Kv1.3 инхибирането отслабва невровъзпалението чрез прекъсване на микроглиалното калциево сигнализиране

АБСТРАКТ

През последните 5 години е доказано, че инхибиторите на калиевия канал KV1.3 намаляват невровъзпалението при модели на гризачи на исхемичен инсулт, болест на Алцхаймер, болест на Паркинсон и травматично мозъчно увреждане. На системно ниво тези полезни действия се медиират от намаляване на активирането на микроглията и потискане на производството на провъзпалителни цитокини и азотен оксид.

Въпреки това, молекулярните механизми за потискащото действие на блокерите на KV1.3 върху функциите на провъзпалителната микроглия не бяха известни, докато нашата група наскоро не демонстрира, че каналите KV1.3 не само регулират мембранния потенциал, както би се очаквало от волтаж-зависим калиев канал , но също така играят решаваща роля в позволяването на микроглията да устои на деполяризациите, произведени от сигнала за опасност ATP, като по този начин регулира притока на калций през P2X4 рецепторите. Тук преглеждаме ролята на KV1.3 в микроглиалното сигнализиране и показваме, че подобно на тяхната роля в Т клетките, KV1.3 каналите също регулират управлявания от магазините приток на калций в микроглия.

Калиевият канал KV1.3 е йонен канал, широко експресиран в имунните клетки, който играе важна роля в регулирането на потенциала на клетъчната мембрана, клетъчната миграция и функцията на имунните клетки. Последните изследвания показват, че съединения, които инхибират калиевия канал KV1.3, могат да помогнат за повишаване на имунитета на организма.

Регулирането на имунната система е важна част от поддържането на добро здраве. Въпреки това много заболявания, като автоимунни заболявания, рак и инфекциозни заболявания, водят до дисфункционална имунна система. Ето защо изследователите търсят начини за повишаване на имунитета. Последните проучвания показват, че инхибиторите на калиевия канал KV1.3 може да са обещаваща опция.

В имунните клетки калиевият канал KV1.3 регулира мембранния потенциал, като по този начин засяга клетъчната функция. Проучването установи, че чрез инхибиране на калиевия канал KV1.3 е възможно да се намали миграцията на Т клетките и допълнително да се предотврати атаката им да атакуват здрави клетки, като по този начин се предпазва имунната система от ненужно унищожаване.

В допълнение, някои експерименти са установили, че инхибирането на калиевия канал KV1.3 може също да насърчи други аспекти на имунната система. Например, проучванията показват, че чрез инхибиране на този канал, качеството и количеството на имунните клетки могат да бъдат подобрени, като по този начин се повишава устойчивостта на тялото към патогени и други външни заплахи. Следователно, инхибирането на калиевия канал KV1.3 може да бъде ефективен начин за повишаване на имунитета.

В заключение, настоящото проучване предполага, че инхибирането на калиевия канал KV1.3 може да бъде обещаващ подход за подобряване на функцията на имунната система и повишаване на цялостния имунитет на организма. Но въпреки че тези открития са обещаващи, необходими са допълнителни изследвания, за да се определи безопасността и осъществимостта на използването на този подход. От тази гледна точка трябва да подобрим имунитета си. Цистанче може значително да подобри имунитета. Месната пепел съдържа различни биологично активни съставки, като полизахариди, две гъби и Huang Li, които могат да стимулират имунната система. различни видове клетки, повишавайки тяхната имунна активност.

Кликнете върху ползите за здравето от цистанче

Въведение

Зависимият от напрежение калиев канал KV1.3 първоначално е описан в Т клетки [1] и впоследствие е преследван като цел за лечение на Т-клетъчно медиирани автоимунни заболявания като множествена склероза, ревматоиден артрит и псориазис [2–4]. Съвсем наскоро KV1.3 се очерта като привлекателна фармакологична цел за намаляване на така нареченото "невровъзпаление" чрез модулиране на активирането на микроглия. Както при миши, така и при плъхови модели на исхемичен инсулт, KV1.3 блокерите са показали от нас и други, че намаляват зоната на инфаркта и подобряват неврологичния дефицит [5,6]. При трансгенни миши модели на болестта на Алцхаймер KV1.3 блокадата намалява церебралния амилоиден товар, подобрява пластичността на хипокампалните неврони и подобрява поведенческите дефицити [7].

По подобен начин, в множество животински модели на болестта на Паркинсон, прилагането на малката молекула KV1.3 блокер PAP-1 инхибира дегенерацията на допаминергичните неврони и подобрява поведенческите резултати [8]. Инхибирането на KV1.3 или генетичната делеция допълнително е показало, че подобрява патологията на бялото вещество след травматично мозъчно увреждане [9], постоперативно когнитивен спад [10] и индуцирано от радиация мозъчно увреждане [11]. При всички тези животински модели на неврологично заболяване се наблюдава повишена експресия на KV1.3 върху свързана с патология микроглия и лечението с блокери на KV1.3 води до намалено активиране на микроглията и намалени нива на възпалителни цитокини в мозъците на животните.

Свързаната със заболяването повишена експресия на KV1.3 изглежда се пренася при хора, тъй като силна експресия на KV 1.3 е открита и в следсмъртни човешки мозъци върху микроглия в инфарктни области след исхемичен инсулт [5,12], върху микроглия, заобикаляща амилоидните плаки при болестта на Алцхаймер [ 7,13] и върху микроглията в префронталния кортекс и субстанция нигра при болестта на Паркинсон [8]. Взети заедно, тези окуражаващи открития при човешки и животински модели силно предполагат микроглиални KV1.3 канали като терапевтична цел за намаляване на вредните възпалителни реакции в мозъка. Но как работят KV1.3 блокерите? Как блокирането на волтаж-зависим калиев канал в микроглията и вероятно също и в мозъчните инфилтриращи моноцитни макрофаги намалява производството на възпалителни цитокини и медиираното от възпаление тъканно увреждане?

Ефекти на KV1.3 блокерите върху функцията на микроглията

Доказано е, че култивирана неонатална микроглия на мишка и плъх, както и остро изолирана микроглия от мозък на мишка или тъканно отпечатана микроглия от мозък на плъх, експресират KV1.3 токове чрез пач-кламп на цели клетки, които се увеличават значително след in vitro стимулация или in vivo интрацеребровентрикуларна инжекция с TLR-4 лиганд липополизахарид (LPS) [14–18]. Стимулирането с компонента на грам-отрицателната клетъчна стена LPS се използва широко за индуциране на "класическо" активирано "M1-подобно" състояние на микроглия, симулиращо общо възпаление, което би било свързано с бактериална инфекция [19,20]. В областта на невроимунологията LPS стимулираната микроглия в идеалния случай трябва да се нарича M(LPS) микроглия въз основа на стимула, използван за предизвикване на поляризация, за да се избегне използването на терминологията M1/M2, която се счита за твърде опростена [21], но широко използвана поради терапевтичните си привлекателност.

След стимулация с LPS може да се наблюдава повишена експресия на KV1.3 на ниво иРНК и протеиново ниво чрез Western blotting, имунохистохимия и повишена плътност на тока, измерена чрез цяла клетка patch-clamp [15–18]. Подобно, но малко по-малко интензивно повишаване на експресията на Kv1.3 възниква, когато култивираната неонатална микроглия се стимулира с олигомерен амилоид- (АО) или -синуклеин [7,8], два протеина, които са неправилно нагънати и агрегирани при болестта на Алцхаймер или Паркинсон, и които често се използват за създаване на in vitro модел на реакции на микроглия, свързани със съответното заболяване.

В тези типове in vitro системи KV1.3 инхибирането или генетичната делеция намалява експресията и производството на множество възпалителни медиатори, измерени на 24- или 48- часа след активирането на микроглията. Преди около 20 години лабораторията на Lyanne Schlichter съобщи, че инхибиторите на KV1.3 потискат стимулираното от форболов естер респираторно взривяване [22] и производството на NO в култивирана микроглия на новородени плъхове, като по този начин намаляват медиираното от микроглия убиване на неврони в система за трансуелна култура [16].

В по-скорошно проучване от нашата лаборатория [17], което сравнява ефектите на блокерите на KV1.3 и KCa3.1 с широко използвания инхибитор на микроглия миноциклин върху диференциално поляризирана микроглия на новородени мишки, наблюдаваме, че инхибирането на Kv1.3 намалява експресията и производството на провъзпалителните цитокини IL-1 и TNF- на 24 и 28 часа и предотвратява регулирането нагоре на свързаните с възпалението ензими циклооксигеназа2 (COX-2) и индуцируема азотен оксид синтаза (iNOS). Последният ефект вероятно е отговорен за намаленото производство на NO, наблюдавано в микроглия, лекувана с KV1.3 инхибитори на 24 и 48 часа след LPS стимулация. Подобно на по-ранната работа, ние също наблюдавахме, че инхибиторите на KV1.3 предотвратяват медиираното от микроглия убиване на неврони в органотипни култури на хипокампални срезове 3 дни след активирането на микроглията или чрез 1-час хипоксия/гликемия за симулиране на исхемичен инсулт [5] или чрез лечение с олигомерен амилоид - за симулиране на активиране на микроглия при AD [7].

В допълнение към намаляването на индуцираното от АО активиране на микроглия, феномен, който може да бъде ясно показан чрез оцветяване на микроглия за CD11b или Iba-1 и оценка на интензитета на флуоресценция, KV1.3 инхибиторът PAP-1 също е установено, че предотвратява О-индуцирано, микроглия-медиирано увреждане на дългосрочно потенциране (LPT) в хипокампални срезове и за намаляване на О-индуцирано производство на IL-1, TNF- и NO в култивирана миша микроглия [7], много подобно до това, което беше открито за KV1.3 инхибитори с LPS стимулирана микроглия [17,18]. В експерименти, при които култивирана неонатална мишка микроглия от див тип и KV1.3−/- мишки се стимулира с агрегатен -синуклеин (SynAgg), който активира микроглията чрез свързване с рецепторите за разпознаване на образи TLR2 и CD36 [23], и двата фармакологични KV1. 3 инхибиране с PAP-1 и генетична делеция на канала доведе до намалено производство на IL-1, IL-6, IL-12 и TNF-продукция и предотврати NLRP3 възходяща регулация на възпалителния протеин на 24 часа след стимулация на микроглията [8]. Обратно, свръхекспресията на KV 1.3 в микроглиална клетъчна линия повишава индуцираната от SynAggin експресия или секреция на IL-1, TNF-, IL-6 и IL-12 24 часа след стимулация [8].

Различни проучвания от други групи потвърдиха, че KV1.3 блокерите намаляват провъзпалителните функции на микроглията, когато се използват подобни стимули или стимули, свързани с други възпалителни патологии. Например, в култивирана микроглия на плъх, активирана с HIV Tat протеин или с гликопротеин 120 (gp120) за симулиране на HIV1-свързано неврокогнитивно разстройство, беше установено, че KV1.3 инхибирането или нокдаунът с siRNA намалява IL-1 производство на TNF- и NO и потисната невротоксичност [24,25]. Използвайки модел на исхемичен инсулт и лишаване от кислород/глюкоза на култивирана микроглия Ma et al. съобщават, че инхибирането на KV1.3 измества фенотипа на микроглията от провъзпалителен M1-подобен на M2-подобен отговор и намалява NLRP3 инфламазомна активация [5,6], подобно на гореописаните проучвания в модели на болестта на Паркинсон [8].

Използвайки прясно изолирани CD11b плюс клетки, които се състоят както от макрофаги, инфилтриращи ЦНС, така и микроглия, резидентна в мозъка, от мозъците на мишки, които са били системно третирани с LPS в присъствието и отсъствието на KV1.3 блокиращия пептид ShK-223, Rangaraju и др. потвърди, че инхибирането на KV 1.3 намалява експресията на възпалителни цитокини като IL-1, но показа, че инхибирането на KV1.3 също намалява експресията на TAP1 и предотвратява регулирането нагоре на EHD1 в CD11b плюс CD45low микроглия, измерено чрез поточна цитометрия [26]. И TAP1, и EDH1 са протеини, които участват в сглобяването на MHC клас-I и трафика към клетъчната повърхност. След това авторите изследват след това ефекта от лечението с ShK-223 върху експресията на МНС клас-1 върху остро изолирана микроглия и, въз основа на намалената експресия на МНС, допускат, че индуцираното от LPS повишаване на антиген-представящия капацитет на микроглиите са зависими от KV 1.3-процеси, което предполага, че инхибирането на KV1.3 може да намали представянето на антиген към CD8 плюс цитотоксични Т клетки.

В последващ претеглен мрежов анализ на ко-експресия, приложен към набори от микроглиални транскриптомични данни от миши модели на невровъзпалителни и невродегенеративни заболявания, същата група идентифицира KV1.3 като част от провъзпалителна генна сигнатура, която също включва Tlr2, Ptgs2, Il12b, Il1b, CD44, NFκB, Stat1 и RelA [27]. Блокадата на KV1.3 със ShK-223 може да измести тази провъзпалителна сигнатура към такава с повишена експресия на противовъзпалителни гени в свързаната със заболяването микроглия. Това, което е интересно в този контекст, е, че инхибиторите на Kv1.3 са докладвани в други проучвания за допълнително увеличаване на миграцията на култивирана микроглия, стимулирана с противовъзпалителните цитокини IL-4 и IL-10 [28] и да не повлиява микроглиалната фагоцитоза на микрозърната [26] или дори да повишава фагоцитозата на амилоид- [7].

Взети заедно, следователно има достатъчно доказателства, че микроглията експресира KV1.3 и че KV1.3 блокерите потискат провъзпалителните, невротоксични функции на микроглията и дори могат да изместят микроглията към по-невропротективен фенотип. Тук се съсредоточихме най-вече върху обобщаването на данни, получени с култивирани микроглиални или срезови култури, тъй като в тези редукционистки системи няма съмнение, че нокаутът, нокдаунът или фармакологичната блокада оказват своя ефект директно чрез инхибиране на микроглиални KV1.3 канали, а не индиректно чрез засягане KV1.3 канали в Т клетки, В клетки, дендритни клетки или моноцити, които всички експресират KV1.3 [29] и по този начин могат да допринесат за in vivo ефектите на KV1.3 блокерите или констатациите, направени с KV1.3−/- мишки. Тук обаче бихме искали да отбележим, че в допълнение към многобройните проучвания, показващи експресия на KV1.3 върху микроглия при гризачи и хора чрез имунохистохимия, лабораторията Kettenmann и нашата група многократно са показали, че повишената експресия на KV1.3 върху активирана микроглия не е просто феномен на тъканна култура и че Kv1.3 токовете могат да бъдат записани от микроглия в остри срезове [30,31] и от остро изолирана микроглия от мозъци на 5xFAD мишки [7] или от инфарктната област след оклузия на средна церебрална артерия [5, 12], модел за исхемичен инсулт.

Сигнални пътища, засегнати от KV1.3 инхибиране или модулиране на Kv1.3 експресия

Проучванията, изследващи сигналните пътища (Фигура 1), които се повлияват от KV1.3 блокерите, за да предизвикат тези полезни намаления на провъзпалителните функции на микроглията 24 или 48 часа по-късно, са дали донякъде противоречиви резултати, което предполага, че ефектите на KV1.3 блокерите са зависими върху стимула и може би вида. Докато Fordyce et al. съобщава, че блокерите на KV1.3 не влияят на фосфорилирането на p38MAPK в микроглия на новородени плъхове, третирана с LPS [16], няколко други проучвания, използващи микроглия на мишка, са установили, че блокерите на KV1.3 силно намаляват фосфорилирането на p38MAPK, както и активирането на NF-κB след стимулация с LPS, AO, SynAgg или HIV-1 гликопротеин 120 [7,8,24]. В микроглиалната клетъчна линия също е показано, че BV2 KV1.3 регулира S727 фосфорилирането на STAT1 [26]. Интересното е, че независимо дали блокерите на KV1.3 инхибират транслокацията на NFAT, един от най-добре проучените ефекти на блокерите на KV1.3 в Т клетки [2,32,33] не е изследван досега в микроглия.

Увеличаването на експресията на KV1.3 след стимулиране на микроглия с LPS, AO или SynAgg изглежда включва много от същите сигнални каскади, които се влияят от инхибирането на KV1.3, а блокерите на KV1.3 обикновено предотвратяват увеличаването на експресията на Kv1.3. KV1.3 промоторът съдържа множество NF-κB и SP1 свързващи места и инхибитори на NF-κB или p38MAPK независимо намаляват стимулираната от SynAgg повишена регулация на Kv1.3 в микроглия [8], демонстрирайки, че както p38MAPK, така и класическият NF-κB път медиират транскрипционната регулация на KV1.3 (Фигура 1). Киназата Fyn от семейството Src работи нагоре по веригата на транскрипционния фактор NF-κB чрез регулиране на ядрената транслокация на неговия компонент p65 [34] и чрез фосфорилиране на PKC изоформата PKCδ. Саркар и др. съобщава, че нокаутът на Fyn намалява както LPS, така и индуцираните от SynAgg увеличения на KV1.3 текущата плътност в култивирана микроглия, ефект, който може да бъде имитиран чрез третиране на микроглия с Fyn инхибитор саракатиниб или чрез дефицит на PKCδ, което предполага, че сигнализирането на Fyn/PKCδ киназа cascade участва в медиирането на KV1.3 регулиране нагоре в отговор на възпалителни стимули [8]. Както е показано в анализ на Duolink за близост на лигиране, Fyn взаимодейства директно с Kv1.3 и фосфорилира канала при Y135, за да увеличи неговата активност.

Kv1.3 регулира потенциала на мембраната и се противопоставя на деполяризацията

Въпреки описаните по-горе добре документирани подобряващи ефекти на KV1.3 блокерите върху невровъзпалението in vivo и върху микроглиалните сигнални каскади и експресията и секрецията на възпалителни медиатори in vitro, основните молекулярни механизми за това как KV1.3 блокерите влияят на микроглиалните функции дълго време бяха неясни. Много изследователи, включително нашата лаборатория, просто предположиха, че KV1.3 изпълнява същата функция в микроглията, която изпълнява в Т клетките, а именно регулиране на мембранния потенциал и притока на калций [29,32,33].

В Т-клетките инхибирането на KV1.3 води до деполяризация на мембраната и намалява притока на калций през активирани с освобождаване на калций калциеви канали (CRAC) след стимулиране на Т-клетъчния рецептор [33,35,36]. Притокът на калций през CRAC каналите е критично необходим за дефосфорилиране и последваща ядрена транслокация на зависимия от калций/калмодулин транскрипционен фактор NFAT [29], който задейства транскрипцията на цитокина IL-2 [29,33]. IL-2 се освобождава от активираните Т клетки при синтез и стимулира клоналната експанзия на Т клетките по автокринен и паракринен начин. Чрез инхибиране на балансиращия изтичане на калий, който е необходим за поддържане на притока на калций през CRAC каналите, блокерите на KV1.3 нарушават активирането на Т клетките, предотвратяват дефосфорилирането на NFAT и ядрената транслокация [32], което води до намалена пролиферация на Т клетки и намалено производство и секреция на възпалителни цитокини след 48 часа [5,33,35,36].

Той обаче никога не е бил тестван в микроглия, която за разлика от Т клетките също експресира вътрешния токоизправител Kir2.1 [17,37,38] и двупорния калиев канал THIK-1 (K2P 13.1) [39], дали KV1.3 блокерите ще имат същите молекулярни ефекти или ако ролята на KV1.3 е поета от тези други калиеви канали. В скорошно проучване нашата група съответно разгледа този въпрос, като първо преразгледа фундаменталното значение на KV1.3 за поддържане на потенциала на мембраната в покой и устойчивост на деполяризация [40]. Както се очакваше, свръхекспресията на KV1.3 в СНО клетки понижи типично много деполяризирания потенциал на мембраната в покой на тези клетки от -20 mV до -50 mV, докато инхибирането на KV1.3 с ShK-223 деполяризирана микроглия, която по своята същност поддържа по-хиперполяризиран мембранен потенциал в покой, който в нашите ръце е средно около -90 mV в недиференцирана микроглия, предимно експресираща Kir2.1 и около -65 mV в LPS стимулирана микроглия, експресираща по-високи KV1.3 и по-ниски Kir2.1 плътности на тока [40].

Докато KV1.3 по този начин със сигурност допринася за регулиране на потенциала на мембраната в покой в ​​микроглията (Фигура 2), ние вярваме, че неговата по-важна роля и причината, поради която експресията на Kv1.3 се увеличава в активирана микроглия, е способността на канала да компенсира екстремни и продължителни мембранна деполяризация, която потенциално може да повлияе отрицателно на здравето и физиологията на микроглията, както се разкрива от настоящите експерименти с инжектиране. Докато токовите инжекции от 25 pA не са в състояние да деполяризират KV 1.3, експресираща микроглия над -30 mV в отсъствието на блокери, микроглиите, предварително третирани с KV 1.3 блокери, се деполяризират до потенциали от плюс 50 mV в отговор на същите 25 pA токови инжекции [40] , което предполага, че KV1.3 може да "захване" мембранния потенциал близо до потенциала на прага на активиране на канала, за да предотврати прекомерни мембранни деполяризации (Фигура 2).

Ситуацията във физиологията на микроглията, където този капацитет е важен, е когато микроглията е изложена на екстрацелуларен АТФ, сигнал за опасност, който може да достигне концентрации във високия микромоларен диапазон поради освобождаването на цитозолен АТФ от увредени неврони или АТФ, съдържащи синаптични везикули [41], които активират P2X рецепторни канали, водещи до интензивни деполяризации [42]. В нашите собствени ръце експериментите с настоящи скоби, проведени върху недиференцирана и LPS-стимулирана микроглия, показаха, че острата експозиция на 100 μM ATP, който от P2X рецепторите, експресирани в микроглията, активира предимно P2X4, води до по-изразени деполяризации в недиференцираната микроглия, въпреки тяхната по-голяма хиперполяризиран мембранен потенциал в покой, отколкото в KV1.3висока LPS-стимулирана микроглия, която не се деполяризира над -40 mV. KV1.3 блокерите нарушават тази способност да се противопоставят на ATP-индуцираните деполяризации и микроглията се деполяризира в тяхно присъствие [40].

KV1.3 модулира медиирания от P2X4 рецептор калциев приток в микроглия

Експериментите за изобразяване на калций разкриха, че тази способност на KV1.3 каналите да устояват на ATP-индуцираните P2X4- медиирани деполяризации подобрява навлизането на Ca2 плюс в микроглията чрез P2X4 рецептори, стимулирани със 100 μM ATP [40]. Например, ние наблюдавахме, че KV1.3 блокерите ShK-223 и PAP-1 намаляват ATP-индуцирания Ca2 плюс приток през P2X4 рецептори в LPS-диференцирана микроглия, която експресира висока KV1.3 плътност на тока, много повече по-силно, отколкото в нестимулираната микроглия, въпреки че LPS стимулацията регулира надолу експресията на P2X4 рецептор в култивирана микроглия. Обратно, блокадата на KV1.3 няма ефект върху ATP-индуцирани калциеви преходни процеси в IL-4 стимулирана микроглия, която експресира много ниски нива на KV1.3. Интересното е, че докато LPS също повишава KV1.3 и намалява експресията на P2X4 върху микроглия in vivo, експресията на KV1.3 и P2X4 се увеличава успоредно в условията на исхемичен инсулт, както е показано от нашата лаборатория върху остро изолирана микроглия от инфарктното мозъчно полукълбо на мишки подложени на исхемичен инсулт и от други групи върху микроглия на гризачи и хора чрез имунохистохимия или qPCR [5,12,43–46]. Това предполага, че след исхемичен инсулт KV1.3 може да регулира по-сложното пуринергично микроглиално калциево сигнализиране, инициирано от сигнала за опасност ATP, по-силно, отколкото in vitro. ATP и други невронни остатъци в инфарктната област на мозъка активират микроглия, която след това непрекъснато произвежда и освобождава повече възпалителни медиатори в рамките на 24 до 72 часа и по този начин уврежда и убива повече неврони в полусянката, което води до възпалително разширяване на инфаркта.

Повишената експресия на KV1.3, която се наблюдава върху микроглия в границата на инфаркта в рамките на 2-5 дни [5] вероятно позволява на активираната микроглия да поддържа по-силни калциеви сигнали чрез увеличения брой P2X4 рецептори и по този начин да произвежда повече възпалителни медиатори, увреждайки повече неврони и активиране на повече микроглия. Тази хипотеза би била в съответствие с констатацията, че KV1.3 блокерът PAP-1 намалява активирането на микроглията и мозъчните нива на IL-1 и IFN-, което води до приблизително 40 процента по-малки инфарктни зони и подобрен неврологичен дефицит резултати при миши и плъхови модели на исхемичен инсулт [5]. Чрез деполяризиране на микроглия Kv1.3 блокерите намаляват притока на калций през P2X4 рецептори, задействани от АТФ, освободен от увредени неврони, и по този начин потискат допълнително калциево-зависимото активиране на NLRP3 инфламазома, NF-κB и други транскрипционни фактори, водещи до намалено производство на възпалителни медиатори (Фигура 1) и намалена патология.

Какви други пътища на приток на калций в микроглията се регулират от KV1.3?

Докато KV1.3 блокадата ясно намалява ATP-индуцирания приток на калций през P2X4 рецептори [40] и по този начин представлява важен регулатор на този път на приток на калций в микроглията (Фигура 2), това не е единственото KV1.3 или ATP-зависимо калциево сигнализиране процес в микроглията. В допълнение към P2X рецепторните канали, микроглията също експресира метаботропни P2Y пуринергични рецептори, които след активиране от ATP или UTP могат да индуцират освобождаване на калций от вътрешните депа [47] и да активират Ca2 plus вход, управляван от магазина (SOCE) след изчерпване на относително малки вътреклетъчни депа на калций в микроглия [38]. Следователно със сигурност е възможно допълнителен SOCE да е допринесъл за ATP-индуцираните Ca2 плюс сигнали, които изобразихме, и че някои от блокерните ефекти на KV1.3 са били медиирани чрез допълнително намаляване на SOCE.

Това е много вероятна хипотеза, тъй като "класическият" молекулярен механизъм за KV1.3 блокерите в Т клетките е намаляването на SOCE през CRAC канали след активиране на Т клетъчния рецептор и впоследствие намалено активиране на транскрипционен фактор и производство и освобождаване на цитокини [29,33, 36,48]. Многократно се съобщава, че микроглиите на плъхове и мишки показват токове с биофизични свойства, типични за CRAC токове [49,50] и експресират молекулярните компоненти на CRAC канали, Orai и STIM [51,52]. Освен това има доказателства, че генетичната делеция на Orai1, STIM1 и STIM2 намалява CRAC тока и/или SOCE и инхибира миграцията и фагоцитозата в култивирана миша микроглия [52], докато малката молекула CRAC канален блокер CM-EX-137 има наскоро беше съобщено, че намалява активирането на микроглията и размера на лезията в миши модел на травматично мозъчно увреждане [53].

Блокирането на KV1.3 каналите отслабва навлизането на калций в магазините в LPS-стимулираната микроглия

Като последващ експеримент на нашата предишна статия за ролята на KV1.3 в регулирането на медиирания от P2X4 приток на калций, ние тук конкретно зададохме въпроса дали KV1.3 блокерът ShK-223 също би намалил SOCE в LPS диференцирана микроглия , същото условие на стимулация, при което наблюдавахме най-високите KV1.3 плътности на тока и най-големите ефекти на инхибирането на KV1.3 върху ATP индуцираното калциево сигнализиране [40]. Използвайки съотношителния калциев индикатор Fura-2 за проследяване на промените в свободната вътреклетъчна концентрация на калций ([Ca2 плюс ]i), открихме, че LPS диференцираната микроглия има цитозолна концентрация на калций в покой [Ca2 плюс ] I, която варира между 60 nM и 370 nM, средно 150 ± 8,8 nM (n=50; Фигура 3a,c,g), което е в съответствие с предишен доклад [54]. За да се предизвика SOCE, вътреклетъчните запаси от калций първо бяха изчерпани с тапсигаргин (Tg), блокер на ендоплазмения ретикулум Ca2 плюс -ATPase, приложен в номинално свободен от Ca2 плюс разтвор за баня.

Removal of extracellular calcium produced a roughly 25 nM decrease in [Ca2+] I (Figure 3a) indicating the presence of a calcium influx at rest. Subsequent application of Tg (1 μM) elicited small amplitude (>25 nM) асинхронни повишения на [Ca2 плюс ] I поради пасивно мобилизиране на калций от запасите. Повторното добавяне на калций в разтвора за баня предизвиква бързо повишаване на [Ca2 плюс] I над нивата на покой, причинено от SOCE. Големината на индуцираните от SOCE [Ca2 плюс ] I преходни процеси ("пик SOCE"), измерена като разликата между нивото на [Ca2 плюс ] I в разтвора за вана без Ca2 плюс и максималното [Ca2 плюс ] I повишение след повторно добавяне на калций, варира значително сред отделните клетки с пиково разпределение на SOCE, показващо максимум при 120 nM и опашка до 1800 nM (Фигура 1b). Тази хетерогенност в силата на SOCE вероятно е причинена от вариации в потенциала на мембраната в покой, който осигурява движещата сила за навлизане на калций по време на SOCE. Установено е, че мембранният потенциал на покой на LPS-диференцирана микроглия варира между -90 mV и -40 mV в отделните клетки [40,55] и по този начин може да обясни наблюдаваните разлики в SOCE.

Предишно проучване съобщава, че повишаването на [Ca2 плюс] I в покой е свързано с намалена способност на външни стимули като агониста на P2Y рецептора UTP или фактор на комплемента 5а да предизвикат [Ca2 плюс] I преходни процеси в LPS-активирана микроглия [54]. Тъй като в нашето проучване както нивата на [Ca2 плюс]i в покой, така и пиковите стойности на SOCE варират между отделните клетки, ние проучихме дали вариацията в [Ca2 плюс]i в покой може да обясни хетерогенността в пиковите стойности на SOCE. Начертаването на пиковите стойности на SOCE спрямо покой [Ca2 плюс ] I разкрива положителна корелация между пика SOCE и покой [Ca2 плюс ] I (Фигура 3в). Когато разделим данните на две групи с гранична стойност от 600 nM за пиков SOCE, връзките между покой [Ca2 плюс ] I и пиков SOCE във всяка група бяха по-силни, отколкото в цялата популация, което показва наличието на поне две клетки популации, които се различават както по величината на SOCE, така и по силата на корелация между покой [Ca2 плюс ] I и пиковия SOCE. По този начин, в рамките на популацията от клетки, третирани с LPS, повишаването на [Ca2 плюс ]i в покой не е причинно свързано с намалената способност на активираната микроглия да реагира на външни стимули с [Ca 2 плюс] I преходен процес, както беше предложено по-рано от Hoffman et al. Нашите данни предполагат, че общо влияние, като нивото на мембранния потенциал, което се контролира от различни канали, включително KV1.3, Kir2.1 и THIK-1, може да е отговорно за положителната корелация между покой [Ca2 плюс ] I и пиков SOCE, наблюдавани в нашето проучване. Например свръхекспресията или функционалната регулация на хиперполяризиращи канали може да хиперполяризира мембраната и да увеличи движещата сила както за навлизането на калций чрез конститутивно активни канали, пропускливи за калций, като канали с метаболитно активиран преходен рецепторен потенциал (TRP), така и канали, управлявани от магазина, активирани след изчерпване на запаса като CRAC канали.

Pre-incubation of cells with the KV1.3 inhibitor ShK-223 did not significantly affect resting [Ca2+] I (Figure 3d,g), but eliminated peak SOCE responses larger than 300 nM and shifted the maximum of the distribution of peak SOCE values from 130 nM (Figure 3b, control) to 70 nM (Figure 3e, ShK223). The difference between the values of peak SOCE in control cells and cells preincubated with ShK-223 was significant (Figure 3h). The relationship between resting [Ca2+] I and peak SOCE still displayed a mild positive correlation (figure 3f). Taken together, our data indicate that similarly to T lymphocytes, blockade of KV1.3 channels significantly reduces SOCE in LPS differentiated microglia. The extent of the inhibition varied among cells with a greater effect on cells expressing large magnitude (>300 nM) SOCE. Специфичните характеристики на клетките с висок и нисък пик на SOCE остават да бъдат определени.

При физиологични условия, SOCE може да бъде задействан впоследствие, за да изчерпи запасите след активиране на свързани с G-протеин P2Y рецептори и допринася за комбинираното повишаване на [Ca2 плюс] I по време на активирането на P2Y и P2X рецепторите, предизвикано от обикновени пуринергични агонисти, като ATP. Големината на SOCE варира значително между LPS диференцираните клетки, което може да е функция на уникалната комбинация от диференциална експресия на канали, управлявани от магазина, и канали, контролиращи мембранния потенциал, като KV1.3. Намаляването на пика на SOCE от ShK-223 показва, че KV1.3 каналите са мощни регулатори на SOCE и разкриват допълнителен механизъм, чрез който KV1.3 блокерите отслабват калциевото сигнализиране и последващите функционални отговори (напр. производство на цитокини) след калций-зависима транскрипция активиране на фактор в микроглия.

Изводи

Въпреки че със сигурност е предизвикателство да се сортират ефектите от приноса върху клетките на периферната имунна система, особено върху Т-клетките на паметта и макрофагите, получени от моноцити, за благоприятните ефекти на KV1.3 блокерите върху възпалението в ЦНС, това е ясно, че KV1.3 играе важна роля в регулирането на мембранния потенциал, предотвратяване на деполяризация и контролиране на калциеви сигнални събития, които впоследствие водят до активиране на микроглия и производство на възпалителен медиатор. Бихме искали да предположим, че от терапевтична гледна точка вероятно е желателно да се инхибира KV1.3 в множество типове клетки на имунната система. Въпреки това би било интелектуално много удовлетворяващо и полезно за развитието на терапията да се изясни каква е основната клетъчна цел на инхибиторите на KV1.3 и дали терапевтиците трябва да проникват в мозъка, за да упражняват оптимални подобряващи ефекти при заболявания на ЦНС. Тези въпроси в идеалния случай трябва да бъдат решени фармакологично чрез тестване на проникващи в мозъка малки молекули рамо до рамо с периферно ограничени пептидни KV1.3 инхибитори или анти-KV1.3 антитела [58,59] в животински модели на болестта на Алцхаймер и Паркинсон. Освен това би било изключително информативно да се сравнят ефектите от условната делеция на KV1.3 в микроглия, макрофаги, получени от моноцити, и различни Т-клетъчни подгрупи с ефектите от лечението с лекарства, за да се получи по-подробно разбиране на ролята на KV1.3 в невровъзпалението и клетъчната мишена на KV1.3 инхибиторите. Въпреки това, ние вярваме, че на клетъчно ниво основната роля на KV1.3 винаги ще бъде това, което е описано за първи път в Т клетките, а именно регулиране на мембранния потенциал и приток на калций и последващо активиране на калций-зависими транскрипционни фактори. Това, което понякога не се подчертава достатъчно в това отношение, вероятно е, че биофизичните свойства на KV1.3, като напрежението му на полуактивиране и относително бавното му инактивиране [60,61], перфектно „квалифицират“ канала да устои на мембранните деполяризации и по този начин дават възможност на KV1 .3 не само да регулира SOCE, както беше описано преди 30 години в Т клетките, но и P2X рецептор-медиирания приток на калций.

Декларация за разкриване

Авторите не съобщават за потенциален конфликт на интереси.

Финансиране

Тази работа беше подкрепена от награда NS100294 на Националния институт по неврологични заболявания и инсулт (към HW) и грант за изследователско партньорство на UC Davis School of Medicine (към AFF).

Препратки

[1] DeCoursey TE, Chandy KG, Gupta S, et al. Зависими от напрежение К плюс канали в човешки Т лимфоцити: роля в митогенезата? Природата. 1984; 307 (5950): 465–468.

[2] Beeton C, Wulff H, Standifer NE, et al. Kv1.3 каналите са терапевтична цел за автоимунни заболявания, медиирани от Т клетки. Proc Natl Acad Sci САЩ. 2006; 103 (46): 17414–17419.

[3] Tarcha EJ, Chi V, Munoz-Elias EJ и др. Трайни фармакологични реакции от пептида ShK-186, специфичен инхибитор на Kv1.3 канал, който потиска Т клетъчните медиатори на автоимунно заболяване. J Pharmacol Exp Ther. 2012; 342 (3): 642–653.

[4] Chandy KG, Norton RS. Пептидни блокери на Kv1.3 канали в Т клетки като терапевтични средства за автоимунно заболяване. Curr Opin Chem Biol. 2017; 38: 97-107.

[5] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I, et al. Инхибирането на калиевия канал Kv1.3 намалява инфаркта и възпалението при исхемичен инсулт. Ann Clin Transl Neurol. 2018; 5 (2): 147–161.

[6] Ma DC, Zhang NN, Zhang YN и др. Блокадата на Kv1.3 канал облекчава церебрална исхемия/реперфузионно увреждане чрез преоформяне на M1/M2 фенотипове и компрометиране на активирането на NLRP3 инфламазома в микроглия. Exp Neurol. 2020;332:113399.

[7] Maezawa I, Nguyen HM, Di Lucente J, et al. Инхибирането на Kv1.3 като потенциална насочена към микроглия терапия за болестта на Алцхаймер: предклинично доказателство на концепцията. мозък. 2018; 141 (2): 596–612.

[8] Sarkar S, Nguyen HM, Malovic E, et al. Kv1.3 модулира невровъзпалението и невродегенерацията при болестта на Паркинсон. J Clin Invest. 2020; 130 (8): 4195–4212.

[9] Reeves TM, Trimmer PA, Colley BS, et al. Насочване към Kv1.3 канали за намаляване на патологията на бялото вещество след травматично мозъчно увреждане. Exp Neurol. 2016; 283 (PtA): 188–203.

[10] Lai IK, Valdearcos M, Morioka K, et al. Блокирането на Kv1.3 калиеви канали предотвратява постоперативно невровъзпаление и когнитивен спад, без да уврежда зарастването на рани при мишки. Br J Anaesth. 2020; 125 (3): 298–307.

[11] Peng Y, Lu K, Li Z, et al. Блокирането на Kv1.3 каналите подобрява радиационно-индуцираното мозъчно увреждане. Невро Онкол. 2014; 16 (4): 528–539.

[12] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I, et al. Калиевият канал KCa3.1 представлява фармакологична цел за невровъзпаление, свързано с исхемичен/реперфузионен инсулт. J Cereb Blood Flow Metab. 2016; 36 (12): 2146–2161.

[13] Rangaraju S, Gearing M, Jin LW, et al. Калиевият канал Kv1.3 е силно експресиран от микроглията при болестта на Алцхаймер при хора. J Alzheimers Dis. 2015; 44 (3): 797–808.

[14] Norenberg W, Gebicke-Haerter PJ, Illes P. Възпалителните стимули индуцират нов К плюс изходящ ток в култивирана микроглия на плъх. Neurosci Lett. 1992; 147 (2): 171–174.

[15] Kotecha SA, Schlichter LC. Превключване от Kv1.5 към Kv1.3 в ендогенна хипокампална микроглия и роля в пролиферацията. J Neurosci. 1999; 19 (24): 10680–10693. [16] Fordyce CB, Jagasia R, Zhu X, et al. Каналите на Microglia Kv1.3 допринасят за способността им да убиват неврони. J Neurosci. 2005; 25 (31): 7139–7149.

[17] Nguyen HM, Grossinger EM, Horiuchi M, et al. Диференциална Kv1.3, KCa3.1 и Kir2.1 експресия в "класически" и "алтернативно" активирана микроглия. Глия. 2017; 65 (1): 106–121.

For more information:1950477648nn@gmail.com