с Ka също облекчава MPTP/p-индуцираното намаляване на нивата на дихидрокси-фенил оцетна киселина (DOPAC, метаболит на допамин) в стриатума (Фигура 1g). Тези резултати предполагат, че Ka възстановява двигателната дисфункция и повишава нивата на допамин в стриатума при MPTP-индуцирани PD мишки.

Резултат 2. Ka облекчава загубата на DA неврони в SNpc на MPTP/p PD модел мишки

След това, за по-нататъшна оценка на невропротективния ефект на Kaon MPTP/p-индуцирано DA невронно увреждане, ние изследвахме тирозин хидроксилаза (THD плюс неврони в миши SNpc чрез имунооцветяване. Както е показано на Фиг. 2a и b, MPTP/p индуцира значително намаление в броя на TH плюс невроните, което беше облекчено от лечението с Ka.Освен това, стереологичното преброяване на общите неврони в SNpc, както е определено от Nissl

Фигура 1. Лечението с Ka облекчава двигателната дисфункция и повишава нивата на допамин в стриатума на MPTP/p PD моделни мишки.

( а ) Схематична диаграма на експерименталния дизайн. (b) Времето на пръта беше измерено за теста с ротарод в три последователни дни. (cd) Времето, необходимо за обръщане (време на обръщане) и спускане по стълб (време на катерене) беше записано за теста на стълб. (e) Телесното тегло на мишката беше измерено в края на изследването, (fg) Допаминът (DA) и дихидрокси-фенилоцетната киселина (DOPAC) в стриатума бяха анализирани чрез високоефективна течна хроматография. Данните са изразени като средно ± SEM.n =9-10 за всяка група в (b, C, d); n=6-8 за всяка група in(f,g).ns, незначително,*P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">

оцветяване, потвърди, че загубата на THt клетки отразява клетъчната смърт, но не и понижаването на експресията на TH и показа, че лечението с Ka възстановява намаляването на броя на Nissl-позитивните неврони в SNpc на MPTP-третирани мишки от 43,3 процента на 25,4 процента ( Фиг. 2c и d). В допълнение, Ka значително подобрява MPTP-индуцираното намаляване на експресията на TH и DAT протеин, както е измерено чрез Western blotting (Фиг. 2e-g). Това доказателство потвърждава невропротективния ефект на Ka върху PD миши модел.

Резултат 3. Ka намалява натрупването на LD вакуоли и оксидативния стрес в SNpc на MPTP/p-третирани мишки

Все повече доказателства показват участието на LDs в NDDs [10], последователно нашата предишна работа идентифицира повишени LDs в SNpc на MPTP-индуцирани PD мишки [12]. LD могат лесно да бъдат идентифицирани и да показват кръгли структури с ниска плътност с хомогенно аморфно съдържание [28]. Обикновено LDs могат да бъдат разградени чрез автофагия, за да се избегне натрупването [29]. За да се изследва дали Ka може да регулира LDs в PD, натрупването на LDs беше анализирано чрез трансмисионна електронна микроскопия (TEM) в SNpc на контрола, MPTP/p и MPTP/p плюс Ka мишки. Както е показано в нашата предишна работа [12], броят и размерът на LDs са увеличени при MPTP/p мишки в сравнение с третираните с физиологичен разтвор контроли (Фиг.3a и b) и са значително намалени при Ka-третирани мишки (Фиг.3c- д). Освен това, при мишки, третирани с Ka, LDs се наблюдават по-често в близост до, затворени или разградени от автолизозоми, които се определят като електронно-плътни липофусцинови гранули. Допълнително хистологично оцветяване на TH плюс неврони с BODIPY, багрило, което специфично маркира неутралните липиди и обикновено се използва за откриване на LDs [30], показа, че както броят, така и размерът на BODIPY плюс LDs в SNpc са по-високи при PD мишки, отколкото при контролите и бяха значително намалени от третиране с Ka (фиг. 3f-h).

Ако LDs не могат да бъдат разградени своевременно, натрупаните LDs могат да претърпят пероксидация и да допринесат за митохондриален ROS-медииран стрес [4], което усилва невротоксичността и прогресията на заболяването. Следователно, ние допълнително изследвахме профилите на експресия на гени, свързани със защита срещу свободна FA токсичност (Gpx8), неутрализиране на окислителни видове, супероксидни радикали (Sod3) и водороден пероксид (Cat), и FA метаболизъм (Acsbg1 и Dbi), както се съобщава [31] , всички от които бяха поразително намалени в SNpc на MPTP-третирани мишки в сравнение с контролите, и тези ефекти бяха подобрени при Ka-третирани PD мишки (Фиг. 3i). По подобен начин MPTP/p също повишава нивата на експресия на иРНК

на NADPH оксидазни субединици като Nox1, Nox2 и Nox4 в SNpc на MPTP/p мишки, които бяха допълнително притъпени чрез третиране с Ka (Фигура 3j). Взети заедно, тези данни предполагат, че Ka облекчава MPTP/p-индуцираното натрупване на LD, пероксидацията и ROS-медиирания стрес.

Тази статия е извлечена от списъците със съдържание, налични на началната страница на списание ScienceDirect Redox Biology: www.elsevier.com/locate/redox