Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Щракнете тук за информация относно Част II (Въведение, материали и методи) на тази статия.

Почти едноклетъчно протеомно профилиране на проксималните тубули и гломерули на нормалния човешки бъбрек

Тара К. Сигдел¹, Пол Д. Пиеховски², Съдешна Рой¹, Джулиан Либерто¹, Джошуа Р. Хансен², Адам С. Суенсен², Руи Джао³, Ин Джу³, Приянка Рашми¹, Андрю Шрьодер¹, Изабела Дам¹, Свастика Сур¹, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian²* и Мини М. Сарвал¹* за Консорциума на проекта за прецизна медицина на бъбреците (KPMP).

¹Отдел по мултиорганна трансплантация, Катедра по хирургия, Калифорнийски университет, Сан Франциско, Сан Франциско, Калифорния, Съединени щати

²Тихоокеанска северозападна национална лаборатория, Отдел по биологични науки, Ричленд, Вашингтон, Съединени щати

³Лаборатория за молекулярни науки за околната среда, Тихоокеанска северозападна национална лаборатория, Ричленд, Вашингтон, Съединени щати

⁴Катедра по патология, Университет на Мичиган, Ан Арбър, Мичиган, САЩ

Ключови думи:гломерул, масова спектрометрия, едноклетъчен анализ, протеомика,бъбрек

Молекулярните оценки на ниво една клетка могат да ускорят биологичните изследвания чрез предоставяне на подробни оценки на клетъчната организация и хетерогенността на тъканите както при заболяване, така и при здраве. Човекътбъбрекима сложни многоклетъчни състояния с различна функционалност, голяма част от които вече могат да бъдат напълно използвани с последните технологични постижения в тъканната протеомика на почти едноклетъчно ниво. Обсъждаме основополагащите стъпки в първото приложение на този базиран на масова спектрометрия (MS) протеомичен метод за анализ на подраздели на нормалния човешкибъбрек, като част от проекта за прецизна медицина на бъбреците (KPMP). Използвайки ~30–40 лазерно уловени микродисектирани бъбречни клетки, ние идентифицирахме повече от 2500 човешки протеини, със специфичност къмпроксимален тубуларен(PT; n=25 протеини) и гломерулни (Glom; n=67 протеини) региони набъбреки техните уникални метаболитни функции. Това пилотно проучване предоставя пътната карта за прилагане на нашия работен поток за почти едноклетъчна протеомика за анализ на други бъбречни микрокомпартменти в по-голям мащаб, за да се разкрият смущенията на бъбречната субклетъчна функция в нормалния бъбрек, както и различни етиологии на остри и хроничнизаболяване на бъбреците.

Cistanche може да подобри бъбречната функция

Въведение

Последните постижения в молекулярното профилиране, по-специално транскрипционния анализ на едноклетъчно ниво, могат да разкрият редки клетъчни популации в хетерогенни клинични тъкани, което допринася за разбирането ни за биологията на бъбреците и неговите молекулярни процеси (1-7). Съществува незадоволена нужда от разработване на методи, които могат да предоставят изчерпателна биологична информация на нивата на РНК и ДНК и също така да позволят анализ на протеомна тъкан на една клетка.

Протеомните технологии, за разлика от геномиката, могат да предоставят функционална информация за клетъчните състояния и регулаторните мрежи (2). Технологично предизвикателство за протеомиката, базирана на масова спектроскопия (MS), е ограничението на изходния материал. За разлика от транскриптомиката, протеомиката не позволява молекулярно усилване. Този факт е довел до значителни усилия за подобряване на аналитичната чувствителност на базираната на МС протеомика, включително миниатюризация на технологията и по-висока ефективност при йонизационния източник на електроспрей (8, 9), така че аналитичната чувствителност вече е достатъчна за откриване на протеини в единичен бозайник клетки. Въпреки че имат висока аналитична чувствителност, протеомните приложения към малки обеми проби са въвели допълнителни предизвикателства, като неспецифична адсорбция на протеини и пептиди към повърхностите на реакционните епруветки, неефективна кинетика на смилане, необходимост от почистване и предизвикателства с доставката. Нашата група наскоро докладва за почти едноклетъчния протеомичен метод (nscProteomics) в HeLa клетки, който предоставя изключително иновативна и чувствителна технология за измерване на протеоми на проби със субнанограмни количества протеин от малък брой клетки (10). Този метод изисква силно персонализирано оборудване за обработка на проби и е трудно да се прехвърли в други изследователски лаборатории в сегашното му състояние на развитие. Обработка на човекбъбректъканите през този тръбопровод изискват голямо внимание към разработването на протоколи, за да се оптимизира запазването на тъканите и улавянето на клетките.

В това проучване ние се фокусирахме върху предоставянето на пътна карта за успешно измерване на протеомно запитване на различни подкомпартменти набъбрек, на почти едноклетъчно ниво, със следните резултати: (i) Оценка на оптимално събиране и съхранение на бъбречна тъкан за nscProteomics; (ii) Идентифициране на подходящия референтен стандарт за nscProteomics; (iii) Оптимизиране на дебелината на бъбречната тъкан за микродисекция с лазерно улавяне (LCM); (iv) Оптимизиране на параметрите на LCM; (v) Описание на метода nscProteomics, използващ базиран на LC-MS, напълно автоматизиран метод micro POTS (μPOTS; обработка в един съд за следи от проби) (11); (vi) Анализ на данни за nscProteomics.

За да постигнем гореспоменатите задачи, сме обработили 11 уникални човекабъбрекбиопсии и разработени протоколи и методологии за събиране, обработка и разпит на протеомната експресия на човешкибъбрекпроби от μPOTS. Когато се съчетае с високочувствителен LC-MS, ние показваме напълно автоматизиран метод μPOTS, който позволява възпроизводимост и осигурява количествени протеомични измервания на ~3,000 протеина от 10 до 100 лазерно уловени микродисектирани (LCM) бъбречни клетки, a ниво на покритие, постигнато преди това само за хиляди клетки (12–17). Това проучване ще помогне за молекулярно характеризиране на тъканната клетъчна хетерогенност и патология в бъбречни биопсии от пациенти с различни причини за остро и хронично бъбречно заболяване. Тази уникална технология има потенциала да разкрие протеомната хетерогенност и уникалните протеинови маркери в различнибъбрекподтипове и подструктури на заболяването, които ще корелират с патогенезата на заболяването, прогнозата и стратификацията на риска. Проучването е обобщено на фигура 1.

Фигура 1. Работният процес на почти едноклетъчна протеомика (nscProteomics) е оптимизиран за обработка на човешкибъбрекносни кърпи. Работният процес включва идентифициране на оптималнибъбрексъбиране и съхранение на тъкани, контрол на качеството за лазерно улавяне, микродисекция, установяване на метода на nscProteomics за бъбречни клетки.

Експериментални процедури

Уча дизайн

Схематичното представяне на протеомните изследвания, предприети върху 11 уникални човешки нормалибъбрецие показано на Фигура 2А. Бяха извършени общо 28 масспектрометрични (MS) серии за насипни и лазерно улавяни микро-дисектирани (LCM) nscProteomics върху сдвоени гломерулни (Glom) и проксимални извити тръбести (PT) секции. Тъкани от първите двебъбрецибяха запазени като FFPE и в среда с оптимална температура на рязане (OCT). Проблеми с бъбречните тъкани от още 9 бъбрека бяха обработени само в OCT (Фигура 2A).

Фигура 2. (A) Резюме на изследваните проби и анализи. (B) Диаграмата на QC за възпроизводимост на процеса, използвайки OCT тъкан. Разликите в спектралното броене между протеините за 2 отделни цикъла, използвайки OCT тъкан, бяха нанесени спрямо средното спектрално броене на протеини за 1257 протеина. В графиката синята линия изобразява средната разлика; червените и зелените линии изобразяват съответно 2 SD и 3 SD граници. 97,96 процента от протеините са в рамките на изчислената граница на възпроизводимост от 13,52, което показва висока степен на възпроизводимост. Вижда се също, че променливостта между цикъла на процеса, включващ OCT тъкан, е по-ниска от тази на процеса, включващ FFPE тъкан (изчислена граница на възпроизводимост: 24,43). (C) Сравнение на спектралните разпределения на 374 общи протеини в OCT и FFPE. По-голям брой протеини от OCT тъкан показват висок спектрален брой, докато по-голямо преобладаване на нисък спектрален брой се наблюдава за протеини от FFPE тъкан. (D) Сравнение на спектралните разпределения на 76 уникални протеина в FFPE и 244 уникални протеина в OCT. По-голямото преобладаване на протеини с нисък спектрален брой се наблюдава в OCT тъкан. Това може да означава, че OCT тъканната техника е по-добра за откриване на протеини с ниско съдържание в настоящия сценарий. Коефициентът на корелация между протеините, идентифицирани от 2 OCT замразени тъкани, беше 0.96 (P <>

Вземане на проби от бъбречна тъкан

Човекбъбречни тъканибяха събрани от общо 11 деидентифицирани частични нефректомии, получени от Университета на Калифорния в Сан Франциско (UCSF) и Университета на Мичиган (UM), с одобрен IRB, като част от проучване за осъществимост на пилотна технология в NIH Kidney Precision Medicine Проект (KPMP). Само здравата зона набъбреккакто е определено от обучен патолог е използван за тази цел. Пробите бяха анонимизирани с единственото предупреждение, че тъканите бяха събрани от възрастни. За да се оцени оптималният протокол за събиране на проби за технологията, първоначално ~100 mg тъкан от 2 бъбрека беше разделена по равно и или приготвена като фиксирани във формалин парафинови тъканни срезове (FFPE) или беше замразена в Tissue-Plus™ OCT съединение (Fisher Scientific). Един 5 μm и три 10 μm дебели последователни секции бяха изрязани от всеки OCT блок с крио-микротом и монтирани върху 1.0 полиетилен терефталат (PET) мембранни слайдове (Zeiss) за гломерулни ипроксимален тубулдисекция. Срезът с дебелина 5 μm беше оцветен с H&E за визуализация на основните хистологични структури. Останалите секции с дебелина 10 μm бяха оставени неоцветени. Всички слайдове се съхраняват при -80 градуса до дисекция.

Cistanche за подобряване на бъбречната дисфункция

Оценка на въздействието на изпращането и обработката на тъканите върху протеомния изход

За да се оцени въздействието на закъсненията върху протеомния анализ на OCT замразена тъкан,бъбрекtissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 часа пътуване и обработка във втория център и обратно. Масовата протеомика беше извършена на две 2 уникалнибъбреци(бъбрек #3, #4), осигурени от Университета на Мичиган и изпратени до 2 различни места (Университет на щата Охайо и UCSF) за MS анализ, използвайки същия протокол и параметри на MS и на двете места. След това резултатите от MS тестовете бяха сравнени между 2-те места.

Екстракция и утаяване на протеин

Това беше проведено както при OCT, така и при FFPE методите за подготовка на тъкани за избор на оптимален метод за тъканна протеомика. OCT тъканта се разделя на срезове с дебелина 10 μm с помощта на криомикротом. За да се избере минималното количество тъкан, необходимо за извличане на протеин за МС, три къдрици (секция, която се поставя в епруветка на Епендорф вместо да се разстила върху предметното стъкло) и 5 ​​къдрици от замразена тъкан бяха изрязани, размразени и прехвърлени в микроцентрофужни епруветки съдържащи 5 mm перли от неръждаема стомана (Qiagen), изложени на буфер за лизис на клетки от бозайници (включително Benzonase® нуклеазен и протеазен инхибиторен разтвор; Qiagen) и хомогенизирани в TissueLyser LT (Qiagen) при 50 r/s за 3 минути. Концентрацията на протеин се определя количествено (тест на Брадфорд; Thermo Scientific) и се съхранява при -20 градуса до употреба. Тъкан, съхранявана за<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">

Трипсин Храносмилане

Приблизително 150 ug от общия протеин (~15 процента от наличния вход) беше изложен на редуциращи агенти (200 mM DTT и 100 mM Tris-HCl) и алкилиращи реагенти (200 mM йодоацетамид и 100 mM Tris-HCl) и след това се разрежда с вода без РНКаза/ДНКаза, за да се намали концентрацията на урея до 0,6 М. Добавят се четири ug свински трипсин (Sigma) и пробата се усвоява при 37 градуса. Концентрацията на протеин се определя количествено (тест на Брадфорд; ThermoScientific) и 10 ug протеин се използва за MS.

MS за масова протеомика за оценка на оптималния метод за обработка на бъбречна тъкан

Триптичната пептидна смес се подкислява с мравчена киселина, почиства се с C18 Monospin колони и се анализира на Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific). MS/MS беше извършена с помощта на дисоциация с по-висока енергия на C-Trap (HCD). Масспектрите бяха анализирани с помощта на Byonic v2.14.27 (Protein Metrics), позволявайки допустими отклонения от 12 ppm маса. Разрешени са променливи посттранслационни модификации, включително окисление, метилиране, карбамилиране и фосфорилиране. Протеините бяха ограничени до тези, постигнали по-добри резултати от 1 процент фалшиви открития (FDR). Бяха направени сравнения на изобилие на протеини и данни от MS, за да се избере оптималният метод забъбрексъбиране на тъкан между FFPE и OCT.

Микродисекция с лазерно улавяне

Неоцветени срезове с дебелина 5, 10 и 20 μM, монтирани върху слайдове от PET, бяха поставени на сцената на системата за лазерна микродисекция Zeiss PALM MicroBeam (Zeiss), за да се тества оптималната дебелина на рязане. Гломерулна ипроксимален тубулобластите бяха избрани с помощта на инструмента със свободна ръка и дисекциите бяха извършени при 10X обектив. Бяха уловени секции с ~4,580 μm2 площ и 10 uM дебелина, които представляват ~40 гломерулни клетки въз основа на публикуваната по-рано формула за оценка на гломерулни клетки при здрав възрастенбъбрек(18). Запроксимален тубуларенклетки, ние уловихме ~2900 μm2 отпроксимален тубуларенклетки, което представлява ~36 клетки. Нарязаните срезове се катапултират в 200 μL непрозрачна адхезивна капачка (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) и се съхраняват при -80 градуса.

Почти едноклетъчна протеомика (nscProteomics)

За разтваряне на протеини, събрани в улавящи капачки с LCM, 10 μL капка от 0,1 процента DDM 50 mM Tris pH 8 беше добавена директно към капачката. Пробите се инкубират в продължение на 30 минути при 37 градуса в термомиксер Eppendorf ThermoTop, за да се намали изпарението, последвано от центрофугиране при 2, 000 × g за 1 минута, за да се прехвърли лизатът във флакона. Протеините се редуцират с 5 тМ дитиотреитол и се инкубират при 37 градуса за 30 минути. Алкилирането се провежда при 10 тМ йодоацетамид с 45 минути инкубиране на тъмно при 25 градуса. След това се добавя аликвотна част от 10 ng Ls-C, последвана от 3 часа инкубиране при 25 градуса. След това се добавя 10 ng аликвотна част от трипсин, последвано от смилане за една нощ при 25 градуса. Усвоените пептиди се смесват с 15 μL аликвотна част от 18 MΩ вода.

LC-MS платформа за ултра-малки проби

Пептидните проби (25 μL) бяха разделени с помощта на 60 cm колона, с 50 μm вътрешен диаметър и интегриран излъчвател (Нова цел). Колоните бяха опаковани вътрешно със среда Waters BEH с диаметър 1,7 μm. Произведен е 100-минутен градиент с помощта на нано помпа Dionex Ultimate 3000 RSLC (Thermo Scientific). Тази система беше свързана с QExactive Plus масспектрометър (Thermo Scientific). Масспектрите бяха събрани от 300 до 1800 m/z, като се използва най-добрият 12 метод за получаване, зависим от данни. MS1 спектрите бяха събрани с разделителна способност на масата от 35K и MS2 с 17.5K. Използва се 100 ms максимум IT за увеличаване на идентификациите от йони с ниско съдържание.

Извличане на протеомни данни

Всички необработени файлове бяха обработени с помощта на MaxQuant (версия 1.5.3.30) за откриване на функции, търсене в база данни и количествено определяне на протеин/пептид (19) след настройките, описани по-рано (10). Тандемните масспектри бяха търсени в базата данни UniProtKB/Swiss-Prot за хора (изтеглена на 29 декември 2018 г. и съдържаща 20 417 прегледани записи). MS proteomics данните за nscProteomics са депозирани в ProteomeXchange Consortium чрез PRIDE (20) партньорско хранилище с идентификатор на набор от данни PXD015058 и 10.6019/PXD015058.

Анализ на данни

MS данните са получени от серии, извършени в PNNL (nscProteomics) и Станфордския университет (bulk proteomics). За насипна протеомика. За избор на оптималния са използвани следните статистически методибъбрекметод за събиране на тъкан, или замразена в OCT, или обработена като FFPE, както е оценено чрез протеомика на количествена маса на тъкан, (i) Изчислен е добив на протеин/mg еквивалентна входяща тъкан; (ii) Възпроизводимостта на MS беше тествана върху MS изход от FFPE и OCT срезове от всеки от 2 бъбрека, приготвени от един и същ индивид, използвайки същия протокол, анализирани на същия MS инструмент, използвайки зададен протокол, с интервал от няколко дни (21). Беше използвана граница на възпроизводимост (22), за да се осигури приблизителна граница на разликите в измерването между последователни серии на един процес, както и оценка на прецизността за сравнение между процесите. Коефициентът на корелация, който осигурява степента на съгласие между последователни серии (с използване на една и съща тъкан), беше изчислен; (iii) Изобилие на протеини и разпределение на размера на пептидния фрагмент бяха изчислени, за да се оценят вариациите, произтичащи от разграждане на протеини, омрежване, дължащо се на формалин и т.н. Други аспекти на QC, включваха (iv) оценка на отклонението на процеса в репликите и времето чрез използване на общ пулбъбрексправка и (v) изчисляване на отклонението. Строгият количествен анализ и идентификация на уникални протеини използва данни само с протеини със спектрални стойности, по-големи или равни на 5 (23). Точният тест на Fisher беше използван за оценка на обогатяването на общи и уникални протеини, картографирани между два нормални човешки бъбрека (#1 и #2). Въз основа на горния анализ (вижте резултатите), OCT замразена тъкан беше избрана като метод за събиране за всички последващи анализи.

Следващата стъпка от фокуса на анализа на данните беше да се идентифицират, количествено определят и валидират набори от протеини, обогатени или специфични за ~10–100 клетки, получени от всяка от две избранибъбрекподкомпартменти—Glom и PT области, получени от същитебъбрек, насипно и LCM на OCT замразенибъбречна тъкан(n=9; бъбреци #3–11) и управляван от nscProteomics.

Беше възприет {{0}}етапен полуконсервативен подход за филтриране за справяне с проблеми с липсващи/непълни данни и G-тестът (24) беше използван за идентифициране дали данните липсват на случаен принцип (MAR) или Липса неслучайно (MNAR). Допълнителна оценка на надеждността на данните беше направена чрез строг подбор на протеини, наблюдавани при По-големи или равни на 50 процента от всички проби. T-тестът беше използван за идентифициране на значително обогатяване на протеини в glomming или PT и беше приложена корекция на множество тестове (Benjamini-Hochberg FDR) с праг на значимост от 0,1. За целите на анализа данните за относителния интензитет MS (log 2 трансформирани), получени от Glom, PT и насипни фракции от единиченбъбрексе считаха за сдвоени. Ние идентифицирахме протеини, обогатени с Glom (с ниски нива в PT/насипно) и уникални за Glom (липсващи в PT), както и протеини, обогатени с PT (с ниски нива в Glom/насипно) и уникални за PT (липсващи в Glom) . Анализът на обогатяване беше направен само върху данни без липсващи стойности във всяка група, за да се увеличи доверието. Корелацията между стойностите на изобилието на обикновените протеини беше използвана за оценка на степента на съгласие между обогатените протеини на субкомпартмента между отделни серии на един и същ експеримент. Ние също така извършихме кръстосано валидиране на значително обогатени протеини във всяко отделение чрез анализиране на тези сравнения от уникални комплекти проби между 2 различни цикъла, цикъл 1 и цикъл 2. Биологично валидиране за обогатени подкомпартменти (Glom и PT) набори от протеини беше извършено от запитване дали известни протеини, обогатени с субкомпартмент, могат да бъдат локализирани обратно в техните специфични региони в публични данни от Атласа на човешкия протеин (https://www.proteinatlas.org/) (25).

Cistanche за симптоми на бъбречна недостатъчност

Сравнение/интегриране на данни на Cross-Omics

За да се оцени съответствието на протеиновата експресия на ниво РНК, бяха използвани данни, генерирани от едноклетъчно РНК секвениране (scRNA Seq), извършено върху 10 естествени нефректомии, 9 от които се припокриваха сбъбрециизползвани в nscProteomics. За това беше използвана платформа 10x Genomics Chromium с v3 химия, използвайки метода, оптимизиран в лабораторията Sarwal като място за изследване на тъкани (TIS) на консорциума KPMP (подготвя се ръкопис, описващ подробно метода и резултатите). За този крос-омичен анализ използвахме транскриптомни данни от 45 411бъбрекклетки, разделени на девет основни типа клетки: подоцити, мезангиални клетки, гломерулен ендотел, строма/интерстициум, имунни клетки,проксимален тубул, дебел възходящ крайник на бримката на Хенле, дистален/свързващ тубул и събирателен канал. Анализът на данните от една клетка беше извършен с помощта на пакета Seurat R версия 2.3.4. По-задълбочен анализ на тези данни е в процес на разработка (26).

От: „Профилиране на почти едноклетъчна протеомика наПроксимален тубуларенигломерулна нормалния човекБъбрек“ от Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika Sur1, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian2* и Minnie M. Sarwal1* заБъбрекКонсорциум за проект за прецизна медицина (KPMP).

---ОРИГИНАЛНА статия ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ Предна част. Med., 17 септември 2020 г. |